Cell-Free DNA Integrity Analysis in de urine monsters
Summary
A method for analyzing DNA integrity in the cell-free supernatant fraction of urine samples is proposed. The method is suitable for early detection of urological malignancies and has proven accurate for the early diagnosis of bladder cancer.
Abstract
Hoewel de aanwezigheid van circulerend celvrij DNA in plasma of serum is op grote schaal aangetoond dat een geschikte bron van biomarkers voor vele vormen van kanker zijn er weinig studies gericht op het mogelijke gebruik van urine celvrij (UCF) DNA. Uitgaande van de hypothese dat de normale apoptotische cellen sterk gefragmenteerd DNA en dat kankercellen vrijgave langer DNA, de mogelijke rol van DNA integriteit UCF beoordeeld als vroege diagnostische merker kan onderscheiden tussen patiënten met prostaatkanker of blaaskanker en gezonde individuen.
Een UCF DNA integriteit analyse is voorgesteld op basis van vier kwantitatieve real-time PCR van vier sequenties langer dan 250 bp: c-MYC, BCAS1, HER2 en AR. Sequenties die vaak een groter aantal DNA-kopieën in de blaas en prostaat kanker werden voor de analyse, maar de werkwijze is flexibel, en deze genen kunnen worden vervangen door andere genen van interest. De potentiële bruikbaarheid van UCF DNA als bron van biomarkers reeds aangetoond voor urologische maligniteiten, aldus de weg voor verdere studies UCF DNA typering bestrating. UCF DNA integriteit test het voordeel dat niet-invasief, snel en gemakkelijk uit te voeren met slechts een paar milliliter urine nodig de analyse worden uitgevoerd.
Introduction
Celvrij DNA in bloed en urine door celdood gedetecteerd door apoptotische of necrotische mechanismen. Celvrij DNA in bloed is uitgebreid bestudeerd voor diagnostische en prognostische doeleinden bij verschillende ziekten, met name kanker 1. Maar minder bekend is over de rol van urine-cel-vrij (UCF) DNA. UCF DNA kan afkomstig zijn van bloed dat door de glomerulaire filtratie systeem of uit cellen die direct in contact komen met de lichaamsvloeistof 2 (bijvoorbeeld urotheelcellen of prostaatcellen). Het gebruik van UCF DNA als bron van biomarkers is hoofdzakelijk onderzocht voor de vroege diagnose van nier, blaas en prostaat kanker door het hoge percentage UCF DNA rechtstreeks uit urinewegen cellen 3,4.
Weinig bekend over UCF DNA en de beste methoden voor het isoleren en karakteriseren van het. Aangezien de hypothese dat tumorcellen vrijkomen langer DNA-fragmenten dan normale cellen, de evaluatiecelvrij DNA integriteit is onderzocht in een poging om de oorsprong van DNA ophelderen in de bloedsomloop 5. Sommige studies hebben aangetoond dat celvrij DNA integriteit in bloed vormt een goede diagnostische test voor vele soorten kanker 6, en dezelfde hypothese is die met betrekking tot urine 7-9.
Dit artikel beschrijft een nieuwe werkwijze voor UCF DNA integriteit analyse met een mogelijke toepassing van de blaas en prostaat kanker detectie. Vooral de integriteit van UCF DNA fragmenten meer dan 250 bp werd getest in 4 regio's waarin een hoger aantal DNA-kopieën in vaste tumoren, zoals prostaat- en blaaskanker: c-MYC (8q24.21), HER2 (17q12.1 ) BCAS1 (20q13.2), en AR (Xq12) 10-14. Specifieke oncogenen, plaats willekeurige sequenties werden gekozen om de kans op het vinden van hen in het celvrije fractie van kankerpatiënten te verhogen. Een van de belangrijkste voordelen vandeze methode is dat het flexibel is en dat andere gebieden kunnen ook worden geselecteerd op basis van het type tumor en kenmerken.
Protocol
Representative Results
Discussion
UCF DNA integriteit analyse is een nieuwe, niet-invasieve werkwijze voor het bepalen van DNA integriteit in urine. Het werd onlangs voorgesteld voor de vroege diagnose van de blaas 9 en prostaatkanker 7,8. Een aantal van de voor- en nadelen van de UCF DNA betrouwbaarheidstoetsing komen hier aan bod, samen met toekomstperspectief.
Het belangrijkste voordeel van de benadering is dat het een goedkope, niet-invasieve werkwijze en een eenvoudig protocol om urine te onderzoek…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Gráinne Tierney and Silvia Bellissimo for their editorial assistance.
Materials
| QIAamp DNA Mini Kit |
Qiagen | 51304 | |
| iQ SYBR Green Supermix, 100 x 50 µl rxns, 2.5 ml (2 x 1.25 ml) | Biorad | 1708880 | |
| IDT custom DNA oligos | IDT | HPLC purification, 100nMole DNA oligo | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | Other spectrophotometric methods could also be used to quantify DNA | |
| Rotor-Gene 6000 | Corbett | Another Real Time PCR instrument could also be used | |
| microcentrifuge | |||
| one centrifuge for 50 ml tubes | |||
| incubator | |||
| -80°C freezer | |||
| -20°C freezer | |||
| 10 ul pipette | |||
| 20 ul pipette | |||
| 200 ul pipette | |||
| 1000 ul pipette | |||
| pipette tips (10;20;200;1000) | |||
| 1,5 ml tubes | |||
| 50ml tubes | |||
| 15 ml tubes | |||
| Rotor-Disc 72 Rotor | Corbett | 9018899 | |
| Strip Tubes and Caps, 0.1 ml (250) | Qiagen | 981103 | |
| Collection Tubes (2 ml) | Qiagen | 19201 | |
| Buffer AL (264 ml) | Qiagen | 19075 | |
| Proteinase K (10ml) | Qiagen | 19133 |
References
- Francis, G., Stein, S. Circulating Cell-Free Tumour DNA in the Management of Cancer. Int.J.Mol.Sci. 16 (6), 14122-14142 (2015).
- Bryzgunova, O. E., Laktionov, P. P. Extracellular Nucleic Acids in Urine: Sources, Structure, Diagnostic Potential. Acta Naturae. 7 (3), 48-54 (2015).
- Szarvas, T., et al. Deletion analysis of tumor and urinary DNA to detect bladder cancer: urine supernatant versus urine sediment. Oncol.Rep. 18 (2), 405-409 (2007).
- Togneri, F. S., et al. Genomic complexity of urothelial bladder cancer revealed in urinary cfDNA. Eur.J.Hum.Genet. , (2016).
- Zonta, E., Nizard, P., Taly, V. Assessment of DNA Integrity, Applications for Cancer Research. Adv.Clin.Chem. 70, 197-246 (2015).
- Hao, T. B., et al. Circulating cell-free DNA in serum as a biomarker for diagnosis and prognostic prediction of colorectal cancer. Br.J.Cancer. 111 (8), 1482-1489 (2014).
- Salvi, S., et al. Urine Cell-Free DNA Integrity Analysis for Early Detection of Prostate Cancer Patients. Dis.Markers. 2015, 574120 (2015).
- Casadio, V., et al. Urine cell-free DNA integrity as a marker for early prostate cancer diagnosis: a pilot study. Biomed.Res.Int. 2013, 270457 (2013).
- Casadio, V., et al. Urine cell-free DNA integrity as a marker for early bladder cancer diagnosis: preliminary data. Urol.Oncol. 31 (8), 1744-1750 (2013).
- Salvi, S., et al. Circulating cell-free AR and CYP17A1 copy number variations may associate with outcome of metastatic castration-resistant prostate cancer patients treated with abiraterone. Br.J.Cancer. 112 (10), 1717-1724 (2015).
- Ishkanian, A. S., et al. High-resolution array CGH identifies novel regions of genomic alteration in intermediate-risk prostate cancer. Prostate. 69 (10), 1091-1100 (2009).
- Oxley, J. D., Winkler, M. H., Gillatt, D. A., Peat, D. S. Her-2/neu oncogene amplification in clinically localised prostate cancer. J.Clin.Patho. 55 (2), 118-120 (2002).
- Nord, H., et al. Focal amplifications are associated with high grade and recurrences in stage Ta bladder carcinoma. Int.J.Cancer. 126 (6), 1390-1402 (2010).
- Tabach, Y., et al. Amplification of the 20q chromosomal arm occurs early in tumorigenic transformation and may initiate cancer. PLoS One. 6 (1), e14632 (2011).
