Бесклеточных ДНК Integrity Анализ проб мочи в
Summary
A method for analyzing DNA integrity in the cell-free supernatant fraction of urine samples is proposed. The method is suitable for early detection of urological malignancies and has proven accurate for the early diagnosis of bladder cancer.
Abstract
Хотя присутствие циркулирующих ДНК клеток, свободных в плазме или сыворотке крови было широко показано, что подходящим источником биомаркеров для многих видов рака, некоторые исследования были сосредоточены на потенциальном использовании бесклеточной (УКУ) ДНК мочи. Исходя из гипотезы, что нормальные клетки производят апоптотических высоко фрагментированной ДНК и что раковые клетки выделяют больше ДНК, потенциальная роль целостности ДНК UCF оценивали в качестве раннего диагностического маркера, способного различать между пациентами с простаты или рака мочевого пузыря и здоровых людей.
Анализ по UCF ДНК целостности предлагается на основе четырех количественных реального времени ДЗП четырех последовательностей длиной более 250 п.н.: с-Мус, BCAS1, HER2 и Аr. Последовательности, которые часто имеют повышенное число копий ДНК, в мочевом пузыре и рака простаты были выбраны для анализа, но этот метод является гибким, и эти гены могут быть заменены другими генами Inteотдых. Потенциальной полезности UCF ДНК в качестве источника биомаркеров уже была продемонстрирована для урологических злокачественных опухолей, тем самым проложив путь для дальнейших исследований по характеристике UCF ДНК. Тест целостности ДНК UCF имеет преимущество быть неинвазивным, быстрым и легко выполнить, только несколько миллилитров мочи, необходимых для проведения анализа.
Introduction
Внеклеточный ДНК может быть обнаружен в крови и моче из-за гибели клеток путем апоптоза или некроза механизмов. Внеклеточный ДНК в крови широко изучены для диагностических и прогностических целях при различных заболеваниях, особенно рака 1. Тем не менее, меньше известно о роли мочевой бесклеточной (УКУ) ДНК. UCF ДНК может происходить от прохождения крови через клубочковой фильтрационной системы или из клеток , которые поступают непосредственно в контакт с этим телом жидкости 2 (например, уротелиальных клеток или клеток предстательной железы). Использование ДНК UCF в качестве источника биомаркеров в основном было исследовано для ранней диагностики почек, мочевого пузыря и рака предстательной железы в связи с высоким процентом UCF ДНК , приходящие непосредственно из клеток мочевого тракта 3,4.
Мало что известно о UCF ДНК и лучшие методы выделения и характеризующие его. Учитывая гипотезу, что опухолевые клетки высвобождают более длинных фрагментов ДНК, чем нормальные клетки, оценкацелостности ДНК бесклеточной изучена в попытке выяснения происхождения ДНК в кровотоке 5. Некоторые исследования показали , что целостность ДНК бесклеточного в крови представляет собой хороший диагностический тест для многих видов рака 6, и та же гипотеза была предложена в связи с мочой 7-9.
В данной статье описывается новый метод анализа целостности UCF ДНК с точки зрения возможного применения обнаружения рака мочевого пузыря и простаты. В частности, целостность UCF фрагментов ДНК больше , чем 250 пар оснований был испытан в 4 -х регионах , известно, что увеличение числа копий ДНК в солидных опухолей, в том числе рака простаты и мочевого пузыря: с-Мус (8q24.21), HER2 (17q12.1 ), BCAS1 (20q13.2) и AR (Xq12) 10-14. Конкретные онкогенов, а не случайные последовательности, были выбраны, чтобы увеличить вероятность нахождения их в бесклеточной фракции онкологических больных. Одним из основных преимуществэтот метод является то, что он является гибким и что другие регионы также могут быть выбраны на основе типа опухоли и характеристик.
Protocol
Representative Results
Discussion
анализ целостности ДНК UCF представляет собой новый, неинвазивный метод оценки целостности ДНК в моче. В последнее время было предложено для ранней диагностики мочевого пузыря 9 и рака простаты 7,8. Ряд преимуществ и недостатков теста целостности UCF ДНК обсуждаются здесь, вмес…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Gráinne Tierney and Silvia Bellissimo for their editorial assistance.
Materials
| QIAamp DNA Mini Kit |
Qiagen | 51304 | |
| iQ SYBR Green Supermix, 100 x 50 µl rxns, 2.5 ml (2 x 1.25 ml) | Biorad | 1708880 | |
| IDT custom DNA oligos | IDT | HPLC purification, 100nMole DNA oligo | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | Other spectrophotometric methods could also be used to quantify DNA | |
| Rotor-Gene 6000 | Corbett | Another Real Time PCR instrument could also be used | |
| microcentrifuge | |||
| one centrifuge for 50 ml tubes | |||
| incubator | |||
| -80°C freezer | |||
| -20°C freezer | |||
| 10 ul pipette | |||
| 20 ul pipette | |||
| 200 ul pipette | |||
| 1000 ul pipette | |||
| pipette tips (10;20;200;1000) | |||
| 1,5 ml tubes | |||
| 50ml tubes | |||
| 15 ml tubes | |||
| Rotor-Disc 72 Rotor | Corbett | 9018899 | |
| Strip Tubes and Caps, 0.1 ml (250) | Qiagen | 981103 | |
| Collection Tubes (2 ml) | Qiagen | 19201 | |
| Buffer AL (264 ml) | Qiagen | 19075 | |
| Proteinase K (10ml) | Qiagen | 19133 |
References
- Francis, G., Stein, S. Circulating Cell-Free Tumour DNA in the Management of Cancer. Int.J.Mol.Sci. 16 (6), 14122-14142 (2015).
- Bryzgunova, O. E., Laktionov, P. P. Extracellular Nucleic Acids in Urine: Sources, Structure, Diagnostic Potential. Acta Naturae. 7 (3), 48-54 (2015).
- Szarvas, T., et al. Deletion analysis of tumor and urinary DNA to detect bladder cancer: urine supernatant versus urine sediment. Oncol.Rep. 18 (2), 405-409 (2007).
- Togneri, F. S., et al. Genomic complexity of urothelial bladder cancer revealed in urinary cfDNA. Eur.J.Hum.Genet. , (2016).
- Zonta, E., Nizard, P., Taly, V. Assessment of DNA Integrity, Applications for Cancer Research. Adv.Clin.Chem. 70, 197-246 (2015).
- Hao, T. B., et al. Circulating cell-free DNA in serum as a biomarker for diagnosis and prognostic prediction of colorectal cancer. Br.J.Cancer. 111 (8), 1482-1489 (2014).
- Salvi, S., et al. Urine Cell-Free DNA Integrity Analysis for Early Detection of Prostate Cancer Patients. Dis.Markers. 2015, 574120 (2015).
- Casadio, V., et al. Urine cell-free DNA integrity as a marker for early prostate cancer diagnosis: a pilot study. Biomed.Res.Int. 2013, 270457 (2013).
- Casadio, V., et al. Urine cell-free DNA integrity as a marker for early bladder cancer diagnosis: preliminary data. Urol.Oncol. 31 (8), 1744-1750 (2013).
- Salvi, S., et al. Circulating cell-free AR and CYP17A1 copy number variations may associate with outcome of metastatic castration-resistant prostate cancer patients treated with abiraterone. Br.J.Cancer. 112 (10), 1717-1724 (2015).
- Ishkanian, A. S., et al. High-resolution array CGH identifies novel regions of genomic alteration in intermediate-risk prostate cancer. Prostate. 69 (10), 1091-1100 (2009).
- Oxley, J. D., Winkler, M. H., Gillatt, D. A., Peat, D. S. Her-2/neu oncogene amplification in clinically localised prostate cancer. J.Clin.Patho. 55 (2), 118-120 (2002).
- Nord, H., et al. Focal amplifications are associated with high grade and recurrences in stage Ta bladder carcinoma. Int.J.Cancer. 126 (6), 1390-1402 (2010).
- Tabach, Y., et al. Amplification of the 20q chromosomal arm occurs early in tumorigenic transformation and may initiate cancer. PLoS One. 6 (1), e14632 (2011).
