Cell-libero DNA analisi di integrità nei campioni di urina
Summary
A method for analyzing DNA integrity in the cell-free supernatant fraction of urine samples is proposed. The method is suitable for early detection of urological malignancies and has proven accurate for the early diagnosis of bladder cancer.
Abstract
Anche se la presenza di circolante DNA libero-cellule nel plasma o nel siero è stato ampiamente dimostrato di essere una fonte adeguata di biomarcatori per molti tipi di cancro, alcuni studi si sono concentrati sul potenziale utilizzo del DNA dell'urina cell-free (UCF). A partire dalle ipotesi che le normali cellule apoptotiche producono DNA molto frammentato e che le cellule tumorali rilasciare più il DNA, il ruolo potenziale di integrità del DNA UCF è stata valutata come un marker diagnostico precoce in grado di distinguere tra i pazienti con prostata o il cancro della vescica e individui sani.
Un'analisi integrità UCF DNA viene proposta sulla base di quattro PCR quantitativa in tempo reale su quattro sequenze più lunghe di 250 bp: c-MYC, BCAS1, HER2, e AR. Sequenze che hanno spesso un aumento del numero di copie di DNA nei tumori della vescica e della prostata sono stati scelti per l'analisi, ma il metodo è flessibile, e questi geni potrebbero essere sostituiti con altri geni di interiposo. Il potenziale utilità di UCF DNA come fonte di biomarcatori è già stata dimostrata per neoplasie urologiche, aprendo così la strada a ulteriori studi sulla caratterizzazione UCF DNA. Il test di integrità del DNA UCF ha il vantaggio di essere non invasiva, rapida e facile da eseguire, con pochi millilitri di urina necessari per effettuare l'analisi.
Introduction
-Free Cell DNA può essere rilevato nel sangue e nelle urine causa di morte cellulare da meccanismi apoptotici o necrotiche. DNA libero-Cell nel sangue è stata ampiamente studiata per scopi diagnostici e prognostici in varie malattie, in particolare il cancro 1. Tuttavia, meno si sa circa il ruolo del DNA urinario cell-free (UCF). UCF DNA può provenire da passaggio di sangue attraverso il sistema di filtrazione glomerulare o da cellule che entrano direttamente in contatto con questo corpo fluido 2 (ad esempio, cellule uroteliali o cellule prostatiche). L'uso di UCF DNA come fonte di biomarker è stato principalmente studiato per la diagnosi precoce di renale, della vescica, della prostata e cancro a causa dell'elevata percentuale di UCF DNA proveniente direttamente dalle cellule del tratto urinario 3,4.
Poco si sa circa UCF DNA ed i migliori metodi per isolare e caratterizzare esso. Dato l'ipotesi che le cellule tumorali rilasciano frammenti di DNA più lunghi rispetto alle cellule normali, la valutazionedell'integrità DNA cell-free è stato studiato in un tentativo di chiarire l'origine del DNA nella circolazione sanguigna 5. Alcuni studi hanno dimostrato che cell-free integrità del DNA nel sangue rappresenta un buon test diagnostico per molti tipi di cancro 6, e la stessa ipotesi è stata proposta in relazione agli urine 7-9.
Questo documento descrive un nuovo metodo per UCF DNA analisi di integrità di una potenziale applicazione per il rilevamento del cancro della vescica e della prostata. In particolare, l'integrità del DNA UCF frammenti più di 250 bp è stato testato in 4 regioni note per avere un maggior numero di copie di DNA nei tumori solidi, tra cui la prostata e tumore della vescica: c-Myc (8q24.21), HER2 (17q12.1 ), BCAS1 (20q13.2), e AR (Xq12) 10-14. oncogeni specifici, piuttosto che sequenze casuali, sono stati scelti per aumentare la probabilità di trovarle frazione priva di cellule di pazienti affetti da cancro. Uno dei principali vantaggi diquesto metodo è che è flessibile e che altre regioni può essere selezionato sulla base del tipo di tumore e caratteristiche.
Protocol
Representative Results
Discussion
UCF analisi dell'integrità del DNA è un nuovo metodo, non invasivo per valutare l'integrità del DNA nelle urine. E 'stato recentemente proposto per la diagnosi precoce della vescica e della prostata 9 7,8. Un certo numero di vantaggi e svantaggi del test di integrità del DNA UCF sono discussi qui, insieme con le prospettive future.
Il principale vantaggio del metodo è che offre un metodo non invasivo e poco costoso un semplice protocollo per studiare l&…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Gráinne Tierney and Silvia Bellissimo for their editorial assistance.
Materials
| QIAamp DNA Mini Kit |
Qiagen | 51304 | |
| iQ SYBR Green Supermix, 100 x 50 µl rxns, 2.5 ml (2 x 1.25 ml) | Biorad | 1708880 | |
| IDT custom DNA oligos | IDT | HPLC purification, 100nMole DNA oligo | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | Other spectrophotometric methods could also be used to quantify DNA | |
| Rotor-Gene 6000 | Corbett | Another Real Time PCR instrument could also be used | |
| microcentrifuge | |||
| one centrifuge for 50 ml tubes | |||
| incubator | |||
| -80°C freezer | |||
| -20°C freezer | |||
| 10 ul pipette | |||
| 20 ul pipette | |||
| 200 ul pipette | |||
| 1000 ul pipette | |||
| pipette tips (10;20;200;1000) | |||
| 1,5 ml tubes | |||
| 50ml tubes | |||
| 15 ml tubes | |||
| Rotor-Disc 72 Rotor | Corbett | 9018899 | |
| Strip Tubes and Caps, 0.1 ml (250) | Qiagen | 981103 | |
| Collection Tubes (2 ml) | Qiagen | 19201 | |
| Buffer AL (264 ml) | Qiagen | 19075 | |
| Proteinase K (10ml) | Qiagen | 19133 |
References
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