Análise integridade do DNA de células-Free em amostras de urina
Summary
A method for analyzing DNA integrity in the cell-free supernatant fraction of urine samples is proposed. The method is suitable for early detection of urological malignancies and has proven accurate for the early diagnosis of bladder cancer.
Abstract
Embora a presença de ADN de circulação livre de células no plasma ou soro tem sido amplamente demonstrado ser uma fonte adequada de biomarcadores para muitos tipos de cancro, poucos estudos têm-se centrado na utilização potencial de ADN isento de células de urina (UCF). A partir das hipóteses de que as células em apoptose normais produzem DNA altamente fragmentado e que as células cancerosas liberam mais DNA, o papel potencial da integridade do DNA UCF foi avaliada como um marcador diagnóstico precoce capaz de distinguir entre os pacientes com câncer de próstata ou câncer de bexiga e indivíduos saudáveis.
Uma análise da integridade do ADN UCF é proposta com base em quatro reacções de PCR quantitativo em tempo real de quatro sequências mais longas do que 250 pb: c-myc, BCAS1, HER2, e AR. As sequências que têm frequentemente um aumento do número de cópias de ADN na bexiga e cancros da próstata foram escolhidos para análise, mas o método é flexível, e estes genes podem ser substituídos por outros genes de intedescansar. A utilidade potencial de DNA UCF como fonte de biomarcadores já foi demonstrado para neoplasias urológicas, abrindo assim o caminho para novos estudos sobre a caracterização DNA UCF. O teste de integridade do DNA UCF tem a vantagem de ser não-invasivo, rápido, e fácil de executar, com apenas alguns mililitros de urina necessários para levar a cabo a análise.
Introduction
ADN livre de células pode ser detectado no sangue e na urina devido a morte celular por mecanismos apoptóticos ou necróticos. DNA livre de células no sangue tem sido amplamente estudada para fins de diagnóstico e prognóstico em várias doenças, especialmente câncer 1. No entanto, pouco se sabe sobre o papel do DNA urinário livre de células (UCF). DNA UCF podem ser originários de passagem de sangue através do sistema de filtração glomerular ou a partir de células que entram em contacto directo com este corpo fluido 2 (por exemplo, células uroteliais ou células prostáticas). A utilização de ADN UCF como uma fonte de biomarcadores tem sido principalmente investigado para o diagnóstico precoce de doença renal, da bexiga, e cancro da próstata, devido à elevada percentagem de ADN UCF vindo directamente a partir de células do tracto urinário 3,4.
Pouco se sabe sobre DNA UCF e os melhores métodos para isolar e caracterizar-lo. Tendo em conta a hipótese de que as células tumorais libertar fragmentos de ADN mais longos do que as células normais, a avaliaçãoda integridade do ADN isento de células foi estudada na tentativa de elucidar a origem de ADN na circulação sanguínea 5. Alguns estudos demonstraram que a integridade do ADN isento de células no sangue representa um bom teste de diagnóstico para muitos tipos de cancro 6, e a mesma hipótese tem sido proposta em relação à urina 7-9.
Este artigo descreve um novo método para a análise de integridade do DNA UCF com um potencial de aplicação para detecção de bexiga e câncer de próstata. Em particular, a integridade do ADN UCF fragmentos superiores a 250 pb foi testado em 4 regiões conhecidas por terem um aumento do número de cópias de ADN em tumores sólidos, incluindo o da próstata e cancro da bexiga: c-myc (8q24.21), HER2 (17q12.1 ), BCAS1 (20q13.2) e AR (Xq12) 10-14. oncogenes específicos, em vez de seqüências aleatórias, foram escolhidos para aumentar a probabilidade de encontrá-los na fração livre de células de pacientes com câncer. Uma das principais vantagens deeste método é que é flexível e que outras regiões podem também ser seleccionada com base no tipo de tumor e características.
Protocol
Representative Results
Discussion
UCF análise da integridade do ADN é um método novo, não invasivo para avaliar a integridade do ADN na urina. Recentemente, foi proposto para o diagnóstico precoce da bexiga e próstata 9 7,8. Um certo número de vantagens e desvantagens do teste de integridade do DNA UCF são discutidos aqui, juntamente com perspectivas futuras.
A principal vantagem do método é que ele oferece um método barato, não-invasivo e um protocolo simples para estudar urina como uma fon…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Gráinne Tierney and Silvia Bellissimo for their editorial assistance.
Materials
| QIAamp DNA Mini Kit |
Qiagen | 51304 | |
| iQ SYBR Green Supermix, 100 x 50 µl rxns, 2.5 ml (2 x 1.25 ml) | Biorad | 1708880 | |
| IDT custom DNA oligos | IDT | HPLC purification, 100nMole DNA oligo | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | Other spectrophotometric methods could also be used to quantify DNA | |
| Rotor-Gene 6000 | Corbett | Another Real Time PCR instrument could also be used | |
| microcentrifuge | |||
| one centrifuge for 50 ml tubes | |||
| incubator | |||
| -80°C freezer | |||
| -20°C freezer | |||
| 10 ul pipette | |||
| 20 ul pipette | |||
| 200 ul pipette | |||
| 1000 ul pipette | |||
| pipette tips (10;20;200;1000) | |||
| 1,5 ml tubes | |||
| 50ml tubes | |||
| 15 ml tubes | |||
| Rotor-Disc 72 Rotor | Corbett | 9018899 | |
| Strip Tubes and Caps, 0.1 ml (250) | Qiagen | 981103 | |
| Collection Tubes (2 ml) | Qiagen | 19201 | |
| Buffer AL (264 ml) | Qiagen | 19075 | |
| Proteinase K (10ml) | Qiagen | 19133 |
References
- Francis, G., Stein, S. Circulating Cell-Free Tumour DNA in the Management of Cancer. Int.J.Mol.Sci. 16 (6), 14122-14142 (2015).
- Bryzgunova, O. E., Laktionov, P. P. Extracellular Nucleic Acids in Urine: Sources, Structure, Diagnostic Potential. Acta Naturae. 7 (3), 48-54 (2015).
- Szarvas, T., et al. Deletion analysis of tumor and urinary DNA to detect bladder cancer: urine supernatant versus urine sediment. Oncol.Rep. 18 (2), 405-409 (2007).
- Togneri, F. S., et al. Genomic complexity of urothelial bladder cancer revealed in urinary cfDNA. Eur.J.Hum.Genet. , (2016).
- Zonta, E., Nizard, P., Taly, V. Assessment of DNA Integrity, Applications for Cancer Research. Adv.Clin.Chem. 70, 197-246 (2015).
- Hao, T. B., et al. Circulating cell-free DNA in serum as a biomarker for diagnosis and prognostic prediction of colorectal cancer. Br.J.Cancer. 111 (8), 1482-1489 (2014).
- Salvi, S., et al. Urine Cell-Free DNA Integrity Analysis for Early Detection of Prostate Cancer Patients. Dis.Markers. 2015, 574120 (2015).
- Casadio, V., et al. Urine cell-free DNA integrity as a marker for early prostate cancer diagnosis: a pilot study. Biomed.Res.Int. 2013, 270457 (2013).
- Casadio, V., et al. Urine cell-free DNA integrity as a marker for early bladder cancer diagnosis: preliminary data. Urol.Oncol. 31 (8), 1744-1750 (2013).
- Salvi, S., et al. Circulating cell-free AR and CYP17A1 copy number variations may associate with outcome of metastatic castration-resistant prostate cancer patients treated with abiraterone. Br.J.Cancer. 112 (10), 1717-1724 (2015).
- Ishkanian, A. S., et al. High-resolution array CGH identifies novel regions of genomic alteration in intermediate-risk prostate cancer. Prostate. 69 (10), 1091-1100 (2009).
- Oxley, J. D., Winkler, M. H., Gillatt, D. A., Peat, D. S. Her-2/neu oncogene amplification in clinically localised prostate cancer. J.Clin.Patho. 55 (2), 118-120 (2002).
- Nord, H., et al. Focal amplifications are associated with high grade and recurrences in stage Ta bladder carcinoma. Int.J.Cancer. 126 (6), 1390-1402 (2010).
- Tabach, Y., et al. Amplification of the 20q chromosomal arm occurs early in tumorigenic transformation and may initiate cancer. PLoS One. 6 (1), e14632 (2011).
