Libre de células análisis de la integridad del ADN en muestras de orina
Summary
A method for analyzing DNA integrity in the cell-free supernatant fraction of urine samples is proposed. The method is suitable for early detection of urological malignancies and has proven accurate for the early diagnosis of bladder cancer.
Abstract
Aunque la presencia de ADN circulante libre de células en el plasma o suero ha sido ampliamente demostrado ser una fuente adecuada de biomarcadores para muchos tipos de cáncer, pocos estudios se han centrado en el uso potencial de ADN libre de células de orina (UCF). Partiendo de la hipótesis de que las células apoptóticas normales producen ADN muy fragmentado y que las células de cáncer de liberación más largo de ADN, el papel potencial de la integridad del ADN UCF se evaluó como un marcador de diagnóstico temprano capaz de distinguir entre pacientes con cáncer de próstata o cáncer de vejiga y los individuos sanos.
Se propone un análisis de la integridad del ADN UCF sobre la base de cuatro PCR cuantitativa en tiempo real de cuatro secuencias de más de 250 pares de bases: c-MYC, BCAS1, HER2, y AR. Las secuencias que con frecuencia tienen un número de copias de ADN aumentado en la vejiga y de próstata fueron elegidos para el análisis, pero el método es flexible, y estos genes pueden ser sustituidos con otros genes de intedescanso. La utilidad potencial de ADN UCF como fuente de biomarcadores ya ha sido demostrada para tumores malignos urológicos, preparando así el camino para nuevos estudios sobre la caracterización del ADN UCF. La prueba de la integridad del ADN UCF tiene la ventaja de ser no invasivo, rápido y fácil de realizar, con sólo unos pocos mililitros de orina necesarios para llevar a cabo el análisis.
Introduction
-Cell libre de ADN se puede detectar en la sangre y en la orina debido a la muerte celular por mecanismos apoptóticos o necróticos. ADN libre de células en la sangre se ha estudiado ampliamente para fines de diagnóstico y pronóstico en diversas enfermedades, especialmente el cáncer 1. Sin embargo, se sabe menos sobre el papel del ADN de orina libre de células (UCF). ADN UCF puede originarse de sangre que pasa a través del sistema de filtración glomerular o de células que entran directamente en contacto con este líquido cuerpo 2 (por ejemplo, células uroteliales o células prostáticas). El uso de ADN UCF como fuente de biomarcadores principalmente se ha investigado para el diagnóstico precoz de insuficiencia renal, la vejiga y el cáncer de próstata debido al alto porcentaje de ADN UCF procedentes directamente de las células del tracto urinario 3,4.
Poco se sabe sobre el ADN de la UCF y los mejores métodos para aislar y caracterizar ella. Dada la hipótesis de que las células tumorales liberan fragmentos de ADN más largos que las células normales, la evaluaciónde la integridad del ADN libre de células se ha estudiado en un intento de elucidar el origen del ADN en la circulación de la sangre 5. Algunos estudios han demostrado que la integridad del ADN libre de células en la sangre representa una buena prueba de diagnóstico para muchos tipos de cáncer 6, y la misma hipótesis ha sido propuesto en relación con la orina 7-9.
En este trabajo se describe un nuevo método para el análisis de la integridad del ADN UCF con una aplicación potencial para la detección de cáncer de vejiga y de próstata. En particular, la integridad del ADN UCF fragmentos más largos de 250 pb fue probado en 4 regiones sabe que tienen un número incrementado de copias de ADN en tumores sólidos, incluyendo cáncer de próstata y la vejiga: c-MYC (8q24.21), HER2 (17q12.1 ), BCAS1 (20q13.2), y AR (Xq12) 10-14. oncogenes específicos, en lugar de secuencias aleatorias, se eligieron para aumentar la probabilidad de encontrar en la fracción libre de células de pacientes con cáncer. Una de las principales ventajas deeste método es que es flexible y que otras regiones también se puede seleccionar sobre la base de tipo de tumor y características.
Protocol
Representative Results
Discussion
análisis de la integridad del ADN UCF es un método nuevo, no invasivo para la evaluación de la integridad del ADN en la orina. Se propuso recientemente para el diagnóstico precoz de la vejiga y de próstata 9 7,8. Se discute aquí una serie de ventajas y desventajas de la prueba de la integridad del ADN UCF, junto con las perspectivas de futuro.
La principal ventaja de este enfoque es que ofrece un método barato, no invasivo y un protocolo sencillo para estudiar la…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Gráinne Tierney and Silvia Bellissimo for their editorial assistance.
Materials
| QIAamp DNA Mini Kit |
Qiagen | 51304 | |
| iQ SYBR Green Supermix, 100 x 50 µl rxns, 2.5 ml (2 x 1.25 ml) | Biorad | 1708880 | |
| IDT custom DNA oligos | IDT | HPLC purification, 100nMole DNA oligo | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | Other spectrophotometric methods could also be used to quantify DNA | |
| Rotor-Gene 6000 | Corbett | Another Real Time PCR instrument could also be used | |
| microcentrifuge | |||
| one centrifuge for 50 ml tubes | |||
| incubator | |||
| -80°C freezer | |||
| -20°C freezer | |||
| 10 ul pipette | |||
| 20 ul pipette | |||
| 200 ul pipette | |||
| 1000 ul pipette | |||
| pipette tips (10;20;200;1000) | |||
| 1,5 ml tubes | |||
| 50ml tubes | |||
| 15 ml tubes | |||
| Rotor-Disc 72 Rotor | Corbett | 9018899 | |
| Strip Tubes and Caps, 0.1 ml (250) | Qiagen | 981103 | |
| Collection Tubes (2 ml) | Qiagen | 19201 | |
| Buffer AL (264 ml) | Qiagen | 19075 | |
| Proteinase K (10ml) | Qiagen | 19133 |
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