Control de reactividad astrositos y proliferación in Vitro bajo condiciones isquémicas
Summary
Accidente cerebrovascular isquémico es un evento complejo en el que la contribución específica de los astrocitos de la región del cerebro afectada expuesta a privación de glucosa oxígeno (OGD) es difícil de estudiar. Este artículo presenta una metodología para obtener aislados astrocitos y estudiar su reactividad y la proliferación en condiciones OGD.
Abstract
Accidente cerebrovascular isquémico es una lesión compleja del cerebro causada por un trombo o émbolo obstruye el flujo sanguíneo a partes del cerebro. Esto conduce a la privación de oxígeno y glucosa, lo cual provoca falta de energía y la muerte neuronal. Después de un insulto isquémico movimiento, astrocitos se reactiva y proliferan alrededor del sitio de la lesión que desarrolla. Bajo este escenario, es difícil estudiar la contribución específica de los astrocitos de la región del cerebro expuesto a isquemia. Por lo tanto, este artículo presenta una metodología para estudiar la reactividad de astrositos primaria y proliferación bajo un modelo en vitro de un entorno similar a isquemia, llamado privación de glucosa oxígeno (OGD). Los astrocitos fueron aislados de 1-4 días-viejas ratas neonatales y el número de células astrocytic no específica se evaluó mediante marcador selectivo de astrositos proteína ácida fibrilosa Glial (GFAP) y tinción nuclear. El período en el que los astrocitos son sometidos a la condición de la OGD se puede personalizar, así como el porcentaje de oxígeno que están expuestos. Esta flexibilidad permite a los científicos caracterizar la duración de la enfermedad isquémica como en los diferentes grupos de células in vitro. Este artículo aborda los plazos del OGD que inducen proliferación medido por inmunofluorescencia utilizando la proliferación de la célula Nuclear antígeno (PCNA), reactividad astrositos y morfología hipertrófica. Además de la proliferación, astrocitos experimentan la energía y el estrés oxidativo y responden a inclinacion por liberación de factores solubles en el medio celular. Este medio puede ser recogido y utilizado para analizar los efectos de moléculas liberadas por astrocitos en cultivos neuronales primarios sin interacción de célula a célula. En Resumen, este modelo de cultura de célula primaria puede utilizarse eficientemente para entender el papel de los astrocitos aislados tras lesiones.
Introduction
Movimiento se define como «una aguda disfunción neurológica de origen vascular con desarrollo rápido o repentino de los síntomas y signos, correspondiente a la participación de las áreas del cerebro»1,2. Hay dos tipos de ictus: isquémico y hemorrágico. Cuando la disfunción vascular es causada por un aneurisma o un mal funcionamiento arteriovenoso, acompañado de debilitamiento con la posterior ruptura de una arteria, esto se denomina accidente cerebrovascular hemorrágico3 que, en la mayoría de los casos, conduce a la muerte. Cuando un trombo o un émbolo obstruye flujo de la sangre, causando una privación temporal de oxígeno y glucosa a una región del cerebro, se denomina accidente cerebrovascular isquémico4. Si no se alimentan las células alrededor del área afectada o núcleo isquémico conduce a un desequilibrio homeostático y metabólica, disfunción energética, muerte neuronal e inflamación5, que puede provocar una discapacidad permanente para pacientes6.
Accidente cerebrovascular isquémico es una lesión multifactorial que involucra a varios tipos de células que reaccionan y ejercen sus efectos en diferentes puntos temporales. Muchas interacciones crean un ambiente difícil para estudiar el comportamiento de células individuales. Así que, ¿cómo se estudia la contribución de un tipo de célula específica en un entorno tan complejo? Un modelo aceptado en vitro de isquemia consiste en exponer las células a la privación de oxígeno y glucosa (OGD), durante un determinado período, seguido por la restauración de las células a un ambiente normoxic. Este sistema simula un movimiento isquémico seguido de reperfusión arterial. En este método, las células o los tejidos se exponen a un medio libre de glucosa en medio purgado de oxígeno, usando una cámara hipóxica especializada. El tiempo de incubación de la inclinacion puede variar desde unos pocos minutos hasta 24 horas, dependiendo de la hipótesis que quiere probarse. Estudios han demostrado que dependiendo de los tiempos de la OGD y ambiente normoxic, fenotipos específicos de movimiento (es decir, aguda o subcrónica) puede lograrse. Primarios astrocitos aislados, expuestos a la inclinacion con la posterior restauración a normoxic las condiciones, es un modelo celular muy estudiado para imitar el movimiento in vitro7. Utilizando OGD es posible revelar los mecanismos moleculares independientes de células aisladas en un entorno de movimiento como.
A medida que aumenta nuestro conocimiento de la biología de astrositos, ha comprobado que son cruciales para el mantenimiento de las sinapsis y mantenimiento reparación, desarrollo y Plasticidad neural8. En condiciones normales, astrocitos liberan y responden a citoquinas, quimioquinas, factores de crecimiento y gliotransmitters, manteniendo el equilibrio metabólico y la homeostasis dentro de sinapsis5,9. En neuroinflamación aguda, como un accidente cerebrovascular isquémico, estas células pueden convertirse en reactivas muestran una largo plazo sobreexpresión de la proteína ácida fibrilosa Glial (GFAP) y muestran hipertrofia en su morfología5,10, 11 , 12. como se desarrolla el infarto isquémico, la homeostasis proporcionada por astrocitos se convierte afectada, con respecto a la captación de glutamato normal, metabolismo energético, el intercambio de moléculas activas y antioxidante actividad13.
Reactivados los astrocitos proliferan alrededor del tejido de infarto mientras que los leucocitos migran hacia la zona lesionados14. Proliferación astrocytic puede medirse mediante marcadores como el antígeno nuclear de proliferación celular (PCNA), Ki67 y bromodeoxiuridina (BrdU)15. Esta respuesta proliferativa se genera de una manera dependiente del tiempo y ayuda a formar la cicatriz glial, una matriz de astrocitos reactivos irreversiblemente a lo largo de la parenquimia del sitio dañado después de una lesión9. Una de las funciones iniciales de esta cicatriz es limitar la extravasación de células inmunitarias en esta área. Sin embargo, estudios han demostrado que la cicatriz se convierte en un impedimento físico para axones a extenderse, como se liberan moléculas de inhibir el crecimiento axonal y crear una barrera física impidiendo que axones que se extiende alrededor de la zona lesionada16. Sin embargo, existe evidencia científica que muestra que después de una lesión de la médula espinal, prevenir totalmente la formación glial de la cicatriz puede afectar la regeneración de axones17. Por lo tanto, debe considerarse el contexto en el que se mide la respuesta astrocytic específica, en el marco de la lesión estudiada.
La metodología presentada se puede aplicar para estudiar la función individualizada de astrocitos después de privación de oxígeno la glucosa y puede ser modificada según las preguntas que el investigador quiere contestar. Por ejemplo, además de los cambios morfológicos y los marcadores expresados en diferentes momentos de la OGD, los sobrenadantes de astrocitos expuestos a inclinacion pueden ser más analizados para identificar factores solubles liberados por estas células, o utilizado como un medio acondicionado para evaluar su efecto en otras células cerebrales. Este enfoque permite estudios de reactividad de astrositos que podrían llevar al esclarecimiento de los factores que regulan y modulan su respuesta en un escenario de accidente cerebrovascular isquémico.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo describe el aislamiento de los astrocitos de las cortezas de la rata. En este método, es fundamental para disminuir la contaminación con otros tipos celulares como los fibroblastos, microglia y oligodendrocitos. Para reducir el número de microglía, se pueden tomar varias medidas: cambio de medios de comunicación, agitación orbital y tratamientos químicos. Una vez pureza cultura confirmado por inmunofluorescencia utilizando marcadores selectivos de celulares o para los más importantes contaminantes …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores queremos agradecer a Paola López Pieraldi la asistencia técnica. A.H.M. es agradecido por las subvenciones 8G12MD007600 y U54-NS083924 que apoyaron esta publicación. Agradecemos a NIH-NIMHD-G12-MD007583 subvención para el apoyo del mecanismo. Dera está agradecido por la beca proporcionada por NIHNIGMS-R25GM110513. Estamos agradecidos por el uso de la zona común de la instrumentación y la ayuda de Dr. Priscila Sanabria para el uso de las instalaciones de la proyección de imagen óptica del programa RCMI por conceder G12MD007583. Además, queremos agradecer a José Padilla por su destacado papel en filmación y edición del protocolo visual.
Materials
| Instruments for Surgery – Step 1 | |||
| Operating scissor 5.5” | Roboz Company | RS-6812 | Tools used to decapitate the rats. |
| Curved forceps 7” | Roboz Company | RS-5271 | Holds the skin of the rat while the skull is removed. |
| Micro-dissecting scissors 4” | Roboz Company | RS-5882 | Cuts both the skin and skull of the rat. |
| Micro-dissecting forceps 4” angled, fine sharp | Roboz Company | RS-5095 | Holds the skin of the rat while the skull is removed. |
| Micro-dissecting forceps 4” slightly curved 0.8 | Roboz Company | RS-5135 | Tool used to separate cortices. |
| Micro-dissecting tweezers | Roboz Company | RS-4972 | Peels brain meninges. |
| Dissection microscope | Olympus | SZX16 | Important for removing the meninge from the cortices. |
| DMEM Preparation – step 2 | |||
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | GibCo. Company | 11995-065 | Supports the growth of cells. |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich Company | S7277 | Supplement for the cell culture media. |
| Fetal bovine serum (FBS) | GibCo. Company | 10437-010 | Serum-supplement for the cell culture. |
| Penicillin-Streptomycin | GibCo. Company | 15140-148 | Inhibits the growth of bacterias in the cell culture. |
| Filter System 1L with 0.22um pore | Corning | 431098 | |
| Astrocyte culture – step 3 | |||
| Serological pipets 5mL | VWR | 89130-896 | To pipette DMEM to containers with cells. |
| Serological pipets 10mL | VWR | 89130-898 | To pipette DMEM to containers with cells. |
| Serological pipets 25mL | VWR | 89130-900 | To pipette DMEM to containers with cells. |
| Centrifuge conical tube 15mL | Santa Cruz Biotechnology | sc-200250 | |
| Safe-lock tube 1.5mL | Eppendorf | 022363204 | |
| Barrier Tips 200 uL | Santa Cruz Biotechnology | sc-201725 | |
| Barrier Tips 1 mL | Santa Cruz Biotechnology | sc-201727 | |
| Biohazard Orange Bag 14 x 19" | VWR | 14220-048 | |
| 60mm petri dishes | Falcon | 351007 | |
| Sterile gauze pads | Honeywell Safety | 89133-086 | |
| Stomacher 80 Biomaster | Sewar Lab System | 030010019 | Triturate the brain tissue. |
| Stomacher 80 Blender Sterile Bags | Sewar Lab System | BA6040 | Sterile bag for the stomacher cell homogenizer. |
| Beaker 400mL | Pyrex | 1000 | |
| Sterile cell dissociation sieve, mesh #60 | Sigma-Aldrich Company | S1020 | To obtain a uniform single cell suspension. |
| Sterile cell dissociation sieve, mesh #100 | Sigma-Aldrich Company | S3895 | To obtain a uniform single cell suspension. |
| Invert phase microscope | Nikon | Eclypse Ti-S | Verify cells for contamination or abnormal cell growth. |
| 75cm2 sterile flasks | Falcon | 353136 | |
| Multi-well plate | Falcon | 353046 | |
| Micro cover glasses (coverslips), 18mm, round | VWR | 48380-046 | |
| Bright-Line hemacytometer | Sigma-Aldrich Company | Z359629 | |
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| Ethyl alcohol | Sigma-Aldrich Company | E7023 | |
| L-leucine methyl ester hydrochloride 98% (LME) | Sigma-Aldrich Company | L1002 | Promotes the elimination of microglia cells in the primary cortical astrocyte cultutre. |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside (Ara-C) | Sigma-Aldrich Company | C1768 | |
| Poly-D-Lysine Hydrobromide, mol wt 70,000-150,000 | Sigma-Aldrich Company | P0899 | |
| Trypsin/EDTA | GibCo. Company | 15400-054 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich Company | T8154 | |
| Phosphate buffer saline (PBS) tablets | Calbiochem | 524650 | |
| Sterile Water | Sigma-Aldrich Company | W3500 | |
| OGD Medium Preparation – step 5 | |||
| Centrifuge conical tube 50 mL | VWR | 89039-658 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium-free glucose | Sigma-Aldrich Company | D5030 | Supports the growth of cells. |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich Company | S7277 | Supplement for the cell culture media. |
| Penicillin-Streptomycin | GibCo. Company | 15140-148 | Inhibits the growth of bacterias in the cell culture. |
| 200mM L-glutamine | GibCo. Company | 25030-081 | Amino acid that supplements the growth of cells. |
| Phospahet buffer saline (PBS) tablets | Calbiochem | 524650 | |
| Filter System 50mL with 0.22um pore | Corning | 430320 | |
| Centrifuge conical tube 50 mL | VWR | 89039-658 | |
| Single Flow Meter | Billups-Rothenberg | SMF3001 | Measure gas flow in oxygen purge. |
| Hypoxia Incubator Chamber | StemCell | 27310 | Generates a hypoxic environment for the cell culture. |
| Traceable Dissolved Oxygen Meter | VWR | 21800-022 | |
| 95% N2/ 5% CO2 Gas Mixture | Linde | Purges the environment of oxygen. | |
| primary astrocyte immunofluorescence – step 6 | |||
| Phosphate buffer saline (PBS) tablets | Calbiochem | 524650 | |
| Formaline Solution Neutral Buffer 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | Solution used to fix cells. |
| Methanol | Fisher | A4544 | Solution used to fix cells. |
| Non-ionic surfactant (Triton X-100) | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | GibCo. Company | 10437-010 | Serum-supplement for the cell culture. |
| Anti-NeuN | Cell Signaling | 24307 | Detects mature neurons, serves to validate the astrocytic culture. |
| Anti-PCNA | Cell Signaling | 2586 | Detects proliferating cells. |
| Propidium Iodide (PI) | Sigma-Aldrich Company | P4170 | Apoptosis staining. |
| Anti-Olig1 | Abcam | AB68105 | Detects mature oligodendrocytes. |
| Anti-Iba1+ | Wako | 016-20001 | Detects microglial cells. |
| Anti-GFAP Conjugated with Cy3 | Sigma-Aldrich Company | C9205 | Detects reactive astrocytes in the treated cells. |
| Alexa Fluor 488 | Molecular Probe Life Technology | A1101 | Anti-Mouse Secondary Antibody |
| Alexa Fluor 555 | Molecular Probe Life Technology | A21428 | Anti-Rabbit Secondary Antibody |
| 4’,6’-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich Company | D9542 | Nuclear staining |
| Confocal microscope | Olympus |
References
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