사이토 반응성 및 확산에서 체 외에 허 혈 성 같은 조건 모니터링
Summary
허 혈 성 뇌졸중 공부 하기 어려운 어떤 영향을 받는 뇌 영역에 이다의 구체적인 기여 산소 포도 당 부족 (지도부)에 노출 하는 복잡 한 이벤트입니다. 이 문서는 고립 된 이다 그들의 반응성 및 확산 지도부 조건 하에서 연구 하는 방법론을 소개 합니다.
Abstract
허 혈 성 뇌졸중은 혈전 또는 두뇌의 부분에 혈액 흐름을 방해 하는 embolus로 인 한 복잡 한 뇌 손상. 이것은 산소와 포도 당, 에너지 실패 원인과 신경 죽음의 부족. 허 혈 성 뇌졸중 모욕 후 이다 반응 되 고 그것은 개발로 부상 사이트 격 증. 이 시나리오에서는 허 혈에 노출 된 뇌 영역에 이다의 구체적인 기여를 공부 하기 어렵습니다. 따라서,이 문서의 기본 사이토 반응성 산소 포도 당 부족 (지도부) 라는 허 혈 같은 환경의 체 외에 모델 확산을 공부 하는 방법을 소개 합니다. 이다 1-4 일에서 고립 되었다-오래 된 신생아 쥐와 일반적인 astrocytic 셀 수 사이토 선택 마커 폐해 Fibrillary 산 성 단백질 (GFAP) 및 핵 얼룩을 사용 하 여 평가 했다. 기간 이다 지도부 조건에 복종 된다 수 사용자 지정할 수, 그들은에 노출 되는 산소의 백분율 뿐만 아니라. 이 유연성 과학자를 셀 체 외의 다른 그룹에서 허 혈 성 같은 상태 기간 특성을 수 있습니다. 이 문서에서는 사이토 반응성, hypertrophic 형태학 및 확산 증식 세포 핵 항 원 (PCNA)를 사용 하 여 면역 형광 검사로 측정 된 유도 지도부의 시간대를 설명 합니다. 확산, 게다가 이다 에너지와 산화 스트레스를 받게 하 고 응답 지도부 셀 중간에 녹는 요소를 해제 하 여. 이 매체는 수집 고 분자 이다 세포 세포 상호 작용 없이 기본 신경 문화에 의해 발표의 효과 분석 하는 데 사용 될 수 있습니다. 요약 하자면,이 1 차 셀 문화 모델 부상 시 절연된 이다의 역할을 이해 하 효율적으로 사용할 수 있습니다.
Introduction
선 “는 급성 신경 부전 혈관 근원의 증상 및 징후, 뇌의 초점 분야의 참여 하에 해당의 급격 하거나 급속 한 개발”1,2로 정의 됩니다. 뇌졸중의 두 가지 유형이 있다: 출혈 및 허 혈 성. 혈관 장애는 동맥 류 또는 arteriovenous 오작동, 약화의 동맥, 후부 파열과 동반 하 여 발생 하는 경우이, 죽음에 이르게 하는 대부분의 경우에는 출혈 성 뇌졸중3 이라고 불린다. 혈전 또는 embolus 혈액 흐름을 방해, 산소와 포도 당 두뇌 지역에의 임시 박탈을 일으키는 그것 이라고 뇌경색4합니다. 영향을 받는 지역 또는 항상성 및 대사 불균형, 에너지 장애, 신경 죽음, 및 염증5, 환자6평생 장애를 일으킬 수 있는 허 혈 성 핵심 리드 주위 세포를 키 우다 실패.
허 혈 성 뇌졸중은 반응 하 고 다른 시간 지점에서 그들의 효과 발휘 하는 셀의 여러 종류를 포함 multifactorial 부상이 다. 많은 상호 작용 개별 셀의 동작을 연구 하는 어려운 환경을 만들. 그래서, 우리가 어떻게 이러한 복잡 한 환경에서 특정 세포 유형에의 기여를 연구? 허 혈의 허용 시험관에 모델 이루어져 있다 산소와 포도 당 부족 (지도부), 세포를 노출 특정 기간에 대 한 다음 normoxic 환경에 세포의 복원. 이 시스템은 혈 reperfusion 뒤 허 혈 성 뇌졸중을 시뮬레이션 합니다. 이 방법에서는, 세포 또는 조직 전문된 hypoxic 챔버를 사용 하 여 산소의 제거는 환경에서 포도 당 자유로운 매체에 노출 됩니다. 지도부 부 화 시간 몇 분에서 최대 24 h, 가설을 테스트 하 고 싶어에 따라 달라질 수 있습니다. 연구 하는 지도부의 시대에 따라 그리고 normoxic 환경, 스트로크 (즉, 급성 또는 아민)의 특정 고기를 얻을 수 있다. 기본 절연된 이다, normoxic 조건에 후부 복원와 지도부에 노출 선 체 외7모방을 잘 공부 셀룰러 모델 이다. 지도부를 사용 하 여 뇌졸중 같은 환경에서 격리 된 셀의 독립적인 분자 메커니즘을 밝힐 수 있다.
사이토 생물학의 우리의 지식을 증가, 그것은 분명 그들은 시 냅 스를 유지 하 고 신경 수리, 개발, 및 소성8유지에 대 한 중요 한 되고있다. 정상적인 조건 하에서 이다 놓고 cytokines, 발산, 성장 인자 및 gliotransmitters, 신진 대사 균형 및 시 냅 스5,9내 항상성 유지에 응답. 허 혈 성 뇌졸중 등 급성 neuroinflammation에이 셀 수 있다 반응 될, 장기 overexpression의 폐해 Fibrillary 산 성 단백질 (GFAP), 표시 및 그들의 형태학5,10, 에 비 표시 11 , 12. 허 혈 성 경색 개발로, 항상성 이다에 의해 제공 된다 영향을, 일반 조미료 통풍 관, 에너지 대사, 활성 분자, 그리고 항 산화 활동13의 교환에 관한.
다시 활성화 이다 백혈구14lesioned 지역 이동 하는 동안 경색 조직 주위 확산. Astrocytic 확산 증식 세포 핵 항 원 (PCNA), Ki67, 등 bromodeoxyuridine (BrdU)15마커를 사용 하 여 측정 될 수 있다. 이 증식 응답 시간-종속 방식으로 생성 되 고 glial 흉터, 부상9후 손상 된 사이트의 실질에 따라 돌이킬 반응성 이다의 배열을 형성 하는 데 도움이. 이 흉터의 초기 기능 중 하나는이 지역에서 면역 세포 넘쳐 흐름을 제한 것입니다. 그러나, 연구 흉터 확장 하, 그들은 릴리스 axonal 성장 억제 분자 고 부상된 지역16주위 확장에서 축 삭을 방지 물리적 장벽을 만드는 축 삭에 대 한 물리적 장애물이 되는 것으로 나타났습니다. 그럼에도 불구 하 고, 그 척수 상해 후 완전히 glial 흉터 대형을 방지 수 있습니다 손상17축 삭 재생을 보여주는 과학적인 증거가 있다. 따라서, 컨텍스트는 특정 astrocytic 응답 측정, 공부 하는 상해의 프레임 워크에 고려 되어야 한다.
제시 하는 방법론 산소가 포도 당 결핍 후 이다의 개별된 기능 연구에 적용할 수 있습니다 그리고 탐정 대답을 원하는 질문에 따라 수정할 수 있습니다. 예를 들어 형태학 상 변화와 다른 지도부 시간에 표현 하는 마커, 게다가 이다 지도부에 노출에서 supernatants 분석 될 수 있다 더 식별 성 요인,이 세포에 의해 발표 또는 바른된 미디어로 평가 하는 데 사용 하는 다른 뇌 세포에 효과입니다. 이 이렇게 규제 하 고 허 혈 성 뇌졸중 시나리오에서 그들의 응답을 조절 하는 요인의 설명으로 이어질 수 있는 사이토 반응성에 대 한 연구를 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜 이다 쥐 외피가에서 격리를 설명합니다. 이 방법에서는, 그것은 microglia, oligodendrocytes, 섬유 아 세포 등 다른 세포 종류와 오염 감소에 중요 한입니다. Microglia의 수를 줄이기 위해, 몇 가지 단계를 취할 수 있습니다: 미디어, 떨고, 궤도 및 화학 치료를 변경. 가장 눈에 띄는 셀 오염 물질에 대 한 선택적 세포 마커를 사용 하 여 면역 형광 또는 문화 순수성을 확인 실험을 수행할 수 있습?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 기술 지원에 대 한 파 올라 로페스 Pieraldi를 감사 드립니다. A.H.M.는 보조금 8G12MD007600 및 U54-NS083924이이 간행물을 지원에 대 한 감사. 우리 시설 지원에 대 한 NIH-NIMHD-G12-MD007583 그랜트를 감사합니다. D.E.R.A.는 NIHNIGMS-R25GM110513에서 제공 하는 원정대에 대 한 감사입니다. 우리는 일반적인 계측 영역의 사용에 대 한 감사와 광학 이미징 시설 RCMI 프로그램의 사용에 대 한 박사 Priscila Sanabria의 원조 G12MD007583 부여. 또한, 우리는 그의 뛰어난 역할을 촬영 하 고 편집 하는 시각적 프로토콜에 대 한 호세 빠 디 야 감사 드립니다.
Materials
| Instruments for Surgery – Step 1 | |||
| Operating scissor 5.5” | Roboz Company | RS-6812 | Tools used to decapitate the rats. |
| Curved forceps 7” | Roboz Company | RS-5271 | Holds the skin of the rat while the skull is removed. |
| Micro-dissecting scissors 4” | Roboz Company | RS-5882 | Cuts both the skin and skull of the rat. |
| Micro-dissecting forceps 4” angled, fine sharp | Roboz Company | RS-5095 | Holds the skin of the rat while the skull is removed. |
| Micro-dissecting forceps 4” slightly curved 0.8 | Roboz Company | RS-5135 | Tool used to separate cortices. |
| Micro-dissecting tweezers | Roboz Company | RS-4972 | Peels brain meninges. |
| Dissection microscope | Olympus | SZX16 | Important for removing the meninge from the cortices. |
| DMEM Preparation – step 2 | |||
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | GibCo. Company | 11995-065 | Supports the growth of cells. |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich Company | S7277 | Supplement for the cell culture media. |
| Fetal bovine serum (FBS) | GibCo. Company | 10437-010 | Serum-supplement for the cell culture. |
| Penicillin-Streptomycin | GibCo. Company | 15140-148 | Inhibits the growth of bacterias in the cell culture. |
| Filter System 1L with 0.22um pore | Corning | 431098 | |
| Astrocyte culture – step 3 | |||
| Serological pipets 5mL | VWR | 89130-896 | To pipette DMEM to containers with cells. |
| Serological pipets 10mL | VWR | 89130-898 | To pipette DMEM to containers with cells. |
| Serological pipets 25mL | VWR | 89130-900 | To pipette DMEM to containers with cells. |
| Centrifuge conical tube 15mL | Santa Cruz Biotechnology | sc-200250 | |
| Safe-lock tube 1.5mL | Eppendorf | 022363204 | |
| Barrier Tips 200 uL | Santa Cruz Biotechnology | sc-201725 | |
| Barrier Tips 1 mL | Santa Cruz Biotechnology | sc-201727 | |
| Biohazard Orange Bag 14 x 19" | VWR | 14220-048 | |
| 60mm petri dishes | Falcon | 351007 | |
| Sterile gauze pads | Honeywell Safety | 89133-086 | |
| Stomacher 80 Biomaster | Sewar Lab System | 030010019 | Triturate the brain tissue. |
| Stomacher 80 Blender Sterile Bags | Sewar Lab System | BA6040 | Sterile bag for the stomacher cell homogenizer. |
| Beaker 400mL | Pyrex | 1000 | |
| Sterile cell dissociation sieve, mesh #60 | Sigma-Aldrich Company | S1020 | To obtain a uniform single cell suspension. |
| Sterile cell dissociation sieve, mesh #100 | Sigma-Aldrich Company | S3895 | To obtain a uniform single cell suspension. |
| Invert phase microscope | Nikon | Eclypse Ti-S | Verify cells for contamination or abnormal cell growth. |
| 75cm2 sterile flasks | Falcon | 353136 | |
| Multi-well plate | Falcon | 353046 | |
| Micro cover glasses (coverslips), 18mm, round | VWR | 48380-046 | |
| Bright-Line hemacytometer | Sigma-Aldrich Company | Z359629 | |
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| Ethyl alcohol | Sigma-Aldrich Company | E7023 | |
| L-leucine methyl ester hydrochloride 98% (LME) | Sigma-Aldrich Company | L1002 | Promotes the elimination of microglia cells in the primary cortical astrocyte cultutre. |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside (Ara-C) | Sigma-Aldrich Company | C1768 | |
| Poly-D-Lysine Hydrobromide, mol wt 70,000-150,000 | Sigma-Aldrich Company | P0899 | |
| Trypsin/EDTA | GibCo. Company | 15400-054 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich Company | T8154 | |
| Phosphate buffer saline (PBS) tablets | Calbiochem | 524650 | |
| Sterile Water | Sigma-Aldrich Company | W3500 | |
| OGD Medium Preparation – step 5 | |||
| Centrifuge conical tube 50 mL | VWR | 89039-658 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium-free glucose | Sigma-Aldrich Company | D5030 | Supports the growth of cells. |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich Company | S7277 | Supplement for the cell culture media. |
| Penicillin-Streptomycin | GibCo. Company | 15140-148 | Inhibits the growth of bacterias in the cell culture. |
| 200mM L-glutamine | GibCo. Company | 25030-081 | Amino acid that supplements the growth of cells. |
| Phospahet buffer saline (PBS) tablets | Calbiochem | 524650 | |
| Filter System 50mL with 0.22um pore | Corning | 430320 | |
| Centrifuge conical tube 50 mL | VWR | 89039-658 | |
| Single Flow Meter | Billups-Rothenberg | SMF3001 | Measure gas flow in oxygen purge. |
| Hypoxia Incubator Chamber | StemCell | 27310 | Generates a hypoxic environment for the cell culture. |
| Traceable Dissolved Oxygen Meter | VWR | 21800-022 | |
| 95% N2/ 5% CO2 Gas Mixture | Linde | Purges the environment of oxygen. | |
| primary astrocyte immunofluorescence – step 6 | |||
| Phosphate buffer saline (PBS) tablets | Calbiochem | 524650 | |
| Formaline Solution Neutral Buffer 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | Solution used to fix cells. |
| Methanol | Fisher | A4544 | Solution used to fix cells. |
| Non-ionic surfactant (Triton X-100) | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | GibCo. Company | 10437-010 | Serum-supplement for the cell culture. |
| Anti-NeuN | Cell Signaling | 24307 | Detects mature neurons, serves to validate the astrocytic culture. |
| Anti-PCNA | Cell Signaling | 2586 | Detects proliferating cells. |
| Propidium Iodide (PI) | Sigma-Aldrich Company | P4170 | Apoptosis staining. |
| Anti-Olig1 | Abcam | AB68105 | Detects mature oligodendrocytes. |
| Anti-Iba1+ | Wako | 016-20001 | Detects microglial cells. |
| Anti-GFAP Conjugated with Cy3 | Sigma-Aldrich Company | C9205 | Detects reactive astrocytes in the treated cells. |
| Alexa Fluor 488 | Molecular Probe Life Technology | A1101 | Anti-Mouse Secondary Antibody |
| Alexa Fluor 555 | Molecular Probe Life Technology | A21428 | Anti-Rabbit Secondary Antibody |
| 4’,6’-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich Company | D9542 | Nuclear staining |
| Confocal microscope | Olympus |
References
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