Surveillance des astrocytes réactivité et prolifération in Vitro dans des Conditions de type ischémique
Summary
Accident vasculaire cérébral ischémique est un événement complexe dans laquelle l’apport spécifique des astrocytes dans la région du cerveau touchée exposés au manque d’oxygène de glucose (AMG) est difficile à étudier. Cet article présente une méthode pour obtenir des astrocytes isolés et étudier leur réactivité et leur multiplication dans des conditions de ministères.
Abstract
Accident vasculaire cérébral ischémique est un complexe crânien provoqué par un thrombus ou embolie entrave à la circulation sanguine vers les parties du cerveau. Cela conduit à la privation d’oxygène et de glucose, ce qui provoque la défaillance de l’énergie et la mort neuronale. Après une insulte d’accident vasculaire cérébral ischémique, astrocytes devient réactifs et prolifèrent autour du site de la lésion qu’il développe. Selon ce scénario, il est difficile d’étudier la contribution spécifique des astrocytes dans la région de cerveau exposé à l’ischémie. Par conséquent, cet article présente une méthodologie pour étudier la réactivité primaire astrocyte et prolifération dans un modèle in vitro d’un environnement de type ischémie, appelé la privation d’oxygène glucose (AMG). Les astrocytes ont été isolés de 1 à 4 jours-vieux rats néonatals et le nombre de cellules astrocytaires non spécifique a été évaluée à l’aide du marqueur sélectif astrocyte gliale fibrillaire acide protéine (GFAP) et la coloration des noyaux. La période dans laquelle astrocytes sont soumis à la condition de l’AMG peut être personnalisée, ainsi que le pourcentage d’oxygène, qu’ils sont exposés. Cette souplesse permet aux scientifiques de caractériser la durée de la condition de type ischémique dans différents groupes de cellules in vitro. Cet article explique les délais d’AMG qui induisent la réactivité de l’astrocyte, morphologie hypertrophique et prolifération telle que mesurée par l’immunofluorescence utilisant prolifèrent Cell Nuclear Antigen (PCNA). En plus de la prolifération, astrocytes subissent l’énergie et du stress oxydatif et de répondent aux autres ministères en libérant des facteurs solubles dans le milieu cellulaire. Ce moyen de communication peut être collecté et utilisée pour analyser les effets des molécules libérées par les astrocytes dans des cultures primaires de neurones sans interaction cellule-cellule. En résumé, ce modèle de culture cellulaire primaire peut être utilisé efficacement pour comprendre le rôle des astrocytes isolés sur blessure.
Introduction
Accident vasculaire cérébral est défini comme « un dysfonctionnement neurologique aiguë d’origine vasculaire avec développement rapid ou soudain des symptômes et des signes, correspondant à la participation des principaux domaines d’action dans le cerveau »1,2. Il existe deux types d’AVC : hémorragique et ischémique. Lorsque la dysfonction vasculaire est causée par un anévrisme ou une défectuosité artério-veineuse, accompagné d’affaiblissement postérieur de rupture d’une artère, il s’agit alors d’accident vasculaire cérébral hémorragique3 qui, dans la plupart des cas, conduit à la mort. Lorsqu’un thrombus ou une embolie fait obstacle à la circulation sanguine, provoquant une privation temporaire d’oxygène et de glucose à une région du cerveau, il est appelé accident vasculaire cérébral ischémique4. Incapacité à nourrir les cellules autour de la zone touchée ou ischémique de base conduit à un déséquilibre métabolique et homéostatique, dysfonction énergique, la mort neuronale et inflammation5, qui peut entraîner une invalidité permanente chez les patients6.
Accident vasculaire cérébral ischémique est une lésion multifactorielle impliquant plusieurs types de cellules qui réagissent et exercent leurs effets à des moments différents. De nombreuses interactions créent un environnement difficile pour étudier le comportement des cellules individuelles. Alors, Comment étudier la contribution d’un type de cellule spécifique dans un environnement aussi complex ? Un modèle accepté in vitro de l’ischémie se compose d’exposition des cellules à la privation d’oxygène et de glucose (AMG), pendant une certaine période, suivie par la restauration des cellules à un environnement normoxiques. Ce système simule un accident ischémique cérébral, suivi d’une reperfusion artérielle. Dans cette méthode, cellules ou tissus sont exposés à un média sans glucose dans un environnement purgé de l’oxygène, en utilisant une chambre hypoxique spécialisée. Le temps d’incubation AMG peut varier de quelques minutes jusqu’à 24 h, selon l’hypothèse qui veut être testé. Des études ont montré que, selon les temps des autres ministères et normoxique environnement, phénotypes spécifiques d’accident vasculaire cérébral (c.-à-d., aiguë ou subchronique) peut être réalisé. Des astrocytes primaires isolées, exposés à d’autres ministères à restauration postérieure à conditions normoxiques, est un modèle cellulaire bien étudié pour imiter course in vitro7. À l’aide d’autres ministères est possible de révéler les mécanismes moléculaires indépendantes des cellules isolées dans un environnement de type accident vasculaire cérébral.
Comme nos connaissances de la biologie de l’astrocyte augmente, il est devenu évident qu’ils sont essentiels pour le maintien des synapses et soutenir la réparation, le développement et la plasticité neurale8. Dans des conditions normales, les astrocytes libèrent et répondent aux cytokines, chimiokines, facteurs de croissance et gliotransmetteurs, garder l’équilibre métabolique et l’homéostasie au sein de synapses5,9. En neuro-inflammation aiguë, comme l’accident vasculaire cérébral ischémique, ces cellules peuvent devenir réactives, montrent une surexpression à long terme de protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) et montrent une hypertrophie dans leur morphologie5,10, 11 , 12. comme l’infarctus ischémique se développe, l’homéostasie fourni par les astrocytes devient affectée, ce qui concerne l’absorption normale de glutamate, métabolisme énergétique, l’échange des molécules actives et anti-oxydant activité13.
Astrocytes réactivées prolifèrent autour du tissu de l’infarctus, tandis que les leucocytes migrent vers la zone lésés14. Astrocytes prolifération peut être mesurée à l’aide de marqueurs comme antigène nucléaire de prolifération cellulaire (PCNA), Ki67 et bromodéoxyuridine (BrdU)15. Cette réponse proliférative est générée de façon dépendante du temps, et il contribue à former la cicatrice gliale, un tableau des astrocytes irréversiblement réactives le long du parenchyme du site endommagé après une blessure9. Une des fonctions premières de cette cicatrice est de limiter l’extravasation de cellules immunitaires dans cette région. Toutefois, des études ont montré que la cicatrice devienne un obstacle physique d’axones étendre, car ils libèrent des molécules inhibant la croissance axonale et créer une barrière physique qui empêche que les axones s’étendant autour de la zone lésée16. Néanmoins, il existe des preuves scientifiques montrant qu’après une blessure de la moelle épinière, complètement éviter la formation de la cicatrice gliale peut nuire à la régénération des axones17. Ainsi, le contexte dans lequel la réponse astrocytaires spécifique est mesuré, doit être considéré sur le cadre de la lésion étudié.
La méthodologie présentée peut être appliquée à l’étude de la fonction individualisée des astrocytes après la privation d’oxygène glucose et elle peut être modifiée selon les questions que le chercheur veut répondre. Par exemple, outre les changements morphologiques et les marqueurs exprimés à des moments différents ministères, les surnageants d’astrocytes exposés à d’autres ministères peuvent être davantage analysés afin d’identifier des facteurs solubles libérées par ces cellules, ou utilisé comme un milieux conditionnés pour évaluer ses effet dans d’autres cellules du cerveau. Cette approche permet aux études sur la réactivité d’astrocyte qui pourraient mener à l’élucidation des facteurs qui régissent et modulent leur réponse dans un scénario d’accident ischémique cérébral.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole décrit l’isolement des astrocytes des cortex de rat. Dans cette méthode, il est essentiel pour diminuer la contamination avec d’autres types cellulaires comme les microglies, oligodendrocytes et fibroblastes. Pour réduire le nombre de cellules microgliales, plusieurs mesures peuvent être prises : changer les médias, orbitale secouant et traitements chimiques. Une fois que la pureté de la culture est confirmée par immunofluorescence à l’aide de marqueurs cellulaires sélectifs ou pour les princ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs veulent remercier Paola López Pieraldi pour l’assistance technique. A.H.M. est reconnaissante pour les subventions 8G12MD007600 et U54-NS083924 pris en charge de cette publication. Nous remercions NIH-NIMHD-G12-MD007583 subvention pour la prise en charge de l’installation. D.E.R.A. est reconnaissante de la bourse de recherche fourni par NIHNIGMS-R25GM110513. Nous sommes reconnaissants pour l’utilisation de l’espace commun d’Instrumentation et de l’aide du Dr Priscila Sanabria pour l’utilisation de la facilité d’imagerie optique du programme RCMI par grant G12MD007583. En outre, nous tenons à remercier Jose Padilla pour son rôle remarquable dans le tournage et le montage du protocole visuel.
Materials
| Instruments for Surgery – Step 1 | |||
| Operating scissor 5.5” | Roboz Company | RS-6812 | Tools used to decapitate the rats. |
| Curved forceps 7” | Roboz Company | RS-5271 | Holds the skin of the rat while the skull is removed. |
| Micro-dissecting scissors 4” | Roboz Company | RS-5882 | Cuts both the skin and skull of the rat. |
| Micro-dissecting forceps 4” angled, fine sharp | Roboz Company | RS-5095 | Holds the skin of the rat while the skull is removed. |
| Micro-dissecting forceps 4” slightly curved 0.8 | Roboz Company | RS-5135 | Tool used to separate cortices. |
| Micro-dissecting tweezers | Roboz Company | RS-4972 | Peels brain meninges. |
| Dissection microscope | Olympus | SZX16 | Important for removing the meninge from the cortices. |
| DMEM Preparation – step 2 | |||
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | GibCo. Company | 11995-065 | Supports the growth of cells. |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich Company | S7277 | Supplement for the cell culture media. |
| Fetal bovine serum (FBS) | GibCo. Company | 10437-010 | Serum-supplement for the cell culture. |
| Penicillin-Streptomycin | GibCo. Company | 15140-148 | Inhibits the growth of bacterias in the cell culture. |
| Filter System 1L with 0.22um pore | Corning | 431098 | |
| Astrocyte culture – step 3 | |||
| Serological pipets 5mL | VWR | 89130-896 | To pipette DMEM to containers with cells. |
| Serological pipets 10mL | VWR | 89130-898 | To pipette DMEM to containers with cells. |
| Serological pipets 25mL | VWR | 89130-900 | To pipette DMEM to containers with cells. |
| Centrifuge conical tube 15mL | Santa Cruz Biotechnology | sc-200250 | |
| Safe-lock tube 1.5mL | Eppendorf | 022363204 | |
| Barrier Tips 200 uL | Santa Cruz Biotechnology | sc-201725 | |
| Barrier Tips 1 mL | Santa Cruz Biotechnology | sc-201727 | |
| Biohazard Orange Bag 14 x 19" | VWR | 14220-048 | |
| 60mm petri dishes | Falcon | 351007 | |
| Sterile gauze pads | Honeywell Safety | 89133-086 | |
| Stomacher 80 Biomaster | Sewar Lab System | 030010019 | Triturate the brain tissue. |
| Stomacher 80 Blender Sterile Bags | Sewar Lab System | BA6040 | Sterile bag for the stomacher cell homogenizer. |
| Beaker 400mL | Pyrex | 1000 | |
| Sterile cell dissociation sieve, mesh #60 | Sigma-Aldrich Company | S1020 | To obtain a uniform single cell suspension. |
| Sterile cell dissociation sieve, mesh #100 | Sigma-Aldrich Company | S3895 | To obtain a uniform single cell suspension. |
| Invert phase microscope | Nikon | Eclypse Ti-S | Verify cells for contamination or abnormal cell growth. |
| 75cm2 sterile flasks | Falcon | 353136 | |
| Multi-well plate | Falcon | 353046 | |
| Micro cover glasses (coverslips), 18mm, round | VWR | 48380-046 | |
| Bright-Line hemacytometer | Sigma-Aldrich Company | Z359629 | |
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| Ethyl alcohol | Sigma-Aldrich Company | E7023 | |
| L-leucine methyl ester hydrochloride 98% (LME) | Sigma-Aldrich Company | L1002 | Promotes the elimination of microglia cells in the primary cortical astrocyte cultutre. |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside (Ara-C) | Sigma-Aldrich Company | C1768 | |
| Poly-D-Lysine Hydrobromide, mol wt 70,000-150,000 | Sigma-Aldrich Company | P0899 | |
| Trypsin/EDTA | GibCo. Company | 15400-054 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich Company | T8154 | |
| Phosphate buffer saline (PBS) tablets | Calbiochem | 524650 | |
| Sterile Water | Sigma-Aldrich Company | W3500 | |
| OGD Medium Preparation – step 5 | |||
| Centrifuge conical tube 50 mL | VWR | 89039-658 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium-free glucose | Sigma-Aldrich Company | D5030 | Supports the growth of cells. |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich Company | S7277 | Supplement for the cell culture media. |
| Penicillin-Streptomycin | GibCo. Company | 15140-148 | Inhibits the growth of bacterias in the cell culture. |
| 200mM L-glutamine | GibCo. Company | 25030-081 | Amino acid that supplements the growth of cells. |
| Phospahet buffer saline (PBS) tablets | Calbiochem | 524650 | |
| Filter System 50mL with 0.22um pore | Corning | 430320 | |
| Centrifuge conical tube 50 mL | VWR | 89039-658 | |
| Single Flow Meter | Billups-Rothenberg | SMF3001 | Measure gas flow in oxygen purge. |
| Hypoxia Incubator Chamber | StemCell | 27310 | Generates a hypoxic environment for the cell culture. |
| Traceable Dissolved Oxygen Meter | VWR | 21800-022 | |
| 95% N2/ 5% CO2 Gas Mixture | Linde | Purges the environment of oxygen. | |
| primary astrocyte immunofluorescence – step 6 | |||
| Phosphate buffer saline (PBS) tablets | Calbiochem | 524650 | |
| Formaline Solution Neutral Buffer 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | Solution used to fix cells. |
| Methanol | Fisher | A4544 | Solution used to fix cells. |
| Non-ionic surfactant (Triton X-100) | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | GibCo. Company | 10437-010 | Serum-supplement for the cell culture. |
| Anti-NeuN | Cell Signaling | 24307 | Detects mature neurons, serves to validate the astrocytic culture. |
| Anti-PCNA | Cell Signaling | 2586 | Detects proliferating cells. |
| Propidium Iodide (PI) | Sigma-Aldrich Company | P4170 | Apoptosis staining. |
| Anti-Olig1 | Abcam | AB68105 | Detects mature oligodendrocytes. |
| Anti-Iba1+ | Wako | 016-20001 | Detects microglial cells. |
| Anti-GFAP Conjugated with Cy3 | Sigma-Aldrich Company | C9205 | Detects reactive astrocytes in the treated cells. |
| Alexa Fluor 488 | Molecular Probe Life Technology | A1101 | Anti-Mouse Secondary Antibody |
| Alexa Fluor 555 | Molecular Probe Life Technology | A21428 | Anti-Rabbit Secondary Antibody |
| 4’,6’-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich Company | D9542 | Nuclear staining |
| Confocal microscope | Olympus |
References
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