Мониторинг экзоцитоз реактивности и распространения в Vitro условиях ишемии как
Summary
Ишемического инсульта является трудным для изучения сложных событий, в котором конкретный вклад астроциты в регионе пострадавших мозга воздействию кислорода глюкозы (OGD). Эта статья знакомит методологию для получения изолированных астроциты и изучить их реактивность и распространения OGD условиях.
Abstract
Ишемический инсульт является сложный мозга травмы, вызванные тромба или эмболии, препятствующих приток крови к части мозга. Это приводит к лишению кислорода и глюкозы, который вызывает энергии неудачи и нейрональных смерти. После ишемического инсульта инсульт астроциты стать реактивной и распространяться вокруг места повреждения, как она развивается. Согласно этому сценарию трудно изучить конкретный вклад астроциты подвержена ишемии мозга регионе. Таким образом эта статья знакомит методологии для изучения первичного экзоцитоз реактивности и распространения в рамках модели в vitro ишемии как окружающей среды, называется глюкоза лишение кислорода (OGD). Астроциты были изолированы от 1-4 дня-старый новорожденных крыс и количество неспецифические Астроцитарная клеток была оценена с помощью экзоцитоз селективного маркер глиальных фибриллово кислой белка (СВМС) и ядерных окрашивания. Можно настроить период, в котором астроциты подвергаются OGD состояния, а также процент кислорода, которым они подвергаются. Эта гибкость позволяет ученым охарактеризовать продолжительность ишемического как условие в различных группах клеток в пробирке. Эта статья обсуждает таймфреймы OGD, побудить экзоцитоз реактивности, гипертрофический морфологии и распространения как измеряется иммунофлюоресценции с помощью расползанию ядерного антигена клеток (PCNA). Помимо распространения астроциты пройти энергии и окислительного стресса и реагировать OGD, выпустив растворимых факторов в среду клетки. Это средство можно собирается и используется для анализа влияния, выпущенный астроциты в первичной нейрональных культур без ячеек для взаимодействия молекул. В целом эта модель культуры главной ячейки может использоваться эффективно понять роль изолированных астроциты после травмы.
Introduction
Инсульта определяется как «острый неврологической дисфункции сосудистого происхождения с внезапным или быстрое развитие симптомов и признаков, соответствующего участия областей в мозге»1,2. Существует два типа инсульта: геморрагический и ишемический. При сосудистой дисфункции является причиной аневризмы или артериовенозных неисправности, сопровождается ослаблением с задней разрывом артерии, это называется геморрагического инсульта3 , которая, в большинстве случаев, приводит к смерти. Когда тромб или эмболии препятствует кровотока, вызывая временное лишение кислорода и глюкозы в области мозга, это называется ишемического инсульта4. Неспособность питают клетки вокруг пораженной области или ишемического ядра приводит к гомеостаза и метаболического дисбаланса, энергичный дисфункции, нейронов смерти и воспаление5, который может побудить пожизненной инвалидности для пациентов6.
Ишемический инсульт является многофакторной травмы с участием нескольких типов клеток, которые реагируют и приложить их последствия в различных временных точках. Многие взаимодействия создают сложную обстановку для изучения поведения отдельных клеток. Итак как мы изучаем вклад типа конкретной ячейки в такой сложной среде? Принятыми в vitro модель ишемии состоит из подвергая клетки к лишению кислорода и глюкозы (OGD), за определенный период, после восстановления клеток в нормоксические среде. Эта система имитирует ишемического инсульта следуют крови реперфузии. В этом методе клетки или ткани подвергаются глюкозы свободных средств массовой информации в среде, очищены от кислорода, с помощью специализированной гипоксических камеры. Время инкубации OGD может варьироваться от нескольких минут до 24 часов, в зависимости от гипотезы, что хочет быть протестированы. Исследования показали, что в зависимости от времена OGD и нормоксические среды, конкретных фенотипов инсульта (т.е., острой и подострой) может быть достигнуто. Первичный изолированных астроциты, подвергается OGD с задней реставрации нормоксические условий, является хорошо изученных сотовой модель для имитации инсульта в пробирке7. С помощью OGD можно выявить независимых молекулярные механизмы изолированных клеток под инсульта-среде.
Как наши знания биологии экзоцитоз увеличивается, становится очевидным, что они имеют решающее значение для поддержания синапсов и поддержания для ремонта, развития и пластичности нейронных8. В нормальных условиях астроциты релиз и реагировать цитокины, chemokines, факторы роста и gliotransmitters, сохраняя Метаболик баланс и гомеостаза в синапсах5,9. В острых neuroinflammation, таких как ишемического инсульта эти клетки могут стать реактивной, показать долгосрочный гиперэкспрессия глиальных фибриллово кислой белка (СВМС) и показать гипертрофия в их морфология5,10, 11 , 12. по мере ишемический инфаркт гомеостаза, предоставляемые астроциты становится пострадавших, относительно нормальной глутамата поглощения, энергетический метаболизм, Обмен активных молекул и антиоксидантной активности13.
Возобновленные астроциты размножаться вокруг инфаркте ткани, а Лейкоциты мигрируют к пораженного области14. Астроцитарная распространения может быть измерена с помощью маркеров пролиферирующих клеток ядерного антигена (PCNA), Ki67 и Бромдезоксиуридин (BrdU)15. Этот пролиферативной ответ генерируется в зависимости от времени, и это помогает, образуя глиальный рубец, массив необратимо реактивной астроциты вдоль паренхиме поврежденного участка после травмы9. Одна из первоначальных функций этот шрам заключается в ограничении иммунных клеток кровоподтек из этой области. Однако исследования показали, что шрам становится физическое препятствие для аксоны продлить, как они выпустят молекул, ингибирующих аксональное рост, и создать физический барьер предотвращая расширение вокруг травмированного участка16аксоны. Тем не менее есть научные доказательства того, что после травмы спинного мозга, полностью предотвращения глиальных рубцов может ухудшить регенерации аксоны17. Таким образом контекст, в котором измеряется конкретными Астроцитарная ответ, должны рассматриваться на рамках изучал травмы.
Представлена методология может применяться для изучения индивидуального функции астроциты после кислорода глюкозы, и он может быть изменен в зависимости от которых следователь хочет ответить на вопросы. Например, помимо морфологических изменений и маркеры, выраженные в разные времена OGD, supernatants от астроциты, подвергается OGD могут быть далее проанализированы для определения растворимых факторов выпущенное эти клетки, или использоваться в качестве условных СМИ для оценки ее эффект в другие клетки мозга. Этот подход позволяет исследования на реактивность экзоцитоз, которая могла привести к выяснение факторов, которые регулируют и модулировать их ответ в случае ишемического инсульта.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол описывает изоляции астроциты из крыса коре. В этом методе важно, чтобы уменьшить загрязнение с других клеточных типов, таких как микроглии, олигодендроциты и фибробластов. Чтобы уменьшить количество микроглии, некоторые шаги могут быть предприняты: изменение средств мас?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить Паола Лопес Pieraldi для оказания технической помощи. А выражает признательность за гранты 8G12MD007600 и U54-NS083924, которые поддержали эту публикацию. Мы благодарим низ-NIMHD-G12-MD007583 Грант Фонда поддержки. D.E.R.A. благодарен за стипендий, предоставляемых NIHNIGMS-R25GM110513. Мы благодарны за использование области общего инструментария и помощи доктора Присцила Санабриа для использования оптических изображений объекта RCMI программы путем предоставления G12MD007583. Кроме того мы хотим поблагодарить за его выдающуюся роль в съемки и редактирования visual протокол Хосе Падилья.
Materials
| Instruments for Surgery – Step 1 | |||
| Operating scissor 5.5” | Roboz Company | RS-6812 | Tools used to decapitate the rats. |
| Curved forceps 7” | Roboz Company | RS-5271 | Holds the skin of the rat while the skull is removed. |
| Micro-dissecting scissors 4” | Roboz Company | RS-5882 | Cuts both the skin and skull of the rat. |
| Micro-dissecting forceps 4” angled, fine sharp | Roboz Company | RS-5095 | Holds the skin of the rat while the skull is removed. |
| Micro-dissecting forceps 4” slightly curved 0.8 | Roboz Company | RS-5135 | Tool used to separate cortices. |
| Micro-dissecting tweezers | Roboz Company | RS-4972 | Peels brain meninges. |
| Dissection microscope | Olympus | SZX16 | Important for removing the meninge from the cortices. |
| DMEM Preparation – step 2 | |||
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | GibCo. Company | 11995-065 | Supports the growth of cells. |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich Company | S7277 | Supplement for the cell culture media. |
| Fetal bovine serum (FBS) | GibCo. Company | 10437-010 | Serum-supplement for the cell culture. |
| Penicillin-Streptomycin | GibCo. Company | 15140-148 | Inhibits the growth of bacterias in the cell culture. |
| Filter System 1L with 0.22um pore | Corning | 431098 | |
| Astrocyte culture – step 3 | |||
| Serological pipets 5mL | VWR | 89130-896 | To pipette DMEM to containers with cells. |
| Serological pipets 10mL | VWR | 89130-898 | To pipette DMEM to containers with cells. |
| Serological pipets 25mL | VWR | 89130-900 | To pipette DMEM to containers with cells. |
| Centrifuge conical tube 15mL | Santa Cruz Biotechnology | sc-200250 | |
| Safe-lock tube 1.5mL | Eppendorf | 022363204 | |
| Barrier Tips 200 uL | Santa Cruz Biotechnology | sc-201725 | |
| Barrier Tips 1 mL | Santa Cruz Biotechnology | sc-201727 | |
| Biohazard Orange Bag 14 x 19" | VWR | 14220-048 | |
| 60mm petri dishes | Falcon | 351007 | |
| Sterile gauze pads | Honeywell Safety | 89133-086 | |
| Stomacher 80 Biomaster | Sewar Lab System | 030010019 | Triturate the brain tissue. |
| Stomacher 80 Blender Sterile Bags | Sewar Lab System | BA6040 | Sterile bag for the stomacher cell homogenizer. |
| Beaker 400mL | Pyrex | 1000 | |
| Sterile cell dissociation sieve, mesh #60 | Sigma-Aldrich Company | S1020 | To obtain a uniform single cell suspension. |
| Sterile cell dissociation sieve, mesh #100 | Sigma-Aldrich Company | S3895 | To obtain a uniform single cell suspension. |
| Invert phase microscope | Nikon | Eclypse Ti-S | Verify cells for contamination or abnormal cell growth. |
| 75cm2 sterile flasks | Falcon | 353136 | |
| Multi-well plate | Falcon | 353046 | |
| Micro cover glasses (coverslips), 18mm, round | VWR | 48380-046 | |
| Bright-Line hemacytometer | Sigma-Aldrich Company | Z359629 | |
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| Ethyl alcohol | Sigma-Aldrich Company | E7023 | |
| L-leucine methyl ester hydrochloride 98% (LME) | Sigma-Aldrich Company | L1002 | Promotes the elimination of microglia cells in the primary cortical astrocyte cultutre. |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside (Ara-C) | Sigma-Aldrich Company | C1768 | |
| Poly-D-Lysine Hydrobromide, mol wt 70,000-150,000 | Sigma-Aldrich Company | P0899 | |
| Trypsin/EDTA | GibCo. Company | 15400-054 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich Company | T8154 | |
| Phosphate buffer saline (PBS) tablets | Calbiochem | 524650 | |
| Sterile Water | Sigma-Aldrich Company | W3500 | |
| OGD Medium Preparation – step 5 | |||
| Centrifuge conical tube 50 mL | VWR | 89039-658 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium-free glucose | Sigma-Aldrich Company | D5030 | Supports the growth of cells. |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich Company | S7277 | Supplement for the cell culture media. |
| Penicillin-Streptomycin | GibCo. Company | 15140-148 | Inhibits the growth of bacterias in the cell culture. |
| 200mM L-glutamine | GibCo. Company | 25030-081 | Amino acid that supplements the growth of cells. |
| Phospahet buffer saline (PBS) tablets | Calbiochem | 524650 | |
| Filter System 50mL with 0.22um pore | Corning | 430320 | |
| Centrifuge conical tube 50 mL | VWR | 89039-658 | |
| Single Flow Meter | Billups-Rothenberg | SMF3001 | Measure gas flow in oxygen purge. |
| Hypoxia Incubator Chamber | StemCell | 27310 | Generates a hypoxic environment for the cell culture. |
| Traceable Dissolved Oxygen Meter | VWR | 21800-022 | |
| 95% N2/ 5% CO2 Gas Mixture | Linde | Purges the environment of oxygen. | |
| primary astrocyte immunofluorescence – step 6 | |||
| Phosphate buffer saline (PBS) tablets | Calbiochem | 524650 | |
| Formaline Solution Neutral Buffer 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | Solution used to fix cells. |
| Methanol | Fisher | A4544 | Solution used to fix cells. |
| Non-ionic surfactant (Triton X-100) | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | GibCo. Company | 10437-010 | Serum-supplement for the cell culture. |
| Anti-NeuN | Cell Signaling | 24307 | Detects mature neurons, serves to validate the astrocytic culture. |
| Anti-PCNA | Cell Signaling | 2586 | Detects proliferating cells. |
| Propidium Iodide (PI) | Sigma-Aldrich Company | P4170 | Apoptosis staining. |
| Anti-Olig1 | Abcam | AB68105 | Detects mature oligodendrocytes. |
| Anti-Iba1+ | Wako | 016-20001 | Detects microglial cells. |
| Anti-GFAP Conjugated with Cy3 | Sigma-Aldrich Company | C9205 | Detects reactive astrocytes in the treated cells. |
| Alexa Fluor 488 | Molecular Probe Life Technology | A1101 | Anti-Mouse Secondary Antibody |
| Alexa Fluor 555 | Molecular Probe Life Technology | A21428 | Anti-Rabbit Secondary Antibody |
| 4’,6’-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich Company | D9542 | Nuclear staining |
| Confocal microscope | Olympus |
References
- Goldstein, L. B., Bertels, C., Davis, J. N. Interrater reliability of the NIH stroke scale. Arch Neurol. 46 (6), 660-662 (1989).
- Hinkle, J. L., Guanci, M. M. Acute ischemic stroke review. J Neurosci Nurs. 39 (5), 285-293 (2007).
- Kassner, A., Merali, Z. Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in Stroke. Stroke. 46 (11), 3310-3315 (2015).
- Moskowitz, M. A., Lo, E. H., Iadecola, C. The science of stroke: mechanisms in search of treatments. Neuron. 67 (2), 181-198 (2010).
- Ben Haim, L., Carrillo-de Sauvage, M. A., Ceyzeriat, K., Escartin, C. Elusive roles for reactive astrocytes in neurodegenerative diseases. Front Cell Neurosci. 9, 278 (2015).
- Broderick, J., et al. Guidelines for the Management of Spontaneous Intracerebral Hemorrhage in Adults 2007 Update: A Guideline From the American Heart Association/American Stroke Association Stroke Council, High Blood Pressure Research Council, and the Quality of Care and Outcomes in Research Interdisciplinary Working Group: The American Academy of Neurology affirms the value of this guideline as an educational tool for neurologists. Stroke. 38 (6), 2001-2023 (2007).
- Wang, R., et al. Oxygen-glucose deprivation induced glial scar-like change in astrocytes. PLoS One. 7 (5), e37574 (2012).
- Sofroniew, M. V. Reactive astrocytes in neural repair and protection. The Neuroscientist. 11 (5), 400-407 (2005).
- Sofroniew, M. V., Vinters, H. V. Astrocytes: biology and pathology. Acta neuropathologica. 119 (1), 7-35 (2010).
- Souza, D. G., Bellaver, B., Souza, D. O., Quincozes-Santos, A. Characterization of adult rat astrocyte cultures. PLoS One. 8 (3), e60282 (2013).
- Puschmann, T. B., et al. HB-EGF affects astrocyte morphology, proliferation, differentiation, and the expression of intermediate filament proteins. J Neurochem. 128 (6), 878-889 (2014).
- Robinson, C., Apgar, C., Shapiro, L. A. Astrocyte Hypertrophy Contributes to Aberrant Neurogenesis after Traumatic Brain Injury. Neural Plast. , 1347987 (2016).
- Brekke, E., Berger, H. R., Wideroe, M., Sonnewald, U., Morken, T. S. Glucose and Intermediary Metabolism and Astrocyte-Neuron Interactions Following Neonatal Hypoxia-Ischemia in Rat. Neurochem Res. , (2016).
- Cekanaviciute, E., et al. Astrocytic transforming growth factor-beta signaling reduces subacute neuroinflammation after stroke in mice. Glia. 62 (8), 1227-1240 (2014).
- Zhu, Z., et al. Inhibiting cell cycle progression reduces reactive astrogliosis initiated by scratch injury in vitro and by cerebral ischemia in vivo. Glia. 55 (5), 546-558 (2007).
- Bovolenta, P., Wandosell, F., Nieto-Sampedro, M. Neurite outgrowth over resting and reactive astrocytes. Restor Neurol Neurosci. 2 (4), 221-228 (1991).
- Anderson, M. A., et al. Astrocyte scar formation aids central nervous system axon regeneration. Nature. 532 (7598), 195-200 (2016).
- Hao, C., Richardson, A., Fedoroff, S. Macrophage-like cells originate from neuroepithelium in culture: characterization and properties of the macrophage-like cells. Int J Dev Neurosci. 9 (1), 1-14 (1991).
- Saura, J. Microglial cells in astroglial cultures: a cautionary note. J Neuroinflammation. 4, 26 (2007).
- Giulian, D., Baker, T. J. Characterization of ameboid microglia isolated from developing mammalian brain. J Neurosci. 6 (8), 2163-2178 (1986).
- Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. J Vis Exp. (71), (2013).
- Armstrong, R. C. Isolation and characterization of immature oligodendrocyte lineage cells. Methods. 16 (3), 282-292 (1998).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85 (3), 890-902 (1980).
- Pont-Lezica, L., Colasse, S., Bessis, A. Depletion of microglia from primary cellular cultures. Methods Mol Biol. 1041, 55-61 (2013).
- Svensson, M., Aldskogius, H. Synaptic density of axotomized hypoglossal motorneurons following pharmacological blockade of the microglial cell proliferation. Exp Neurol. 120 (1), 123-131 (1993).
- Wong, V. K., Shapourifar-Tehrani, S., Kitada, S., Choo, P. H., Lee, D. A. Inhibition of rabbit ocular fibroblast proliferation by 5-fluorouracil and cytosine arabinoside. J Ocul Pharmacol. 7 (1), 27-39 (1991).
- Nakatsuji, Y., Miller, R. H. Density dependent modulation of cell cycle protein expression in astrocytes. J Neurosci Res. 66 (3), 487-496 (2001).
- Reeves, J. P. Accumulation of amino acids by lysosomes incubated with amino acid methyl esters. J Biol Chem. 254 (18), 8914-8921 (1979).
- Thiele, D. L., Kurosaka, M., Lipsky, P. E. Phenotype of the accessory cell necessary for mitogen-stimulated T and B cell responses in human peripheral blood: delineation by its sensitivity to the lysosomotropic agent, L-leucine methyl ester. J Immunol. 131 (5), 2282-2290 (1983).
- Hamby, M. E., Uliasz, T. F., Hewett, S. J., Hewett, J. A. Characterization of an improved procedure for the removal of microglia from confluent monolayers of primary astrocytes. J Neurosci Methods. 150 (1), 128-137 (2006).
- Corvalan, V., Cole, R., de Vellis, J., Hagiwara, S. Neuronal modulation of calcium channel activity in cultured rat astrocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (11), 4345-4348 (1990).
- Butler, I. B., Schoonen, M. A., Rickard, D. T. Removal of dissolved oxygen from water: A comparison of four common techniques. Talanta. 41 (2), 211-215 (1994).
- Tasca, C. I., Dal-Cim, T., Cimarosti, H. In vitro oxygen-glucose deprivation to study ischemic cell death. Methods Mol Biol. 1254, 197-210 (2015).
- Wu, D., Yotnda, P. Induction and testing of hypoxia in cell culture. J Vis Exp. (54), (2011).
- Rivera-Aponte, D., et al. Hyperglycemia reduces functional expression of astrocytic Kir4. 1 channels and glial glutamate uptake. Neuroscience. 310, 216-223 (2015).
- Berger, R., Garnier, Y., Pfeiffer, D., Jensen, A. Lipopolysaccharides do not alter metabolic disturbances in hippocampal slices of fetal guinea pigs after oxygen-glucose deprivation. Pediatric research. 48 (4), 531-535 (2000).
- Anderson, T. R., Jarvis, C. R., Biedermann, A. J., Molnar, C., Andrew, R. D. Blocking the anoxic depolarization protects without functional compromise following simulated stroke in cortical brain slices. Journal of neurophysiology. 93 (2), 963-979 (2005).
- Jarvis, C. R., Anderson, T. R., Andrew, R. D. Anoxic depolarization mediates acute damage independent of glutamate in neocortical brain slices. Cerebral Cortex. 11 (3), 249-259 (2001).
