Toezicht Astrocyt reactiviteit en proliferatie in Vitro ischemische-achtige omstandigheden
Summary
Ischemische beroerte is een complexe gebeurtenis waarin de specifieke bijdrage van astrocyten naar de hersenen van de getroffen regio blootgesteld aan zuurstof glucose ontbering (OGD) moeilijk te bestuderen. Dit artikel introduceert een methodologie voor het verkrijgen van geïsoleerde astrocyten en studeren hun reactiviteit en de proliferatie onder voorwaarden van OGD.
Abstract
Ischemische beroerte is een complexe hersenletsel veroorzaakt door een trombus of embolus obstructie van de bloedstroom naar delen van de hersenen. Dit leidt tot verval van zuurstof en glucose, waardoor energie falen en neuronale dood. Na een ischemische beroerte belediging, astrocyten worden reactieve en vermenigvuldigen rond de site schade als het zich ontwikkelt. In dit scenario is het moeilijk om te bestuderen van de specifieke bijdrage van astrocyten naar de regio van de hersenen blootgesteld aan ischemie. Dit artikel introduceert daarom een methodologie om te bestuderen van primaire Astrocyt reactiviteit en proliferatie onder een in vitro model van een ischemie-achtige omgeving, zuurstof glucose ontbering (OGD) genoemd. Astrocyten werden geïsoleerd vanaf dag 1-4-oude neonatale ratten en het aantal niet-specifieke astrocytic cellen werd beoordeeld met behulp van Astrocyt selectieve marker gliale Fibrillary zuur eiwit (GFAP) en nucleaire kleuring. De periode waarin astrocyten zijn onderworpen aan de voorwaarde van OGD kan worden aangepast, evenals het percentage zuurstof, die ze worden blootgesteld aan. Deze flexibiliteit kan wetenschappers te karakteriseren van de duur van de conditie van de ischemische-achtige in verschillende groepen van cellen in vitro. Dit artikel bespreekt de termijnen van OGD die induceren Astrocyt reactiviteit, hypertrofische morfologie en proliferatie zoals gemeten door immunofluorescentie prolifererende Cell Nuclear Antigen (PCNA) gebruiken. Naast de proliferatie, astrocyten ondergaan energie en oxidatieve stress en te reageren op OGD door het vrijgeven van oplosbare factoren in het medium van de cel. Dit medium kan worden verzameld en gebruikt voor het analyseren van de gevolgen van moleculen uitgebracht door astrocyten bij primaire neuronale culturen zonder tussenkomst van de cel-naar-cel. Kortom, kan dit primaire cel cultuur model efficiënt worden gebruikt om te begrijpen van de rol van geïsoleerde astrocyten bij schade.
Introduction
Beroerte wordt gedefinieerd als “een acute neurologische dysfunctie van vasculaire oorsprong met plotselinge of snelle ontwikkeling van symptomen en tekenen, overeenkomt met de betrokkenheid van de speerpunten in de hersenen”1,2. Er zijn twee types van een beroerte: hemorragische en ischemische. Wanneer vasculaire dysfunctie wordt veroorzaakt door een aneurysma of een Arterioveneuze storing, vergezeld van verzwakking met posterieure breuk van een slagader, heet dit hemorragische beroerte3 die in de meeste gevallen tot de dood leidt. Wanneer een trombose of een embolus belemmert de bloedstroom, waardoor een tijdelijke vrijheidsberoving van zuurstof en glucose naar een regio van de hersenen, het heet ischemische beroerte4. Falen om te voeden cellen rond het getroffen gebied of ischemische kern leidt tot een homeostatische en metabole onbalans, energieke dysfunctie, neuronale dood en ontsteking5, die een levenslange handicap voor patiënten6kan veroorzaken.
Ischemische beroerte is een multifactoriële verwonding waarbij verschillende soorten cellen die reageren en het uitoefenen van hun effecten op verschillende tijdstippen. Veel interacties maken een moeilijke omgeving om te bestuderen het gedrag van afzonderlijke cellen. Dus, hoe we het bestuderen van de bijdrage van een bepaalde celtype in zo’n complexe omgeving? Een aanvaarde in vitro model van ischemie bestaat voor het blootstellen van cellen aan deprivatie van zuurstof en glucose (OGD), voor een bepaalde periode, gevolgd door het herstel van cellen naar een normoxic omgeving. Dit systeem simuleert een ischemische beroerte gevolgd door bloed reperfusie. Bij deze methode worden de cellen of weefsels blootgesteld aan een glucose-vrije media in een omgeving gezuiverd van zuurstof, met behulp van een gespecialiseerde hypoxische kamer. De incubatietijd van OGD kan variëren van een paar minuten tot 24u, afhankelijk van de hypothese dat wil worden getest. Studies hebben aangetoond dat afhankelijk van de tijden van OGD en normoxic omgeving, specifieke fenotypen van een beroerte (d.w.z., acute of subchronische) kan worden bereikt. Primaire geïsoleerde astrocyten, blootgesteld aan OGD met de achterste restauratie in normoxic voorwaarden, is een goed bestudeerde cellulaire model na te bootsen beroerte in vitro7. Met behulp van OGD is mogelijk te onthullen van de onafhankelijke moleculaire mechanismen van geïsoleerde cellen onder een beroerte-achtige omgeving.
Naarmate onze kennis van de Astrocyt biologie toeneemt, is gebleken dat ze zijn van cruciaal belang voor het behoud van de synapsen en Neurale plasticiteit, reparatie en ontwikkeling8ondersteunen. Onder normale omstandigheden, astrocyten release en inspelen op de cytokines, gliotransmitters, houden van de metabolismebalans en homeostase binnen synapsen5,9, chemokines en groeifactoren. In acute neuroinflammation, zoals ischemische beroerte, kunnen deze cellen worden reactieve, tonen een langdurige overexpressie van gliale Fibrillary zuur eiwit (GFAP) en hypertrofie vertonen hun morfologie5,10, 11 , 12. zoals de ischemische infarct ontwikkelt, de homeostase geboden door astrocyten wordt beïnvloed, met betrekking tot normale glutamaat opname, energiemetabolisme, uitwisseling van actieve moleculen en anti-oxidant activiteit13.
Opnieuw geactiveerde astrocyten vermenigvuldigen rond het infarct weefsel terwijl leukocyten naar de lesioned gebied14 migreren. Astrocytic proliferatie kan worden gemeten met behulp van markeringen zoals delende cel nucleair antigeen (PCNA), Ki67 en bromodeoxyuridine (BrdU)15. Deze proliferatieve reactie wordt gegenereerd in een tijd-afhankelijke manier en het helpt vormen het gliale litteken, een matrix van onherroepelijk reactieve astrocyten langs de parenchym van de aangetaste locatie na een letsel-9. Een van de oorspronkelijke functies van dit litteken is het beperken van de immuun cel extravasation van dit gebied. Studies hebben echter aangetoond dat het litteken een fysieke belemmering voor axonen uit te breiden wordt, als ze vrijkomen moleculen remming van axonale groei, en maken een fysieke barrière axonen uit te breiden rond de gewonde gebied16voorkomen. Er is echter wetenschappelijk bewijs waaruit blijkt dat na een dwarslaesie, volledig voorkomen gliale littekenvorming kan afbreuk doen aan de regeneratie van axonen17. Dus, de context waarin de specifieke astrocytic reactie wordt gemeten, moet rekening worden gehouden bij het kader van het letsel studeerde.
De voorgestelde methodologie kan worden toegepast om te bestuderen van de geïndividualiseerde functie van astrocyten na zuurstof glucose ontbering en het kan worden aangepast afhankelijk van de vragen die de onderzoeker wil beantwoorden. Bijvoorbeeld, naast de morfologische verandering en de markeertekens uitgedrukt op verschillende tijdstippen van OGD, het supernatant van astrocyten blootgesteld aan OGD kunnen worden verder geanalyseerd om te achterhalen oplosbare factoren uitgebracht door deze cellen, of als een geconditioneerde media gebruikt ter beoordeling van de effect in andere hersencellen. Deze aanpak kan studies over Astrocyt reactiviteit die kunnen leiden tot het ontrafelen van de factoren die ten grondslag liggen en moduleren van hun reactie in een scenario met ischemische beroerte.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol beschrijft het isolement van astrocyten van rat cortices. In deze methode is het cruciaal belang voor het verminderen van de verontreiniging met andere cellulaire soorten zoals oligodendrocyten, microglia en fibroblasten. Verklein het aantal microglia en verschillende stappen kunnen worden genomen: de media, orbital schudden en chemische behandelingen wijzigen. Zodra de zuiverheid van de cultuur wordt bevestigd door immunofluorescentie met behulp van selectieve cellulaire markeringen of voor de meest promine…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen Paola López Pieraldi dank voor de technische bijstand. A.H.M. is dankbaar voor de subsidies 8G12MD007600 en U54-NS083924, die deze publicatie worden ondersteund. Wij danken de NIH-NIMHD-G12-MD007583 subsidie voor de ondersteuning van de faciliteit. D.E.R.A. is dankbaar voor de fellowship geboden door NIHNIGMS-R25GM110513. We zijn dankbaar voor het gebruik van de gemeenschappelijke ruimte van de instrumentatie en de hulp van Dr. Priscila Sanabria voor het gebruik van de optische Imaging faciliteit van het programma van de RCMI door G12MD007583 verlenen. Wij willen bovendien Jose Padilla bedanken voor zijn uitstekende rol in filmen en bewerken van het visuele protocol.
Materials
| Instruments for Surgery – Step 1 | |||
| Operating scissor 5.5” | Roboz Company | RS-6812 | Tools used to decapitate the rats. |
| Curved forceps 7” | Roboz Company | RS-5271 | Holds the skin of the rat while the skull is removed. |
| Micro-dissecting scissors 4” | Roboz Company | RS-5882 | Cuts both the skin and skull of the rat. |
| Micro-dissecting forceps 4” angled, fine sharp | Roboz Company | RS-5095 | Holds the skin of the rat while the skull is removed. |
| Micro-dissecting forceps 4” slightly curved 0.8 | Roboz Company | RS-5135 | Tool used to separate cortices. |
| Micro-dissecting tweezers | Roboz Company | RS-4972 | Peels brain meninges. |
| Dissection microscope | Olympus | SZX16 | Important for removing the meninge from the cortices. |
| DMEM Preparation – step 2 | |||
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | GibCo. Company | 11995-065 | Supports the growth of cells. |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich Company | S7277 | Supplement for the cell culture media. |
| Fetal bovine serum (FBS) | GibCo. Company | 10437-010 | Serum-supplement for the cell culture. |
| Penicillin-Streptomycin | GibCo. Company | 15140-148 | Inhibits the growth of bacterias in the cell culture. |
| Filter System 1L with 0.22um pore | Corning | 431098 | |
| Astrocyte culture – step 3 | |||
| Serological pipets 5mL | VWR | 89130-896 | To pipette DMEM to containers with cells. |
| Serological pipets 10mL | VWR | 89130-898 | To pipette DMEM to containers with cells. |
| Serological pipets 25mL | VWR | 89130-900 | To pipette DMEM to containers with cells. |
| Centrifuge conical tube 15mL | Santa Cruz Biotechnology | sc-200250 | |
| Safe-lock tube 1.5mL | Eppendorf | 022363204 | |
| Barrier Tips 200 uL | Santa Cruz Biotechnology | sc-201725 | |
| Barrier Tips 1 mL | Santa Cruz Biotechnology | sc-201727 | |
| Biohazard Orange Bag 14 x 19" | VWR | 14220-048 | |
| 60mm petri dishes | Falcon | 351007 | |
| Sterile gauze pads | Honeywell Safety | 89133-086 | |
| Stomacher 80 Biomaster | Sewar Lab System | 030010019 | Triturate the brain tissue. |
| Stomacher 80 Blender Sterile Bags | Sewar Lab System | BA6040 | Sterile bag for the stomacher cell homogenizer. |
| Beaker 400mL | Pyrex | 1000 | |
| Sterile cell dissociation sieve, mesh #60 | Sigma-Aldrich Company | S1020 | To obtain a uniform single cell suspension. |
| Sterile cell dissociation sieve, mesh #100 | Sigma-Aldrich Company | S3895 | To obtain a uniform single cell suspension. |
| Invert phase microscope | Nikon | Eclypse Ti-S | Verify cells for contamination or abnormal cell growth. |
| 75cm2 sterile flasks | Falcon | 353136 | |
| Multi-well plate | Falcon | 353046 | |
| Micro cover glasses (coverslips), 18mm, round | VWR | 48380-046 | |
| Bright-Line hemacytometer | Sigma-Aldrich Company | Z359629 | |
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| Ethyl alcohol | Sigma-Aldrich Company | E7023 | |
| L-leucine methyl ester hydrochloride 98% (LME) | Sigma-Aldrich Company | L1002 | Promotes the elimination of microglia cells in the primary cortical astrocyte cultutre. |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside (Ara-C) | Sigma-Aldrich Company | C1768 | |
| Poly-D-Lysine Hydrobromide, mol wt 70,000-150,000 | Sigma-Aldrich Company | P0899 | |
| Trypsin/EDTA | GibCo. Company | 15400-054 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich Company | T8154 | |
| Phosphate buffer saline (PBS) tablets | Calbiochem | 524650 | |
| Sterile Water | Sigma-Aldrich Company | W3500 | |
| OGD Medium Preparation – step 5 | |||
| Centrifuge conical tube 50 mL | VWR | 89039-658 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium-free glucose | Sigma-Aldrich Company | D5030 | Supports the growth of cells. |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich Company | S7277 | Supplement for the cell culture media. |
| Penicillin-Streptomycin | GibCo. Company | 15140-148 | Inhibits the growth of bacterias in the cell culture. |
| 200mM L-glutamine | GibCo. Company | 25030-081 | Amino acid that supplements the growth of cells. |
| Phospahet buffer saline (PBS) tablets | Calbiochem | 524650 | |
| Filter System 50mL with 0.22um pore | Corning | 430320 | |
| Centrifuge conical tube 50 mL | VWR | 89039-658 | |
| Single Flow Meter | Billups-Rothenberg | SMF3001 | Measure gas flow in oxygen purge. |
| Hypoxia Incubator Chamber | StemCell | 27310 | Generates a hypoxic environment for the cell culture. |
| Traceable Dissolved Oxygen Meter | VWR | 21800-022 | |
| 95% N2/ 5% CO2 Gas Mixture | Linde | Purges the environment of oxygen. | |
| primary astrocyte immunofluorescence – step 6 | |||
| Phosphate buffer saline (PBS) tablets | Calbiochem | 524650 | |
| Formaline Solution Neutral Buffer 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | Solution used to fix cells. |
| Methanol | Fisher | A4544 | Solution used to fix cells. |
| Non-ionic surfactant (Triton X-100) | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | GibCo. Company | 10437-010 | Serum-supplement for the cell culture. |
| Anti-NeuN | Cell Signaling | 24307 | Detects mature neurons, serves to validate the astrocytic culture. |
| Anti-PCNA | Cell Signaling | 2586 | Detects proliferating cells. |
| Propidium Iodide (PI) | Sigma-Aldrich Company | P4170 | Apoptosis staining. |
| Anti-Olig1 | Abcam | AB68105 | Detects mature oligodendrocytes. |
| Anti-Iba1+ | Wako | 016-20001 | Detects microglial cells. |
| Anti-GFAP Conjugated with Cy3 | Sigma-Aldrich Company | C9205 | Detects reactive astrocytes in the treated cells. |
| Alexa Fluor 488 | Molecular Probe Life Technology | A1101 | Anti-Mouse Secondary Antibody |
| Alexa Fluor 555 | Molecular Probe Life Technology | A21428 | Anti-Rabbit Secondary Antibody |
| 4’,6’-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich Company | D9542 | Nuclear staining |
| Confocal microscope | Olympus |
References
- Goldstein, L. B., Bertels, C., Davis, J. N. Interrater reliability of the NIH stroke scale. Arch Neurol. 46 (6), 660-662 (1989).
- Hinkle, J. L., Guanci, M. M. Acute ischemic stroke review. J Neurosci Nurs. 39 (5), 285-293 (2007).
- Kassner, A., Merali, Z. Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in Stroke. Stroke. 46 (11), 3310-3315 (2015).
- Moskowitz, M. A., Lo, E. H., Iadecola, C. The science of stroke: mechanisms in search of treatments. Neuron. 67 (2), 181-198 (2010).
- Ben Haim, L., Carrillo-de Sauvage, M. A., Ceyzeriat, K., Escartin, C. Elusive roles for reactive astrocytes in neurodegenerative diseases. Front Cell Neurosci. 9, 278 (2015).
- Broderick, J., et al. Guidelines for the Management of Spontaneous Intracerebral Hemorrhage in Adults 2007 Update: A Guideline From the American Heart Association/American Stroke Association Stroke Council, High Blood Pressure Research Council, and the Quality of Care and Outcomes in Research Interdisciplinary Working Group: The American Academy of Neurology affirms the value of this guideline as an educational tool for neurologists. Stroke. 38 (6), 2001-2023 (2007).
- Wang, R., et al. Oxygen-glucose deprivation induced glial scar-like change in astrocytes. PLoS One. 7 (5), e37574 (2012).
- Sofroniew, M. V. Reactive astrocytes in neural repair and protection. The Neuroscientist. 11 (5), 400-407 (2005).
- Sofroniew, M. V., Vinters, H. V. Astrocytes: biology and pathology. Acta neuropathologica. 119 (1), 7-35 (2010).
- Souza, D. G., Bellaver, B., Souza, D. O., Quincozes-Santos, A. Characterization of adult rat astrocyte cultures. PLoS One. 8 (3), e60282 (2013).
- Puschmann, T. B., et al. HB-EGF affects astrocyte morphology, proliferation, differentiation, and the expression of intermediate filament proteins. J Neurochem. 128 (6), 878-889 (2014).
- Robinson, C., Apgar, C., Shapiro, L. A. Astrocyte Hypertrophy Contributes to Aberrant Neurogenesis after Traumatic Brain Injury. Neural Plast. , 1347987 (2016).
- Brekke, E., Berger, H. R., Wideroe, M., Sonnewald, U., Morken, T. S. Glucose and Intermediary Metabolism and Astrocyte-Neuron Interactions Following Neonatal Hypoxia-Ischemia in Rat. Neurochem Res. , (2016).
- Cekanaviciute, E., et al. Astrocytic transforming growth factor-beta signaling reduces subacute neuroinflammation after stroke in mice. Glia. 62 (8), 1227-1240 (2014).
- Zhu, Z., et al. Inhibiting cell cycle progression reduces reactive astrogliosis initiated by scratch injury in vitro and by cerebral ischemia in vivo. Glia. 55 (5), 546-558 (2007).
- Bovolenta, P., Wandosell, F., Nieto-Sampedro, M. Neurite outgrowth over resting and reactive astrocytes. Restor Neurol Neurosci. 2 (4), 221-228 (1991).
- Anderson, M. A., et al. Astrocyte scar formation aids central nervous system axon regeneration. Nature. 532 (7598), 195-200 (2016).
- Hao, C., Richardson, A., Fedoroff, S. Macrophage-like cells originate from neuroepithelium in culture: characterization and properties of the macrophage-like cells. Int J Dev Neurosci. 9 (1), 1-14 (1991).
- Saura, J. Microglial cells in astroglial cultures: a cautionary note. J Neuroinflammation. 4, 26 (2007).
- Giulian, D., Baker, T. J. Characterization of ameboid microglia isolated from developing mammalian brain. J Neurosci. 6 (8), 2163-2178 (1986).
- Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. J Vis Exp. (71), (2013).
- Armstrong, R. C. Isolation and characterization of immature oligodendrocyte lineage cells. Methods. 16 (3), 282-292 (1998).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85 (3), 890-902 (1980).
- Pont-Lezica, L., Colasse, S., Bessis, A. Depletion of microglia from primary cellular cultures. Methods Mol Biol. 1041, 55-61 (2013).
- Svensson, M., Aldskogius, H. Synaptic density of axotomized hypoglossal motorneurons following pharmacological blockade of the microglial cell proliferation. Exp Neurol. 120 (1), 123-131 (1993).
- Wong, V. K., Shapourifar-Tehrani, S., Kitada, S., Choo, P. H., Lee, D. A. Inhibition of rabbit ocular fibroblast proliferation by 5-fluorouracil and cytosine arabinoside. J Ocul Pharmacol. 7 (1), 27-39 (1991).
- Nakatsuji, Y., Miller, R. H. Density dependent modulation of cell cycle protein expression in astrocytes. J Neurosci Res. 66 (3), 487-496 (2001).
- Reeves, J. P. Accumulation of amino acids by lysosomes incubated with amino acid methyl esters. J Biol Chem. 254 (18), 8914-8921 (1979).
- Thiele, D. L., Kurosaka, M., Lipsky, P. E. Phenotype of the accessory cell necessary for mitogen-stimulated T and B cell responses in human peripheral blood: delineation by its sensitivity to the lysosomotropic agent, L-leucine methyl ester. J Immunol. 131 (5), 2282-2290 (1983).
- Hamby, M. E., Uliasz, T. F., Hewett, S. J., Hewett, J. A. Characterization of an improved procedure for the removal of microglia from confluent monolayers of primary astrocytes. J Neurosci Methods. 150 (1), 128-137 (2006).
- Corvalan, V., Cole, R., de Vellis, J., Hagiwara, S. Neuronal modulation of calcium channel activity in cultured rat astrocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (11), 4345-4348 (1990).
- Butler, I. B., Schoonen, M. A., Rickard, D. T. Removal of dissolved oxygen from water: A comparison of four common techniques. Talanta. 41 (2), 211-215 (1994).
- Tasca, C. I., Dal-Cim, T., Cimarosti, H. In vitro oxygen-glucose deprivation to study ischemic cell death. Methods Mol Biol. 1254, 197-210 (2015).
- Wu, D., Yotnda, P. Induction and testing of hypoxia in cell culture. J Vis Exp. (54), (2011).
- Rivera-Aponte, D., et al. Hyperglycemia reduces functional expression of astrocytic Kir4. 1 channels and glial glutamate uptake. Neuroscience. 310, 216-223 (2015).
- Berger, R., Garnier, Y., Pfeiffer, D., Jensen, A. Lipopolysaccharides do not alter metabolic disturbances in hippocampal slices of fetal guinea pigs after oxygen-glucose deprivation. Pediatric research. 48 (4), 531-535 (2000).
- Anderson, T. R., Jarvis, C. R., Biedermann, A. J., Molnar, C., Andrew, R. D. Blocking the anoxic depolarization protects without functional compromise following simulated stroke in cortical brain slices. Journal of neurophysiology. 93 (2), 963-979 (2005).
- Jarvis, C. R., Anderson, T. R., Andrew, R. D. Anoxic depolarization mediates acute damage independent of glutamate in neocortical brain slices. Cerebral Cortex. 11 (3), 249-259 (2001).
