Astrocyte reaktivite ve nükleer silahların yayılmasına karşı Vitro iskemik benzeri koşullar altında izleme
Summary
İskemik inme astrocytes etkilenen beyin bölgesi için belirli katkısını oksijen glikoz yetmezliği (OGD) maruz bir karmaşık olay çalışmaya zor olduğu. Bu makalede izole astrocytes elde etmek ve onların reaktivite ve nükleer silahların yayılmasına karşı OGD koşullar altında çalışma için bir metodoloji tanıtılmaktadır.
Abstract
İskemik inme trombüsü veya kan akımı beyin bölümlerine tıkayan embolinin kaynaklanan bir karmaşık beyin hasarı var. Bu oksijen ve enerji yetmezliği ve nöronal ölüm nedenleri glikoz yoksunluğu için yol açar. İskemik inme hakaret sonra astrocytes reaktif olmak ve bu geliştikçe yaralanma sitenin etrafına çoğalırlar. Bu senaryoda, astrocytes iskemi için maruz beyin bölgesi için belirli katkısını çalışma zordur. Bu nedenle, bu makalede birincil astrocyte reaktivite ve nükleer silahların yayılmasına karşı oksijen glikoz yetmezliği (OGD) adı verilen bir iskemi gibi ortamının bir vitro modeli altında çalışmaya bir metodoloji tanıtılmaktadır. Astrocytes 1-4 gün izole-eski yenidoğan fareler ve non-spesifik astrositik hücre sayısı değerlendirildi astrocyte seçici marker gliyal Fibrillary asidik Protein (GFAP’nin) ve nükleer boyama kullanarak. Onlar maruz kalan oksijen yüzdesi yanı sıra astrocytes OGD koşuluna tabi olan dönem özelleştirilebilir. Hücre içinde vitrofarklı grupları iskemik benzeri durumda süresince ayırdetmek bilim adamları bu esneklik sağlar. Bu makalede astrocyte reaktivite, Hipertrofik morfoloji ve Proliferasyona hücre nükleer antijen (PCNA) kullanarak ayirt tarafından ölçülen yaygın neden zaman dilimleri OGD, anlatılmaktadır. Hızla çoğalmak, yanı sıra astrocytes enerji ve oksidatif stres geçmesi ve çözünür faktörler cep orta serbest bırakarak OGD için yanıt. Bu orta toplanan ve moleküller hücre hücre etkileşimi olmadan birincil nöronal kültürde astrocytes tarafından yayımlanan etkilerini çözümlemek için kullanılır. Özet olarak, bu birincil hücre kültür model verimli bir şekilde yaralanması üzerine izole astrocytes rolünü anlamak için kullanılabilir.
Introduction
Kontur “bir akut nörolojik disfonksiyon vasküler kökenli ani veya hızlı geliştirme belirti ve bulguları, karşılık gelen beyin Fokal alanlarda katılımı ile”1,2olarak tanımlanır. Kontur iki tür vardır: Hemorajik ve iskemik. Vasküler disfonksiyon ya beyin kanaması veya posterior bir arter rüptürü ile zayıflaması tarafından eşlik arteriyovenöz bir arıza neden olduğu bu, çoğu durumda, ölüme götürecek hemorajik inme3 olarak adlandırılır. Bir trombüsü veya bir pıhtısı kan akışını engelleyen, oksijen ve glikoz bir beyin bölgesine geçici bir yoksunluk neden iskemik inme4denir. Hücrelerin etkilenen bölge veya iskemik çekirdek liderlerine homeostatik ve metabolik dengesizlik, enerjik disfonksiyon, nöronal ölüm ve inflamasyon5yaşam boyu Engelli hastalar6tetikleyebilir, etrafında beslemek için hata oluştu.
İskemik inme hücrelerin bu tepki ve uygulamak etkileri farklı zaman noktalarda çeşitli türleri içeren multifaktöriyel bir yaralanma olduğunu. Çok etkileşimleri tek tek hücreler davranışını çalışmaya zor bir ortam oluşturun. Yani, bir belirli hücre türü’nün altında karmaşık bir ortam katkısını nasıl çalışıyoruz? Bir kabul edilen vitro modeli iskemi hücrelere oksijen ve glikoz yoksunluk (OGD), açığa belirli bir süre için bir normoxic ortamına hücreleri restorasyon tarafından takip oluşur. Bu sistem tarafından kan reperfüzyon takip bir iskemik inme taklit eder. Bu yöntemde, hücre ve dokulara oksijen kullanarak özel bir hipoksik odası, tasfiye bir ortamda glikoz-Ücretsiz medya maruz kalır. OGD kuluçka süresi birkaç dakika 24’e kadar s hipotezini test edilecek istiyor bağlı olarak değişebilir. Çalışmalar bu OGD kez bağlı olarak göstermiştir ve normoxic çevre, inme (Yani, akut veya Subkronik) belirli fenotipleri elde edilebilir. Normoxic koşulları, posterior restorasyon ile OGD için maruz birincil izole astrocytes kontur tüp bebek7taklit etmek için iyi çalışılmış bir hücresel model var. OGD izole hücreler bir inme benzeri ortamı altında bağımsız moleküler mekanizmaları ortaya çıkarmak mümkündür.
Astrocyte Biyoloji ile ilgili bilgilerimizi arttıkça, onlar sinapslarda Bakımı ve sinirsel tamir, geliştirme ve plastisite8sürdürülmesi için çok önemli olduğunu belirgin olmuştur. Normal şartlarda astrocytes yayın ve sitokinler, kemokinler, büyüme faktörleri ve gliotransmitters metabolik denge ve homeostasis sinapslarda5,9içinde tutmak, yanıtlar. İskemik inme gibi akut neuroinflammation içinde bu hücreler reaktif olmak, uzun vadeli overexpression, gliyal Fibrillary asidik Protein (GFAP’nin) gösterebilir ve onların morfolojisi5,10‘, hipertrofisi göster 11 , 12. iskemik enfarktüsü geliştikçe, astrocytes tarafından sağlanan homeostazı etkilenen olur, normal Glutamat alımı, enerji metabolizması, etkin moleküller ve antioksidan aktivite13değişimi ile ilgili.
Doğru lesioned alan14lökosit göç ederken yeniden etkinleştirilen astrocytes etrafında enfarktüsü doku çoğalırlar. Astrositik yayılması Proliferasyona hücre nükleer antijen (PCNA), Ki67 ve bromodeoxyuridine (BrdU)15gibi işaretçileri kullanarak ölçülebilir. Bu proliferatif yanıt Saat-bağımlı bir şekilde oluşturulur ve gliyal yara, bir yaralanma9sonra bozuk sitesini parankimi boyunca geri dönüşümsüz reaktif astrocytes dizisi oluşturan yardımcı olur. Bu yara izi ilk işlevleri bu bölgeden bağışıklık hücre ekstravazasyonu kısıtlamaktır. Ancak, çalışmalar yara izi genişletmek, aksonlar büyüme inhibe moleküller serbest olarak ve yaralı alan16uzanan aksonlar engelleyen fiziksel bir bariyer oluşturmak aksonlar için fiziksel bir engeli olur göstermiştir. Yine de, bir omurilik yaralanması sonra tamamen gliyal yara oluşumu engelleyen aksonlar17rejenerasyon zarar olabilir olduğunu gösteren bilimsel kanıt. Böylece, belirli astrositik tepki ölçülür, okudu yaralanma framework düşünülmelidir bağlamında.
Sunulan metodoloji astrocytes bireyselleştirilmiş fonksiyonu oksijen glikoz yoksunluğu sonra eğitim için uygulanabilir ve araştırmacı cevap istiyor soruları bağlı olarak değiştirilebilir. Örneğin, morfolojik değişiklik ve farklı OGD zamanlarda ifade işaretleri yanı sıra, OGD için maruz astrocytes üzerinden supernatants daha fazla çözünür faktörler veya bu hücreler tarafından serbest şartına bir medya olarak değerlendirmek için kullanılan belirlemek için analiz edilebilir, diğer beyin hücreleri yürürlükte. Bu yaklaşım yöneten ve onların yanıt bir iskemik inme senaryo olarak modüle faktörler aydınlatma yol açabilecek astrocyte reaktivite çalışmaları sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu iletişim kuralı astrocytes sıçan cortices üzerinden yalıtım açıklar. Bu yöntemde, microglia, oligodendrocytes ve fibroblastlar gibi hücresel diğer türleri ile kirlenme azaltmak için önemlidir. Microglia sayısını azaltmak için çeşitli adımlar alınabilir: medya, orbital sallayarak ve kimyasal tedaviler değiştirme. Kültür saflık ayirt seçici hücresel işaretçileri kullanarak veya en önemli hücre kirleticiler için onaylandıktan sonra deneyler yapılabilir. Örneğin, iyonize kalsiyum ba?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Paola López Pieraldi teknik yardım için teşekkür etmek istiyorum. A.H.M. hibe 8G12MD007600 ve bu yayın desteklenen U54-NS083924 için minnettar olduğunu. NIH-NIMHD-G12-MD007583 hibe tesis destek için teşekkür ediyoruz. D.E.R.A. NIHNIGMS-R25GM110513 tarafından sağlanan burs için minnettardır. Ortak araçları alan kullanım için minnettarız ve Dr Priscila Sanabria optik görüntüleme tesis tarafından RCMI programının kullanımı için yardım vermek G12MD007583. Buna ek olarak, Jose Padilla filme ve görsel iletişim kuralı düzenleme olağanüstü rolü için teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Instruments for Surgery – Step 1 | |||
| Operating scissor 5.5” | Roboz Company | RS-6812 | Tools used to decapitate the rats. |
| Curved forceps 7” | Roboz Company | RS-5271 | Holds the skin of the rat while the skull is removed. |
| Micro-dissecting scissors 4” | Roboz Company | RS-5882 | Cuts both the skin and skull of the rat. |
| Micro-dissecting forceps 4” angled, fine sharp | Roboz Company | RS-5095 | Holds the skin of the rat while the skull is removed. |
| Micro-dissecting forceps 4” slightly curved 0.8 | Roboz Company | RS-5135 | Tool used to separate cortices. |
| Micro-dissecting tweezers | Roboz Company | RS-4972 | Peels brain meninges. |
| Dissection microscope | Olympus | SZX16 | Important for removing the meninge from the cortices. |
| DMEM Preparation – step 2 | |||
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | GibCo. Company | 11995-065 | Supports the growth of cells. |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich Company | S7277 | Supplement for the cell culture media. |
| Fetal bovine serum (FBS) | GibCo. Company | 10437-010 | Serum-supplement for the cell culture. |
| Penicillin-Streptomycin | GibCo. Company | 15140-148 | Inhibits the growth of bacterias in the cell culture. |
| Filter System 1L with 0.22um pore | Corning | 431098 | |
| Astrocyte culture – step 3 | |||
| Serological pipets 5mL | VWR | 89130-896 | To pipette DMEM to containers with cells. |
| Serological pipets 10mL | VWR | 89130-898 | To pipette DMEM to containers with cells. |
| Serological pipets 25mL | VWR | 89130-900 | To pipette DMEM to containers with cells. |
| Centrifuge conical tube 15mL | Santa Cruz Biotechnology | sc-200250 | |
| Safe-lock tube 1.5mL | Eppendorf | 022363204 | |
| Barrier Tips 200 uL | Santa Cruz Biotechnology | sc-201725 | |
| Barrier Tips 1 mL | Santa Cruz Biotechnology | sc-201727 | |
| Biohazard Orange Bag 14 x 19" | VWR | 14220-048 | |
| 60mm petri dishes | Falcon | 351007 | |
| Sterile gauze pads | Honeywell Safety | 89133-086 | |
| Stomacher 80 Biomaster | Sewar Lab System | 030010019 | Triturate the brain tissue. |
| Stomacher 80 Blender Sterile Bags | Sewar Lab System | BA6040 | Sterile bag for the stomacher cell homogenizer. |
| Beaker 400mL | Pyrex | 1000 | |
| Sterile cell dissociation sieve, mesh #60 | Sigma-Aldrich Company | S1020 | To obtain a uniform single cell suspension. |
| Sterile cell dissociation sieve, mesh #100 | Sigma-Aldrich Company | S3895 | To obtain a uniform single cell suspension. |
| Invert phase microscope | Nikon | Eclypse Ti-S | Verify cells for contamination or abnormal cell growth. |
| 75cm2 sterile flasks | Falcon | 353136 | |
| Multi-well plate | Falcon | 353046 | |
| Micro cover glasses (coverslips), 18mm, round | VWR | 48380-046 | |
| Bright-Line hemacytometer | Sigma-Aldrich Company | Z359629 | |
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| Ethyl alcohol | Sigma-Aldrich Company | E7023 | |
| L-leucine methyl ester hydrochloride 98% (LME) | Sigma-Aldrich Company | L1002 | Promotes the elimination of microglia cells in the primary cortical astrocyte cultutre. |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside (Ara-C) | Sigma-Aldrich Company | C1768 | |
| Poly-D-Lysine Hydrobromide, mol wt 70,000-150,000 | Sigma-Aldrich Company | P0899 | |
| Trypsin/EDTA | GibCo. Company | 15400-054 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich Company | T8154 | |
| Phosphate buffer saline (PBS) tablets | Calbiochem | 524650 | |
| Sterile Water | Sigma-Aldrich Company | W3500 | |
| OGD Medium Preparation – step 5 | |||
| Centrifuge conical tube 50 mL | VWR | 89039-658 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium-free glucose | Sigma-Aldrich Company | D5030 | Supports the growth of cells. |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich Company | S7277 | Supplement for the cell culture media. |
| Penicillin-Streptomycin | GibCo. Company | 15140-148 | Inhibits the growth of bacterias in the cell culture. |
| 200mM L-glutamine | GibCo. Company | 25030-081 | Amino acid that supplements the growth of cells. |
| Phospahet buffer saline (PBS) tablets | Calbiochem | 524650 | |
| Filter System 50mL with 0.22um pore | Corning | 430320 | |
| Centrifuge conical tube 50 mL | VWR | 89039-658 | |
| Single Flow Meter | Billups-Rothenberg | SMF3001 | Measure gas flow in oxygen purge. |
| Hypoxia Incubator Chamber | StemCell | 27310 | Generates a hypoxic environment for the cell culture. |
| Traceable Dissolved Oxygen Meter | VWR | 21800-022 | |
| 95% N2/ 5% CO2 Gas Mixture | Linde | Purges the environment of oxygen. | |
| primary astrocyte immunofluorescence – step 6 | |||
| Phosphate buffer saline (PBS) tablets | Calbiochem | 524650 | |
| Formaline Solution Neutral Buffer 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | Solution used to fix cells. |
| Methanol | Fisher | A4544 | Solution used to fix cells. |
| Non-ionic surfactant (Triton X-100) | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | GibCo. Company | 10437-010 | Serum-supplement for the cell culture. |
| Anti-NeuN | Cell Signaling | 24307 | Detects mature neurons, serves to validate the astrocytic culture. |
| Anti-PCNA | Cell Signaling | 2586 | Detects proliferating cells. |
| Propidium Iodide (PI) | Sigma-Aldrich Company | P4170 | Apoptosis staining. |
| Anti-Olig1 | Abcam | AB68105 | Detects mature oligodendrocytes. |
| Anti-Iba1+ | Wako | 016-20001 | Detects microglial cells. |
| Anti-GFAP Conjugated with Cy3 | Sigma-Aldrich Company | C9205 | Detects reactive astrocytes in the treated cells. |
| Alexa Fluor 488 | Molecular Probe Life Technology | A1101 | Anti-Mouse Secondary Antibody |
| Alexa Fluor 555 | Molecular Probe Life Technology | A21428 | Anti-Rabbit Secondary Antibody |
| 4’,6’-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich Company | D9542 | Nuclear staining |
| Confocal microscope | Olympus |
References
- Goldstein, L. B., Bertels, C., Davis, J. N. Interrater reliability of the NIH stroke scale. Arch Neurol. 46 (6), 660-662 (1989).
- Hinkle, J. L., Guanci, M. M. Acute ischemic stroke review. J Neurosci Nurs. 39 (5), 285-293 (2007).
- Kassner, A., Merali, Z. Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in Stroke. Stroke. 46 (11), 3310-3315 (2015).
- Moskowitz, M. A., Lo, E. H., Iadecola, C. The science of stroke: mechanisms in search of treatments. Neuron. 67 (2), 181-198 (2010).
- Ben Haim, L., Carrillo-de Sauvage, M. A., Ceyzeriat, K., Escartin, C. Elusive roles for reactive astrocytes in neurodegenerative diseases. Front Cell Neurosci. 9, 278 (2015).
- Broderick, J., et al. Guidelines for the Management of Spontaneous Intracerebral Hemorrhage in Adults 2007 Update: A Guideline From the American Heart Association/American Stroke Association Stroke Council, High Blood Pressure Research Council, and the Quality of Care and Outcomes in Research Interdisciplinary Working Group: The American Academy of Neurology affirms the value of this guideline as an educational tool for neurologists. Stroke. 38 (6), 2001-2023 (2007).
- Wang, R., et al. Oxygen-glucose deprivation induced glial scar-like change in astrocytes. PLoS One. 7 (5), e37574 (2012).
- Sofroniew, M. V. Reactive astrocytes in neural repair and protection. The Neuroscientist. 11 (5), 400-407 (2005).
- Sofroniew, M. V., Vinters, H. V. Astrocytes: biology and pathology. Acta neuropathologica. 119 (1), 7-35 (2010).
- Souza, D. G., Bellaver, B., Souza, D. O., Quincozes-Santos, A. Characterization of adult rat astrocyte cultures. PLoS One. 8 (3), e60282 (2013).
- Puschmann, T. B., et al. HB-EGF affects astrocyte morphology, proliferation, differentiation, and the expression of intermediate filament proteins. J Neurochem. 128 (6), 878-889 (2014).
- Robinson, C., Apgar, C., Shapiro, L. A. Astrocyte Hypertrophy Contributes to Aberrant Neurogenesis after Traumatic Brain Injury. Neural Plast. , 1347987 (2016).
- Brekke, E., Berger, H. R., Wideroe, M., Sonnewald, U., Morken, T. S. Glucose and Intermediary Metabolism and Astrocyte-Neuron Interactions Following Neonatal Hypoxia-Ischemia in Rat. Neurochem Res. , (2016).
- Cekanaviciute, E., et al. Astrocytic transforming growth factor-beta signaling reduces subacute neuroinflammation after stroke in mice. Glia. 62 (8), 1227-1240 (2014).
- Zhu, Z., et al. Inhibiting cell cycle progression reduces reactive astrogliosis initiated by scratch injury in vitro and by cerebral ischemia in vivo. Glia. 55 (5), 546-558 (2007).
- Bovolenta, P., Wandosell, F., Nieto-Sampedro, M. Neurite outgrowth over resting and reactive astrocytes. Restor Neurol Neurosci. 2 (4), 221-228 (1991).
- Anderson, M. A., et al. Astrocyte scar formation aids central nervous system axon regeneration. Nature. 532 (7598), 195-200 (2016).
- Hao, C., Richardson, A., Fedoroff, S. Macrophage-like cells originate from neuroepithelium in culture: characterization and properties of the macrophage-like cells. Int J Dev Neurosci. 9 (1), 1-14 (1991).
- Saura, J. Microglial cells in astroglial cultures: a cautionary note. J Neuroinflammation. 4, 26 (2007).
- Giulian, D., Baker, T. J. Characterization of ameboid microglia isolated from developing mammalian brain. J Neurosci. 6 (8), 2163-2178 (1986).
- Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. J Vis Exp. (71), (2013).
- Armstrong, R. C. Isolation and characterization of immature oligodendrocyte lineage cells. Methods. 16 (3), 282-292 (1998).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85 (3), 890-902 (1980).
- Pont-Lezica, L., Colasse, S., Bessis, A. Depletion of microglia from primary cellular cultures. Methods Mol Biol. 1041, 55-61 (2013).
- Svensson, M., Aldskogius, H. Synaptic density of axotomized hypoglossal motorneurons following pharmacological blockade of the microglial cell proliferation. Exp Neurol. 120 (1), 123-131 (1993).
- Wong, V. K., Shapourifar-Tehrani, S., Kitada, S., Choo, P. H., Lee, D. A. Inhibition of rabbit ocular fibroblast proliferation by 5-fluorouracil and cytosine arabinoside. J Ocul Pharmacol. 7 (1), 27-39 (1991).
- Nakatsuji, Y., Miller, R. H. Density dependent modulation of cell cycle protein expression in astrocytes. J Neurosci Res. 66 (3), 487-496 (2001).
- Reeves, J. P. Accumulation of amino acids by lysosomes incubated with amino acid methyl esters. J Biol Chem. 254 (18), 8914-8921 (1979).
- Thiele, D. L., Kurosaka, M., Lipsky, P. E. Phenotype of the accessory cell necessary for mitogen-stimulated T and B cell responses in human peripheral blood: delineation by its sensitivity to the lysosomotropic agent, L-leucine methyl ester. J Immunol. 131 (5), 2282-2290 (1983).
- Hamby, M. E., Uliasz, T. F., Hewett, S. J., Hewett, J. A. Characterization of an improved procedure for the removal of microglia from confluent monolayers of primary astrocytes. J Neurosci Methods. 150 (1), 128-137 (2006).
- Corvalan, V., Cole, R., de Vellis, J., Hagiwara, S. Neuronal modulation of calcium channel activity in cultured rat astrocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (11), 4345-4348 (1990).
- Butler, I. B., Schoonen, M. A., Rickard, D. T. Removal of dissolved oxygen from water: A comparison of four common techniques. Talanta. 41 (2), 211-215 (1994).
- Tasca, C. I., Dal-Cim, T., Cimarosti, H. In vitro oxygen-glucose deprivation to study ischemic cell death. Methods Mol Biol. 1254, 197-210 (2015).
- Wu, D., Yotnda, P. Induction and testing of hypoxia in cell culture. J Vis Exp. (54), (2011).
- Rivera-Aponte, D., et al. Hyperglycemia reduces functional expression of astrocytic Kir4. 1 channels and glial glutamate uptake. Neuroscience. 310, 216-223 (2015).
- Berger, R., Garnier, Y., Pfeiffer, D., Jensen, A. Lipopolysaccharides do not alter metabolic disturbances in hippocampal slices of fetal guinea pigs after oxygen-glucose deprivation. Pediatric research. 48 (4), 531-535 (2000).
- Anderson, T. R., Jarvis, C. R., Biedermann, A. J., Molnar, C., Andrew, R. D. Blocking the anoxic depolarization protects without functional compromise following simulated stroke in cortical brain slices. Journal of neurophysiology. 93 (2), 963-979 (2005).
- Jarvis, C. R., Anderson, T. R., Andrew, R. D. Anoxic depolarization mediates acute damage independent of glutamate in neocortical brain slices. Cerebral Cortex. 11 (3), 249-259 (2001).
