Overvåking astrocytter reaktivitet og spredning in Vitro Under iskemiske-lignende forhold

Summary

Iskemiske hjerneslag er en kompleks hendelse der bidraget av astrocyttene til berørte hjernen regionen utsatt for glukose oksygenmangel (OGD) er vanskelig å studere. Denne artikkelen presenterer en metode for å skaffe isolert astrocyttene og studere deres reaktivitet og spredning under OGD forhold.

Abstract

Iskemiske hjerneslag er en kompleks hjerneskade forårsaket av en blodpropp eller embolus hindrer blodtilførsel til deler av hjernen. Dette fører til deprivasjon av oksygen og glukose, som forårsaker energy feil og neuronal død. Etter en iskemiske hjerneslag fornærmelse, astrocyttene bli reaktive og sprer rundt skade området som det utvikler seg. I dette scenariet er det vanskelig å studere bidraget av astrocyttene til hjernen regionen utsatt for ischemia. Derfor presenterer denne artikkelen en metodikk for å studere primære astrocytter reaktivitet og spredning under en i vitro modell av ischemia-lignende miljø, kalt glukose oksygenmangel (OGD). Astrocyttene ble isolert fra 1-4 dagers-gamle neonatal rotter og antall uspesifisert astrocytic celler ble vurdert astrocytter selektiv markør Glial Fibrillary Sure Protein (GFAP) og kjernefysiske flekker. Perioden der astrocyttene utsettes for OGD tilstanden kan tilpasses, samt prosenten av oksygen de utsatt for. Denne fleksibiliteten gjør at forskere til å beskrive varigheten av iskemiske som betingelsen i forskjellige grupper av celler i vitro. Denne artikkelen omhandler tidsrammer av OGD som induserer astrocytter reaktivitet hypertrofisk morfologi og spredning målt ved immunofluorescence med voksende celle kjernefysiske Antigen (PCNA). Foruten spredning, astrocyttene gjennomgå energi og oksidativt stress, og svare på OGD ved å slippe løselig faktorer til celle medium. Dette mediet kan samles og brukes til å analysere effekten av molekyler utgitt av astrocyttene i primære neuronal kulturer uten celle-til-celle. I sammendraget, kan denne primære celle kultur modellen effektivt brukes til å forstå rollen av isolerte astrocyttene ved skade.

Introduction

Slag er definert som “en akutt Nevrologisk dysfunction av vaskulær opprinnelse med plutselige eller rask utvikling av symptomer og tegn, tilsvarer involvering av fokal områder i hjernen”^1,2. Det finnes to typer slag: hemoragisk og iskemiske. Når vaskulær dysfunksjon er forårsaket av aneurisme eller en Arteriovenøs feil, ledsaget av svekkelse med bakre brudd på en arterie, kalles dette hemoragisk hjerneslag³ som, i de fleste tilfeller fører til døden. Når en blodpropp eller en embolus hindrer blodstrøm, kalles forårsaker en midlertidig deprivasjon av oksygen og glukose til en hjernen regionen, det iskemisk slag⁴. Feil å ernære cellene rundt det berørte området eller iskemisk kjernen fører til en homøostatisk og metabolsk ubalanse, energisk dysfunksjon, neuronal død og betennelse⁵, som kan indusere en livslang funksjonshemming for pasienter⁶.

Iskemiske hjerneslag er en multifaktoriell skade som involverer flere typer celler som reagerer og deres effekter på ulike tidspunkt. Mange samhandlinger opprette et vanskelig miljø for å studere atferden til enkeltceller. Så, hvordan vi studere bidrag fra en bestemt celle type under så komplekse miljø? En akseptert i vitro modell av iskemi består av utsette celler til oksygen og glukose deprivasjon (OGD), for en viss periode, etterfulgt av restaurering av celler i et normoxic miljø. Dette systemet simulerer en iskemiske hjerneslag etterfulgt av blod reperfusion. I denne metoden, blir eller vev utsatt for en glukose-frie medier i et miljø renset av oksygen, ved hjelp av en spesialisert hypoxic kammer. OGD inkubasjon tiden kan variere fra noen få minutter til 24 timer, avhengig av hypotesen som ønsker å bli testet. Studier har vist at avhengig av ganger av OGD og normoxic miljø, bestemte fenotyper av hjerneslag (dvs., akutt eller Subkronisk) kan oppnås. Primære isolert astrocyttene, utsatt for OGD med bakre restaurering normoxic forhold, er godt studert mobilnettet modell å etterligne slag i vitro⁷. Bruke OGD er mulig å avsløre uavhengig molekylære mekanismer av isolerte celler under et slag-lignende miljø.

Som vår kunnskap om astrocytter biologi øker, har det blitt tydelig at de er avgjørende for å opprettholde synapser og opprettholde nevrale reparasjon, utvikling og plastisitet⁸. Under normale forhold, astrocyttene slipp og svare på cytokiner, chemokines, vekstfaktorer og gliotransmitters, metabolske balanse og homeostase i synapser^5,9. I akutt neuroinflammation, for eksempel iskemiske hjerneslag, kan disse cellene bli reaktive, Vis en langsiktig overuttrykte av Glial Fibrillary Sure Protein (GFAP) og Vis hypertrofi i deres morfologi^{5,10, 11 , 12}. som den iskemiske betennelsessykdommer utvikler, homeostase av astrocyttene blir påvirket, om normal glutamat opptak, energi metabolisme, utveksling av aktive molekyler og antioksidant aktivitet¹³.

Reaktiverte astrocyttene sprer rundt betennelsessykdommer vevet mens leukocytter migrere mot den lesioned område¹⁴. Astrocytic spredning kan måles med markører som voksende celle kjernefysiske antigen (PCNA), Ki67 og bromodeoxyuridine (BrdU)¹⁵. Denne proliferativ responsen er generert i en tidsavhengige måte og det hjelper danner glial arret, en rekke irreversibelt reaktive astrocyttene langs parenchyma av skadet området etter en skade⁹. En av de første funksjonene i denne arr er å begrense immun cellen bloduttredelse fra dette området. Men har studier vist at arret blir et fysisk hinder for axons å forlenge, så de slipper molekyler begrenser axonal vekst, og danner en fysisk barriere hindrer axons i å utvide rundt skadde området¹⁶. Likevel er det vitenskapelige bevis som viser at etter en ryggmargsskade, fullstendig å hindre glial skjemmende arr kan svekke fornyelse av axons¹⁷. Derfor sammenheng der bestemte astrocytic svaret måles, må vurderes på rammen av skaden studerte.

Presentert metodikken kan brukes for å studere individualisert funksjonen av astrocyttene etter glukose oksygenmangel, og det kan endres avhengig av spørsmål som etterforskeren ønsker å svare. For eksempel tillegg morfologiske endringen og markører uttrykt på ulike tidspunkter, OGD, supernatants fra astrocyttene utsatt for OGD kan videre analyseres for å identifisere løselig faktorer utgitt av disse cellene, eller brukes som en betinget media for å vurdere sin effekt i andre hjerneceller. Dette gir studier på astrocytter reaktivitet som kan føre til utviklingen av faktorene som styrer og modulere sine svar i en iskemiske hjerneslag scenario.

Protocol

postnatal rotter (Sprague Dawley) 1-4 dager gamle brukes til å isolere halvdelene. Euthanasia er halshogging, som er godkjent av NIH retningslinjer. 1. forberedelse av instrumenter og materialer for kirurgi Sterilize instrumenter i en autoklav (temperatur: 121 ºC, Press: 15 psi, tid: 30 minutter) ved hjelp av en stålkasse eller et øyeblikk forsegle sterilisering veske. Se materialer i Tabellen of Materials. 2. Fullføre DMEM fo…

Representative Results

En av de største bekymringene primære astrocytic kultur er tilstedeværelsen av andre celler som nerveceller, oligodendrocytes, fibroblaster og microglia. I figur 1, isolerte celler fra rotte halvdelene hadde media endringer hver 3 dager og var enten ubehandlet eller behandlet med lagt LME for 1 h. 24 timer senere, celler var immunostained for GFAP og counterstained med DAPI. Ubehandlet celler viste gjennomsnittlig 39% ikke-GFAP positiv celler, mens LME-beh…

Discussion

Denne protokollen beskriver isolering av astrocyttene fra rotte halvdelene. I denne metoden er det viktig å redusere forurensningen med andre cellulære typer som microglia, oligodendrocytes og fibroblaster. Flere tiltak kan iverksettes for å redusere antall microglia,: endre media, orbital risting og kjemiske behandlinger. Når kultur renhet er bekreftet av immunofluorescence bruke selektiv mobilnettet markører eller fremste celle forurensninger, kan eksperimenter utføres. Antistoff mot ionisert kalsium bindende ada…

Materials

Instruments for Surgery – Step 1
Operating scissor 5.5”	Roboz Company	RS-6812	Tools used to decapitate the rats.
Curved forceps 7”	Roboz Company	RS-5271	Holds the skin of the rat while the skull is removed.
Micro-dissecting scissors 4”	Roboz Company	RS-5882	Cuts both the skin and skull of the rat.
Micro-dissecting forceps 4” angled, fine sharp	Roboz Company	RS-5095	Holds the skin of the rat while the skull is removed.
Micro-dissecting forceps 4” slightly curved 0.8	Roboz Company	RS-5135	Tool used to separate cortices.
Micro-dissecting tweezers	Roboz Company	RS-4972	Peels brain meninges.
Dissection microscope	Olympus	SZX16	Important for removing the meninge from the cortices.
DMEM Preparation – step 2
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)	GibCo. Company	11995-065	Supports the growth of cells.
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich Company	S7277	Supplement for the cell culture media.
Fetal bovine serum (FBS)	GibCo. Company	10437-010	Serum-supplement for the cell culture.
Penicillin-Streptomycin	GibCo. Company	15140-148	Inhibits the growth of bacterias in the cell culture.
Filter System 1L with 0.22um pore	Corning	431098
Astrocyte culture – step 3
Serological pipets 5mL	VWR	89130-896	To pipette DMEM to containers with cells.
Serological pipets 10mL	VWR	89130-898	To pipette DMEM to containers with cells.
Serological pipets 25mL	VWR	89130-900	To pipette DMEM to containers with cells.
Centrifuge conical tube 15mL	Santa Cruz Biotechnology	sc-200250
Safe-lock tube 1.5mL	Eppendorf	022363204
Barrier Tips 200 uL	Santa Cruz Biotechnology	sc-201725
Barrier Tips 1 mL	Santa Cruz Biotechnology	sc-201727
Biohazard Orange Bag 14 x 19"	VWR	14220-048
60mm petri dishes	Falcon	351007
Sterile gauze pads	Honeywell Safety	89133-086
Stomacher 80 Biomaster	Sewar Lab System	030010019	Triturate the brain tissue.
Stomacher 80 Blender Sterile Bags	Sewar Lab System	BA6040	Sterile bag for the stomacher cell homogenizer.
Beaker 400mL	Pyrex	1000
Sterile cell dissociation sieve, mesh #60	Sigma-Aldrich Company	S1020	To obtain a uniform single cell suspension.
Sterile cell dissociation sieve, mesh #100	Sigma-Aldrich Company	S3895	To obtain a uniform single cell suspension.
Invert phase microscope	Nikon	Eclypse Ti-S	Verify cells for contamination or abnormal cell growth.
75cm2 sterile flasks	Falcon	353136
Multi-well plate	Falcon	353046
Micro cover glasses (coverslips), 18mm, round	VWR	48380-046
Bright-Line hemacytometer	Sigma-Aldrich Company	Z359629
Pasteur pipettes	Fisher Scientific	13-678-20D
Ethyl alcohol	Sigma-Aldrich Company	E7023
L-leucine methyl ester hydrochloride 98% (LME)	Sigma-Aldrich Company	L1002	Promotes the elimination of microglia cells in the primary cortical astrocyte cultutre.
Cytosine β-D-arabinofuranoside (Ara-C)	Sigma-Aldrich Company	C1768
Poly-D-Lysine Hydrobromide, mol wt 70,000-150,000	Sigma-Aldrich Company	P0899
Trypsin/EDTA	GibCo. Company	15400-054
Trypan Blue	Sigma-Aldrich Company	T8154
Phosphate buffer saline (PBS) tablets	Calbiochem	524650
Sterile Water	Sigma-Aldrich Company	W3500
OGD Medium Preparation – step 5
Centrifuge conical tube 50 mL	VWR	89039-658
Dulbecco’s modified Eagle’s medium-free glucose	Sigma-Aldrich Company	D5030	Supports the growth of cells.
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich Company	S7277	Supplement for the cell culture media.
Penicillin-Streptomycin	GibCo. Company	15140-148	Inhibits the growth of bacterias in the cell culture.
200mM  L-glutamine	GibCo. Company	25030-081	Amino acid that supplements the growth of cells.
Phospahet buffer saline (PBS) tablets	Calbiochem	524650
Filter System 50mL with 0.22um pore	Corning	430320
Centrifuge conical tube 50 mL	VWR	89039-658
Single Flow Meter	Billups-Rothenberg	SMF3001	Measure gas flow in oxygen purge.
Hypoxia Incubator Chamber	StemCell	27310	Generates a hypoxic environment for the cell culture.
Traceable Dissolved Oxygen Meter	VWR	21800-022
95% N2/ 5% CO2 Gas Mixture	Linde		Purges the environment of oxygen.
primary astrocyte immunofluorescence – step 6
Phosphate buffer saline (PBS) tablets	Calbiochem	524650
Formaline Solution Neutral Buffer 10%	Sigma-Aldrich	HT501128	Solution used to fix cells.
Methanol	Fisher	A4544	Solution used to fix cells.
Non-ionic surfactant (Triton X-100)	Sigma-Aldrich	T8787
Fetal bovine serum (FBS)	GibCo. Company	10437-010	Serum-supplement for the cell culture.
Anti-NeuN	Cell Signaling	24307	Detects mature neurons, serves to validate the astrocytic culture.
Anti-PCNA	Cell Signaling	2586	Detects proliferating cells.
Propidium Iodide (PI)	Sigma-Aldrich Company	P4170	Apoptosis staining.
Anti-Olig1	Abcam	AB68105	Detects mature oligodendrocytes.
Anti-Iba1+	Wako	016-20001	Detects microglial cells.
Anti-GFAP Conjugated with Cy3	Sigma-Aldrich Company	C9205	Detects reactive astrocytes in the treated cells.
Alexa Fluor 488	Molecular Probe Life Technology	A1101	Anti-Mouse Secondary Antibody
Alexa Fluor 555	Molecular Probe Life Technology	A21428	Anti-Rabbit Secondary Antibody
4’,6’-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Sigma-Aldrich Company	D9542	Nuclear staining
Confocal microscope	Olympus