Summary
Chondrogenese uit stamcellen vereist fine tuning van de kweekomstandigheden. Hier presenteren we een magnetische aanpak voor het condenseren van cellen, een essentiële stap om chondrogenese te initiëren. Bovendien tonen wij aan dat dynamische rijping in een bioreactor zijn mechanische stimulatie van de cellulaire constructen en verbetert kraakbeenachtige extracellulaire matrix productie.
Abstract
Kraakbeen techniek blijft een uitdaging vanwege de moeilijkheden bij het creëren van een in vitro functionele ingreep vergelijkbaar met de natieve weefsel. Een benadering recentelijk onderzocht voor de ontwikkeling van autologe vervangingen omvat de differentiatie van stamcellen tot chondrocyten. Dit chondrogenese, een verdichtingsgraad van de stamcellen nodig initiëren; dus hebben we aangetoond dat de haalbaarheid van magnetisch condenseren cellen, zowel in dikke steigers en scaffold-vrij, via geminiaturiseerde magnetische veldbronnen cel- Aantrekkers. Deze magnetische benadering werd ook gebruikt om de totale fusie te begeleiden en steiger-vrij, georganiseerd bouwen, driedimensionale (3D) weefsels enkele millimeters groot. Naast het hebben van een verbeterde afmeting, het weefsel gevormd door magnetisch aangedreven fusie gepresenteerd een significante toename van de expressie van collageen II, en een soortgelijke trend werd waargenomen voor aggrecan expressie. Als het natieve kraakbeen werd onderworpen aan krachten thoed beïnvloed zijn 3D-structuur, werd dynamische rijping ook uitgevoerd. Een bioreactor die mechanische stimuli biedt werd gebruikt om de cultuur van het magnetisch gezaaid steigers over een periode van 21 dagen. Bioreactor rijping grotendeels verbeterd chondrogenese in de cellularized steigers; de extracellulaire matrix verkregen onder deze omstandigheden was rijk aan collageen II en aggrecan. Dit werk beschrijft de innovatiepotentieel van magnetische condensatie van gelabelde stamcellen en dynamische rijping in een bioreactor verbeterde chondrogene differentiatie, zowel scaffold-vrij binnen polysaccharide steigers.
Introduction
Magnetische nanodeeltjes worden al gebruikt in de kliniek als contrastmiddelen voor magnetische resonantie beeldvorming (MRI), en hun therapeutische toepassingen blijven uitbreiden. Zo is onlangs aangetoond dat gelabelde cellen kunnen worden gemanipuleerd in vivo toepassing van een extern magnetisch veld en kunnen worden gericht en / of gehouden op een gedefinieerde plaats van de implantatie 1, 2, 3. Regeneratieve geneeskunde, kunnen zij worden gebruikt om georganiseerde weefsels in vitro 4, omvattende vasculaire tissue 5, 6, 7, 8 bot en kraakbeen 9 ingenieur.
Gewrichtskraakbeen wordt ondergedompeld in een avasculaire omgeving, waardoor reparatie van de extracellulaire matrixcomponenten zeer beperkt indien schade optreedt. Om deze reden, research is momenteel gericht op de techniek van hyaline kraakbeen vervangingen die in de defectplaats kunnen worden geïmplanteerd. Om een autoloog vervanging produceren sommige onderzoeksgroepen verkennen van het gebruik van autologe chondrocyten als bron van cellen 10, 11, terwijl anderen benadrukken het aantal mesenchymale stamcellen (MSC) te differentiëren tot chondrocyten 12, 13. In eerdere studies hier recapituleerde, hebben we gekozen voor MSC, als hun beenmerg sampling is vrij eenvoudig en niet het offer van gezonde chondrocyten, die dreigen te verliezen hun fenotype 14 vereisen.
Een vroege stap essentieel voor het initiëren van de chondrogene differentiatie van stamcellen is hun condensatie. Celaggregaten worden gewoonlijk gevormd met behulp van centrifugatie of micromassakweek 15; Maar deze condensatieprodukten werkwijzen neither presenteren potentieel cel clusters binnen dikke scaffolds of de potentie om de fusie van aggregaten regelen creëren. In dit artikel beschrijven we een innovatieve benadering condenseren stamcellen via MSC magnetische labeling en magnetische aantrekking. Deze techniek is bewezen dat scaffold-vrije 3D constructen via de fusie van aggregaten met elkaar vormen van een millimeter schaal kraakbeenweefsel 9 te verkrijgen. Magnetische zaaien van dikke en grote steigers benadering maakte ook de mogelijkheid om de omvang van de gemanipuleerde weefsel, het ontwerp van een vorm gemakkelijker bruikbaar voor implantatie en diversificatie van het potentieel voor klinische toepassingen herstel van kraakbeen. Hier hebben we gedetailleerd protocol voor de magnetische zaaien van MSC in poreuze draagstructuren samengesteld uit natuurlijke polysacchariden, pullulan, dextran en, steigers eerder gebruikte stamcellen 16, 17 beperken. Chondrogene differentiatie was finally uitgevoerd in een bioreactor continu voedingsstoffen en gasdiffusie waarborgen in de matrixkern van de steigers gezaaid met een hoge dichtheid aan cellen. Naast het verstrekken van voedingsstoffen, chondrogene groeifactoren en gas aan de cellen, de bioreactor bood mechanische stimulatie. Kortom, de magnetische technologie gebruikt om stamcellen te beperken, gecombineerd met dynamische rijping in een bioreactor, aanzienlijk kan verbeteren chondrogene differentiatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. De bouw van de Magnetic Devices
OPMERKING: De inrichtingen gebruikt voor het zaaien van cellen variëren afhankelijk van de toepassing (figuur 1). Om aggregaten te vormen, wordt het aantal cellen dan 2,5 x 10 5 / aggregaat, zodat de magnetische kop zeer dunne (750 pm in diameter) moet zijn. De 1,8 cm 2/7 mm dik steigers zaad, moeten de magneten groter (3 mm diameter) en zorgt celmigratie door de poriën van de scaffold.
- Constructie van een inrichting met micro-magneet voor aggregaatvorming (Figuur 1A)
- Maak micro-gaten met een 0,8-mm doorsteken aluminiumplaten (3 cm in diameter en 6 mm dik).
- Plaats een magnetische punt (750 um diameter) in elk gat van de plaat.
- Plaats deze schijf over een permanente neodymium magneet, die magnetisatie zorgt tot verzadiging.
- Bouw van een inrichting voor steiger zaaien (
- Gesneden harde polystyreen in 2,4 cm2 vierkantjes.
- Plaats 9 magneetjes (3 mm diameter 6 mm) op gelijke afstand over een oppervlak van 1,6 cm2.
- Plaats dit apparaat over een permanente neodymium magneet.
2. Stem Cell Labeling
OPMERKING: Stamcellen werden gemerkt met 0,1 mM magnetische nanodeeltjes gedurende 30 minuten (2,6 ± 0,2 pg ijzer / cel) aan aggregaten, terwijl ze werden gemerkt met 0,2 mM magnetische nanodeeltjes gedurende 30 min (5 ± 0,4 pg ijzer / cel) aan zaad steigers. Deze nanodeeltjes concentraties en incubatietijden zijn eerder gebruikt en gepubliceerd MSC en andere cellen 18, 19, en er is vastgesteld dat nanopartikels beïnvloed noch cellevensvatbaarheid noch MSC differentiatievermogen. De massa ijzer opgenomen door de stamcellen werd gemeten via single-cell magnetophoresis 19, 20.
- Cultuur menselijke mesenchymale stamcellen (MSC) volledig mesenchymale stamcellen celkweekmedium (MSCGM) bij 37 ° C en 5% CO2 tot nabij confluentie (~ 90%).
- Bereid de magnetische labelingoplossing door mengen 0,1 of 0,2 mM maghemiet-citraat gecoate ijzeroxide (γFe 2 O 3; kern: 8 nm diameter) in serumvrij McCoy's 5A medium gemodificeerd op Roswell Park Memorial Institute (RMPI) zonder glutamine en met 5 mM natriumcitraat.
- Gooi het medium, de cellen met serumvrij RPMI-medium te spoelen zonder glutamine en voeg 10 ml ijzeroxide nanodeeltjes oplossing per 150 cm2 kweekfles, het minimale volume nodig om alle cellen te bedekken.
- Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C en 5% CO2 en gooi het nanodeeltje oplossing. Spoelen gedurende 5 minuten met serumvrij RPMI medium zonder glutamine de nan internaliserenoparticles nog aan het plasmamembraan.
- Gooi het RPMI-medium en voeg 25 ml compleet medium per kolf MSCGM. Incubeer overnacht bij 37 ° C en 5% CO2.
3. Magnetic Cell Seeding
- Vers bereid het chondrogene medium met behulp Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) hoog glucose met L-glutamine door toevoeging van 50 uM L-ascorbinezuur 2-fosfaat, 0,1 uM dexamethason, 1 mM natriumpyruvaat, 0,35 mM L-proline, 1% universele kweek supplement met insuline, humaan transferrine en seleenzuur (ITS-Premix), en 10 ng / ml transformerende groeifactor-beta 3 (TGF-β3).
- Maak de cellen met behulp van magnetische 8 ml 0,05% trypsine-EDTA per 150 cm2 kweekfles en centrifugeer de gedissocieerde cellen bij 260 xg gedurende 5 minuten. Zuig het medium en tel de opnieuw gesuspendeerde cellen.
- Plaats een glazen bodem celkweek Petrischaal (35 mm) boven beide magnetische inrichtingen.
- om magnetically aggregaten vormen, voeg 3 ml chondrogene medium aan de petrischaal en voorzichtig het kleinst mogelijke volume (maximaal 8 pl) met 2,5 x 10 5 gemerkte cellen per aggregaat (maximaal 16 aggregaten worden gestort) deponeren. Laat de petrischaal gedurende 20-30 min zonder verplaatsen, zodat het sferoïden te vormen, en plaats de volledige inrichting, zoals de petrischaal met 16 aggregaten in de incubator bij 37 ° C en 5% CO2.
- Formulierbesturingselement aggregaten volgens hetzelfde protocol en vervang het volledige medium met chondrogene medium zonder TGF-β3.
- Om de 3D-aggregaat construct te genereren, plaatst 2 aggregaten in contact op dag 8-8 wambuizen vormen en inleiding van de fusie. Op dag 11, samen te voegen 2 doubletten tot 4 vierling te vormen. Tenslotte zekering 4 vierling op dag 15 om de uiteindelijke structuur te verkrijgen.
- Tegelijkertijd, vormen aggregaten door centrifugeren 2,5 x 10 5 gelabelde stamcellen 26015; g gedurende 5 min in 15 ml buizen met 1,5 ml chondrogene medium met of zonder TGF-β3 (voor het monster en controle, respectievelijk).
- Zaad steigers magnetisch, plaatst elke steiger gedroogd in een petrischaal. Gebruik polysaccharide poreuze stellages van pullulan / dextraan 21. Voor elke steiger verdunnen 2 x 10 6 gemerkte stamcellen in 350 pl chondrogene medium zonder TGF-β3 voorzichtig pipetteren de cellen op de scaffold.
- Incubeer gedurende 5 minuten bij 37 ° C te geven volledige cel penetratie in de scaffold en vervolgens voorzichtig 3 ml chondrogene medium toevoegen of zonder TGF-β3 (voor het monster of controle, respectievelijk) naar de petrischaal.
- Incubeer de cellularized schavot de magneetinrichting bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 4 dagen mogelijk te maken celmigratie door het scaffold poriën en insluiting.
- Tegelijkertijd, zaad steigers met 2 x 10 6
4. differentiatie tot chondrocyten
NB: Na 4 dagen incubatie, verwijder de magneten en voortzetting van de chondrogene rijping hetzij in een petrischaal (statische omstandigheden) of in een bioreactor (dynamische omstandigheden). Negatieve controlemonsters worden gerijpt in statische omstandigheden met chondrogene medium zonder TGF-β3.
- In statische omstandigheden, houden de cellularized steigers of aggregaten in dezelfde petrischaal. Verander het chondrogene medium twee keer per week gedurende 21 dagen.
- In dynamische omstandigheden, de voorbereiding van de bioreactor.
- Gesneden siliconen slang op de juiste lengte volgens het protocol van de fabrikant.
- Autoclaaf alle materialen: 500 ml kweekkamer, slangen, 2-weg rotators en kooien.
- Plaats de bioreactor onderdelen in een steriele microbiologische veiligheid station. Sluit de slang aan op de 2-weg rotoren en om de cultuur kamer volgens de instructies van de fabrikant.
- overdragen cellularized scaffolds voorzichtig in gesteriliseerde kooien met een steriele spatel. Plaats 2 steigers per kooi. Wanneer de kooien zijn bereid, invoegen in de naalden van het deksel te bewegen tijdens verdere rotatie te houden. Vul het kweekkamer met chondrogene medium en sluit het deksel met de kooien.
- Schakel de peristaltische pomp naar de buis met chondrogene medium te vullen en om luchtbellen te verwijderen.
- Plaats en zet de gevulde kamer in de motor van de bioreactor en zet de computer, waarbij de rotaties van de beide armen en de kamer regelt.
- Breng een rotatiesnelheid van 5 omwentelingen per minuut (rpm) aan zowel de arm en de kamer. Stel de peristaltische pomp met een stroomsnelheid van 10 rpm gedurende continue toevoer van de cellularized steigers.
OPMERKING: Voorafgaand aan RNA-extractie, verwerken de steigers met een enzymatische oplossing.
- Bereid 1 ml enzymoplossing door toevoeging van 100 pl pullulanase (40 U / ml) en 50 pl van dextranase (60 mg / ml) aan 850 ml serumvrij DMEM medium.
- Spoel de steigers tweemaal met serumvrij DMEM medium, gooi het medium en voeg 800 ul van de enzymoplossing per scaffold. Incubeer 15-30 minuten bij 37 ° C onder zacht schudden.
- Wanneer het skelet volledig is opgelost, breng de oplossing die de cellen aan een 1,5 ml buis, centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 min voorzichtig zuig het medium tweemaal spoelen met steriele 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), centrifuge 300 xg gedurende 10 min en resuspendeer de cellen in de RNA-isolatie oplossing.
- Het RNA van de aggregaten te extraheren, plaatst de sferoïden in het RNA-isolatie oplossing enze volledig verpletteren toepassing van een homogenisator voordat RNA-extractie.
- Isoleer het RNA met behulp van een kit voor totaal RNA extractie volgens de instructies van de fabrikant.
- Synthetiseren complementair DNA 400 ng totaal RNA met behulp van reverse transcriptase volgens de instructies van de fabrikant, met behulp van 250 ng willekeurige primers, 1 pl dNTP mix (10 mM elk), en 40 U / ml RNase inhibitor; het eindvolume van 20 pi reactie. Na afloop van de reactie, voeg 80 ul gedistilleerd water tot een eindvolume van 100 ul te verkrijgen.
- Voor kwantitatieve polymerasekettingreactie (PCR) gebruikt een PCR mengsel dat een fluorescerend reagens om de relatieve expressie van de genen van belang, zoals aggrecan (AGC) en collageen II (Col II) te kwantificeren, waarbij 10 x verdunde cDNA. Normaliseren van de niveaus van genexpressie van de referentie-gen ribosomaal eiwit, Groot, P0 (RPLP0). Voeren berekeningen met 2 - AACt formule, Waarbij AACt = ACT gedifferentieerde toestand - gemiddelde van ACT controleconditie, en elk OCT vertegenwoordigt de CT van het gen van interesse - de CT van het referentiegen (RPLP0).
- Bepalen statistische metingen als gemiddelde waarden ± standaardfout van het gemiddelde (SEM). Voer de analyse met n ≥ 2 onafhankelijke experimenten. Met t-toets om de statistische verschillen tussen gecentrifugeerd en pellets magnetische fusies (* p <0,05) geanalyseerd. Bepaal de betekenis van een Kruskal-Wallis test (één parametrische ANOVA) statistische verschillen tussen gedifferentieerde steigers en de besturing stellage (* p <0,05) geanalyseerd.
6. Histologische analyse
- Spoel de cellularized steigers of aggregaten met steriel 1 x PBS, zet ze in 10% formaline-oplossing gedurende 1 uur bij kamertemperatuur en spoel met 1 x PBS.
- Verwijder het PBS, sluit de monsters in optimale snG temperatuur verbinding (oktober), en bevriezen per isopentaan bad ondergedompeld in vloeibare stikstof. Bewaar het monster bij -20 ° C. Snijd de monsters met een cryostaat tot 8 urn vriescoupes van de aggregaten of 12 pm voor cellularized steigers te verkrijgen.
- Vlekken op de cryosecties met 0,5% toluïdineblauw gedurende 2 minuten, spoelen met kraanwater, dehydrateren met 100% ethanol, verduidelijkt met tolueen, en zet de glaasjes met een fixeermiddel voor lichtmicroscopie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ten eerste kunnen aggregaten afzonderlijk worden gevormd met behulp van micro-magneten door het neerslaan van 2,5 x 10 5 gelabelde stamcellen (figuur 2A). Deze enkele aggregaten (~ 0,8 mm in grootte) kunnen vervolgens worden gefuseerd tot grotere structuren door sequentiële magnetisch geïnduceerde fusie. Bijvoorbeeld op dag 8 van chondrogene rijping aggregaten in contact in paren wambuizen vormen geplaatst; vierlingen werden verzameld op dag 11 door het samenvoegen van 2 doubletten; en ten slotte op dag 15, de vierling 4 werden gefuseerd met een 3D-construct dat 16 van de initieel gevormde aggregaten, in totaal 4 x 10 6 cellen (ongeveer 4 mm groot) (figuur 2B). Ten tweede, heeft dezelfde magnetische aantrekking techniek gebruikt om celaggregaten binnen steigers kunnen worden gevormd. Skeletten werden geënt via magneetinrichting en toonden dicht gecondenseerd cellen in de poriën van het schavot op exacte micro-magneet plaatsen (Figuur 2C). Daarentegen wanneer cellen werden gezaaid bij een scaffold zonder magnetische aantrekking (passieve zaaien), bleken zij gelijkmatig verdeeld. Cellularized scaffolds werden vervolgens in kooien (figuur 3A) gekoppeld aan de bioreactor kamer naar de chondrogene werkwijze onder dynamische maturatie omstandigheden (Figuur 3B) verricht. Een dergelijke bioreactor verbeterd voedingsmiddel en gas uitwisseling en verschaft mechanische stimulatie door transductie. De rotatiesnelheid van zowel de arm en de kamer werd ingesteld op 5 rpm, zoals aanbevolen door de fabrikant van zachte 3D weefselregeneratie. Een peristaltische pomp die een continue aanvoer drager verschaft werd ingesteld op 10 rpm.
Voor alle omstandigheden van celorganisatie (gefuseerde aggregaten en enten binnen scaffolds) en weefsel rijping (binnen of buiten een bioreactor), genexpressie werd geanalyseerd op dag 25. Het weefsel gevormd door magnetische fusie toonde een significant toename van collageen II-expressie vergeleken met de pellet verkregen door centrifugeren (figuur 4A), samen met een verhoogde expressie trend van aggrecan. Voor cellularized steigers, verkregen we een toename van aggrecan en collageen II-expressie significant voor collageen II-magnetische toen zaaien werd gebruikt, vergeleken met de steigers geënt zonder magnetische krachten. Daarnaast is de expressie van beide genen was veel hoger (significant voor Col II) als magnetische enten werd gecombineerd met dynamische differentiatie (Figuur 4B).
Histologische analyses werden ook uitgevoerd, bijvoorbeeld met behulp van een toluidine blauwkleuring de glycosaminoglycanen (GAG) onthullen. De opeenvolgende magnetische fusie van 16 aggregaten vertoonden overvloedige afzetting van GAG, zoals blijkt door de blauwpaarse kleur (Figuur 5A). Voor de steigers, alleen die magnetisch gezaaid werden gekleurd met toluïdineblauw. GAG contenet was hoger wanneer de steigers in een bioreactor (figuur 5B) in plaats van statisch (figuur 5C) werden gedifferentieerd. Tezamen bieden deze resultaten tonen het potentieel van magnetische aggregatie en magnetische zaaien binnen steigers chondrogenese te verbeteren. Het geeft ook aan dat de dynamische rijping omstandigheden in de bioreactor zijn veel gunstiger voor een efficiënte differentiatie.
Figuur 1. De bouw van de magnetische apparaten. (A) Voorbeeld van een magnetische inrichting voor aggregaatvorming: de aluminiumplaat werd geboord (0,8 pm diameter gaten) en elk gat werd uiteinden gestoken en vervolgens op een permanente neodymium magneet de magnetisatie gewaarborgd verzadiging. (B) Magnetische inrichting naar het schavot zaad: hard polystyreen (24 mm2) met 9 hand uitgevoerd holes wasgeplaatst op een permanente neodymium magneet de magnetisatie gewaarborgd verzadiging. Magneetjes (3 mm diameter) werden dan ingebracht in elk gat om de inrichting te vormen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2. Magnetisch labelen van stamcellen en zaaien. (A) Stamcellen werden gelabeld met ijzeroxide nanodeeltjes gedurende 30 minuten bij 37 ° C. (B) sferoïden gevormd uit gemerkte cellen aangetrokken door een netwerk van 16 micro-magneten. De aggregaten werden op dag 11 in vierling samengevoegd door fusie van de doubletten 3 dagen vóór gevormd. De vierlingen werden vervolgens gefuseerd op dag 15 om het uiteindelijke gemanipuleerde weefselconstructie. (C) een scaffold, gebracht in een glazen bodem schaal, werd geënt met ofout magnetische krachten. Op dag 4, vlekken verdichte stamcellen werden waargenomen in de magnetisch geënte scaffold, terwijl de cellen gelijkmatig verdeeld verscheen in het skelet geënt zonder magneet. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3. Dynamische rijping van cellularized steigers. (A) na magnetische of passieve uitzetten werden cellularized scaffolds in kooien om verstoringen te voorkomen. (B) kooien, vastgesteld volgens de naalden van de kap, werden in het vat van de bioreactor gevuld met chondrogene medium. De bioreactor toegepast biaxiale rotatie met een onafhankelijk geregelde snelheid (1-12 en 1-35 rpm rpm gedurende de arm en de kamer respectievelijk). Een peristaltische pomp continu ontvangen medium. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4. Expressie van specifieke genen chondrogene op dag 25 (A) De magnetisch geïnduceerde fusie van MSC sferoïden een significante toename van collageen II in vergelijking met de pellet gevormd door centrifugeren. * Betekent een statistisch verschil middels t-toets (p-waarde <0,05). (B) De expressie van aggrecan en collageen II werden gedifferentieerd scaffolds met een combinatie van magnetische zaaien en dynamische rijping in een bioreactor duidelijk toegenomen. Genexpressie werd genormaliseerd op RPLP0 mRNA en uitgedrukt in willekeurige eenheden ten opzichte van controle (-1 ± SEM). Resultaten worden weergegeven als het gemiddelde ± SEM van 2-4 onafhankelijke experimenten. * Denotes een statistisch verschil met de Kruskal-Wallis test (one-way ANOVA-parametrische test) (p-waarde <0,05). (-): zaaien zonder magneet; (+): Enten met magnetische krachten. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5. Histologische kleuring van glycosaminoglycanen op dag 25. glycosaminoglycan (GAG) deposito blijken uit blauwpaarse verkleuring. (A) Positief toluidine blauwkleuring waargenomen in de 8-um cryosecties van de uiteindelijke kraakbeenachtige structuur verkregen door opeenvolgende versmelting van 16 aggregaten. De 12-um vriescoupes van steigers magnetisch gezaaid na statische (B) of dynamisch (C) omstandigheden toonde duidelijkdat GAG gehalte hoger was in steigers gedifferentieerd in een bioreactor. Pijlen geven aggregaten van gedifferentieerde cellen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ten eerste, omdat de hier gepresenteerde technieken vertrouwen op de internalisering van magnetische nanodeeltjes, een belangrijk punt is de uitkomst van de nanodeeltjes als ze eenmaal lokaliseren in de cellen. Weliswaar ijzer nanodeeltjes mogelijke toxiciteit of verminderde differentiatievermogen afhankelijk van hun grootte, bekleding en blootstellingstijd 19, 22 kunnen leiden. Toch hebben verschillende studies geen invloed op de cellulaire fysiologie zichtbaar als ingekapselde ijzer nanopartikels werden 23 gebruikt in de vorm van magnetoferritin, een biologisch nanodeeltje 24 of werd gebruikt met een eenvoudige bekleding citraat en adequate concentraties 18. Bovendien, wanneer ijzeroxide nanodeeltjes werden onder soortgelijke omstandigheden als die beschreven in dit document (MSC en chondrogenese), we onlangs aangetoond dat een snelle en bijna totale afbraak van het nanopartikelen plaatsvindt binnen de endosomen in ongeveer 10 dagen na cellulaire oprichting en MSC sferoïde formatie. Interessant is dat deze massale afbraak in verband met de efficiënte opslag van de vrij ijzer in het ferritine-eiwit en resulteerde in een zeer beperkt effect op het cellulaire metabolisme van ijzer, een goede start is voor toekomstige klinische toepassingen 25.
Een ander kritisch punt is de eis van cel verdichting chondrogenese te initiëren. Gewoonlijk wordt de condensatie van cellen verkregen door centrifugeren; echter is deze werkwijze beperkt door een klein aantal cellen (niet meer dan 2,5 x 10 5 cellen). Voorbij dit nummer kunnen de voedingsstoffen en gas diffundeert niet naar het midden van de aggregaten, triggering celnecrose. Hier, de magnetische condensatie van gelabelde cellen tot aggregaten wordt als een belangrijke werkwijze voor het vormen van 3D-constructen voor kraakbeen weefselregeneratie. Een dergelijke magnetische procedure is gebruikt door andere auteursbouwen 3D sferoïden: door magnetische levitatie met een magneet geplaatst op de bovenkant van de plaat na de dissociatie van de cellen 23 of ijzeren pinnen het magneetveld 26 te lokaliseren. Echter, magnetische levitatie niet lijken te zijn geschikt voor de volgende stadia van de totale fusie. Daarentegen de magnetische methode hier voorgesteld, we allemaal fusie stappen regelen tot een stap-voor-stap kraakbeenweefsel constructie te verkrijgen. Kortom, deze meerstapswerkwijze begint met opsluiting van stamcellen in geaggregeerde bouwstenen en wordt gevolgd door condensatie van die blokken op een grotere structuur. De kritische stappen van deze scaffold-vrije stamcel aggregatieprocedure zijn: eerst moet men elk aggregaat met een zo klein volume van de cellen mogelijk en tweede vorm, moet men het fusie stappen regelen om de vorming van één grote voorkomen aggregaat. Het weefsel werd hier verkregen rijk aan collageen II en aggrecan. Zij heeft ook de advantages of met flexibele geometrie en grootte en zijn scaffold-vrij.
De magnetische werkwijze werd gebruikt om stamcellen te begeleiden in dikke en grote steigers; een ander alternatief voor het ontwerp van verschillende vormen en maten. De kritische stap is hier om de steigers zaad met een geschikt volume van cellen: niet te weinig een algemeen homogene verdeling van cellen, noch te veel naar een cel te vermijden. Magnetische krachten werden vroeger gebruikt voor het aantrekken en behouden van cellen in steigers en naar cel zaaien 27, 28 te verbeteren. Hier, voldoende cel condensatie in de poriën van de polysaccharide steigers heeft geleid tot een succesvolle chondrogenese. Het extracellulaire matrix productie aanzienlijk verbeterd wanneer de magnetisch cellularized scaffolds werden onderworpen aan transductie / schuifspanning stimuli door de bioreactor dankzij bi-axiale rotatie. Het is aangetoond in andere studies die MULti-axiale belasting verbeterde de kwaliteit van de weefsels gevormd van chondrocyten 29. Deze nieuwe bioreactor concept van een reëel voordeel ten opzichte van bestaande technieken, waar slechts drukkrachten aangelegd 30, 31, 32.
Concluderend voor chondrogene differentiatie, het gebruik van magnetische opsluiting van gelabelde stamcellen te vormen en te manipuleren aggregaten evenals steigers toegestaan voor de creatie van millimeter size kraakbeen cellulaire constructen zaad. Bovendien, het combineren van magnetische cel enten met dynamische differentiatie biedt een waardevol nieuw instrument voor regeneratieve geneeskunde toepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen graag QuinXell Technologies en CellD, in het bijzonder Lothar Grannemann en Dominique Ghozlan erkennen voor hun hulp bij de bioreactor. Wij danken Catherine Le Visage, die ons met de pullulan / dextran polysaccharide steigers. Dit werk werd ondersteund door de Europese Unie (ERC-2014-CoG project Matisse 648.779) en door de AgenceNationalede la Recherche (ANR), Frankrijk (MagStem project ANR-11 SVSE5).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Iron oxide (maghemite) nanoparticules (γ-Fe2O3) | PHENIX - University Paris 6 | Made and given by C. Ménager | Mean diameter of 8.1 nm and negative surface charge |
| Polysaccharide Pullulan/Dextran scaffolds | LIOAD - University Nantes | Made and given by C. Le Visage | Prepared from a 75:25 mixture of pullulan/dextran in alkaline conditions (10 M NaOH). Porosity: 185-205 µm; Thickness: 7 mm; Surface area: 1.8 cm2. |
| TisXell Regeneration System | QuinXell Technologies | QX900-002 | Biaxial bioreactor with 500 mL culture chamber |
| Cage for scaffolds: Histosette II M492 | VWR | 720-0909 | |
| Mesenchymal Stem Cell (MSC) | Lonza | PT-2501 | Three independant batches have been used |
| MSCGM BulletKit medium | Lonza | PT-3001 | For the complete medium, add the provided BulletKit (containing serum, glutamine and antibiotics) to the MSCGM medium |
| DMEM with Glutamax I | Life Technologies | 31966-021 | No sodium pyruvate, no HEPES |
| RPMI medium 1640, no Glutamine | Life Technologies | 31870-025 | No sodium pyruvate, no HEPES |
| PBS w/o CaCl2 w/o MgCl2 | Life Technologies | 14190-094 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25300-054 | |
| Penicillin (10,000 U/mL) / Streptomycin (10,000 µg/mL) | Life Technologies | 15140-122 | |
| ITS Premix Universal Culture Supplement (20x) | Corning | 354352 | |
| Sodium pyruvate solution 100 mM | Sigma | S8636 | |
| L-Ascorbic Acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | Prepare the concentrated solution (25 mM) in distilled water extemporaneously |
| L-Proline | Sigma | P5607 | Prepare the 175 mM stock solution diluted in distilled water and store at 4 °C |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | Prepare the 1 mM stock solution diluted in Ethanol 100% and store at -20 °C |
| TGF-beta 3 protein 10 µg | Interchim | 30R-AT028 | |
| Tri-sodium citrate | VWR | 33615.268 | Prepare the 1 M stock solution diluted in distilled water and store at 4 °C |
| Pullulanase from Bacillus acidopullulyticus | Sigma | P2986 | |
| Dextranase from Chaetomium erraticum | Sigma | D0443 | |
| NucleoSpin RNA Extraction Kit | Macherey-Nagel | 740955.5 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Life Technologies | 18064-014 | |
| Random Primer - Hexamer | Promega | C1181 | 500 µg/mL: Use diluted 1/2 and put 1 µL per sample |
| Recombinant RNAs in ribonuclease inhibitor | Promega | N2511 | 40 U/µL: put 1 µL per sample |
| PCR nucleotide dNTP mix (10 mM each) | Roche | 10842321 | |
| SyBr Green PCR Master Mix | Life Technologies | 4368708 | |
| Step One Plus Real-Time PCR System | Life Technologies | 4381792 | |
| Formalin solution 10% neutral buffered | Sigma | HT5012 | |
| OCT solution | VWR | 361603E | |
| Isopentane | Sigma | M32631 | |
| Toluidine blue O | VWR | 1.15930.0025 | |
| Ethanol absolute | VWR | 20821.310 | |
| Toluene | VWR | 1.08323.1000 | |
| Mounting medium Pertex | Histolab | 840 | |
| RPLP0 Primer for qPCR | Eurogentec | 5'-TGCATCAGTAC CCCATTCTATCAT-3'; 5'-AAGGTGTAATC CGTCTCCACAGA-3' |
|
| Aggrecan Primer for qPCR | Eurogentec | 5'-TCTACCGCTGCGAGGTGAT-3'; 3'-TGTAATGGAACACGATGCCTTT-5' | |
| Collagen II Primer for qPCR | Eurogentec | 5'-ACTGGATTGACCCCAACCAA-3'; 3'-TCCATGTTGCAGAAAACCTTCA-5' |
References
- Naumova, A. V., Modo, M., Moore, A., Murry, C. E., Frank, J. A.
- Edmundson, M., Thanh, N. T., Song, B. Nanoparticles based stem cell tracking in regenerative medicine. Theranostics. 3 (8), 573-582 (2013).
- Di Corato, R., et al. High-resolution cellular MRI: gadolinium and iron oxide nanoparticles for in-depth dual-cell imaging of engineered tissue constructs. ACS Nano. 7 (9), 7500-7512 (2013).
- Xu, F., et al. Three-dimensional magnetic assembly of microscale hydrogels. Adv Mater. 23 (37), 4254-4260 (2011).
- Kito, T., et al. iPS cell sheets created by a novel magnetite tissue engineering method for reparative angiogenesis. Sci Rep. 3, 1418 (2013).
- Mironov, V., Kasyanov, V., Markwald, R. R. Nanotechnology in vascular tissue engineering: from nanoscaffolding towards rapid vessel biofabrication. Trends Biotechnol. 26 (6), 338-344 (2008).
- Mattix, B. M., et al. Janus magnetic cellular spheroids for vascular tissue engineering. Biomaterials. 35 (3), 949-960 (2014).
- Henstock, J., El Haj, A. Controlled mechanotransduction in therapeutic MSCs: can remotely controlled magnetic nanoparticles regenerate bones? Regen Med. 10 (4), 377-380 (2015).
- Fayol, D., et al. Use of magnetic forces to promote stem cell aggregation during differentiation, and cartilage tissue modeling. Adv Mater. 25 (18), 2611-2616 (2013).
- Bartlett, W., et al. Autologous chondrocyte implantation versus matrix-induced autologous chondrocyte implantation for osteochondral defects of the knee: a prospective, randomised study. J Bone Joint Surg Br. 87 (5), 640-645 (2005).
- Batty, L., Dance, S., Bajaj, S., Cole, B. J. Autologous chondrocyte implantation: an overview of technique and outcomes. ANZ J Surg. 81, 18-25 (2011).
- Song, L., Baksh, D., Tuan, R. S. Mesenchymal stem cell-based cartilage tissue engineering: cells, scaffold and biology. Cytotherapy. 6 (6), 596-601 (2004).
- Boeuf, S., Richter, W. Chondrogenesis of mesenchymal stem cells: role of tissue source and inducing factors. Stem Cell Res Ther. 1 (4), 31 (2010).
- Kock, L., van Donkelaar, C. C., Ito, K. Tissue engineering of functional articular cartilage: the current status. Cell Tissue Res. 347 (3), 613-627 (2012).
- Schon, B. S., et al. Validation of a high-throughput microtissue fabrication process for 3D assembly of tissue engineered cartilage constructs. Cell Tissue Res. , (2012).
- Robert, D., et al. Magnetic micro-manipulations to probe the local physical properties of porous scaffolds and to confine stem cells. Biomaterials. 31 (7), 1586-1595 (2010).
- Luciani, N., et al. Successful chondrogenesis within scaffolds, using magnetic stem cell confinement and bioreactor maturation. Acta Biomaterialia. 37, 101-110 (2016).
- Wilhelm, C., Gazeau, F. Universal cell labelling with anionic magnetic nanoparticles. Biomaterials. 29 (22), 3161-3174 (2008).
- Fayol, D., Luciani, N., Lartigue, L., Gazeau, F., Wilhelm, C. Managing magnetic nanoparticle aggregation and cellular uptake: a precondition for efficient stem-cell differentiation and MRI tracking. Adv Healthc Mater. 2 (2), 313-325 (2013).
- Wilhelm, C., Gazeau, F., Bacri, J. C. Magnetophoresis and ferromagnetic resonance of magnetically labeled cells. Eur Biophys J. 31 (2), 118-125 (2002).
- Autissier, A., Le Visage, C., Pouzet, C., Chaubet, F., Letourneur, D. Fabrication of porous polysaccharide-based scaffolds using a combined freeze-drying/cross-linking process. Acta Biomater. 6 (9), 3640-3648 (2010).
- Singh, N., Jenkins, G. J. S., Asadi, R., Doak, S. H. Potential toxicity of superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPION). Nano Reviews. 1, (2010).
- Lee, J. H., Hur, W. Scaffold-free formation of a millimeter-scale multicellular spheroid with an internal cavity from magnetically levitated 3T3 cells that ingested iron oxide-containing microspheres. Biotechnol Bioeng. 111 (5), 1038-1047 (2014).
- Mattix, B., et al. Biological magnetic cellular spheroids as building blocks for tissue engineering. Acta Biomaterialia. 10 (2), 623-629 (2014).
- Mazuel, F., et al. Massive Intracellular Biodegradation of Iron Oxide Nanoparticles Evidenced Magnetically at Single-Endosome and Tissue Levels. ACS Nano. 10 (8), 7627-7638 (2016).
- Kim, J. A., et al. High-throughput generation of spheroids using magnetic nanoparticles for three-dimensional cell culture. Biomaterials. 34 (34), 8555-8563 (2013).
- Shimizu, K., Ito, A., Honda, H. Enhanced cell-seeding into 3D porous scaffolds by use of magnetite nanoparticles. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 77 (2), 265-272 (2006).
- Sensenig, R., Sapir, Y., MacDonald, C., Cohen, S., Polyak, B. Magnetic nanoparticle-based approaches to locally target therapy and enhance tissue regeneration in vivo. Nanomedicine (Lond). 7 (9), 1425-1442 (2012).
- Waldman, S. D., Couto, D. C., Grynpas, M. D., Pilliar, R. M., Kandel, R. A. Multi-axial mechanical stimulation of tissue engineered cartilage: review. Eur Cell Mater. 13, 66-74 (2007).
- Takahashi, I., et al. Compressive force promotes sox9, type II collagen and aggrecan and inhibits IL-1beta expression resulting in chondrogenesis in mouse embryonic limb bud mesenchymal cells. J Cell Sci. 111 (14), 2067-2076 (1998).
- Campbell, J. J., Lee, D. A., Bader, D. L. Dynamic compressive strain influences chondrogenic gene expression in human mesenchymal stem cells. Biorheology. 43, 455-470 (2006).
- Vunjak-Novakovic, G., et al. Bioreactor cultivation conditions modulate the composition and mechanical properties of tissue-engineered cartilage. J Orthop Res. 17 (1), 130-138 (1999).
