Summary
줄기 세포에서 연골은 배양 조건 미세 조정이 필요합니다. 여기, 우리는 세포를 응축위한 자기 접근 방식을 제시 필수적인 단계는 연골을 시작합니다. 또, 생물 반응기의 동적 숙성은 셀룰러 구조에 기계적 자극을 적용 연골 세포 외 기질 생산 향상을 보여준다.
Abstract
연골 엔지니어링은 기본 조직과 유사한 체외 기능 임플란트를 만드는 어려움으로 인해 도전 남아있다. 최근자가 교체의 개발을위한 탐구 접근 방법은 연골 세포로 줄기 세포의 분화를 포함한다. 이 연골, 필요한 줄기 세포의 압축 정도를 시작하려면; 따라서, 우리는 세포 어 트랙터로 소형화 자장 소스를 사용, 두꺼운 발판과 발판이없는 내 모두 자기 응축 세포의 가능성을 보여 주었다. 이 자기 방식도 집계 융합을 안내하고 비계가없는 조직 구축하는 데 사용 된, 3 차원 (3D)은 크기가 몇 mm를 어떤 조직이. 강화 된 크기를 갖는 외에, 자기 구동에 의해 형성된 융합 조직 콜라겐 II의 발현의 상당한 증가를 제공하고, 유사한 경향 aggrecan 발현이 관찰되었다. 네이티브 연골은 힘 t 하였다으로모자의 3 차원 구조에 영향을 동적 숙성도 수행 하였다. 기계적인 자극을 제공하는 생물 반응기에서는 21 일 동안 배양하여 자기 시드 지지체를 이용 하였다. 생물 반응기의 성숙은 크게 cellularized 지지체에 연골을 개선; 이러한 조건에서 얻어진 세포 외 기질은 콜라겐 II 및 aggrecan 풍부 하였다. 이 작업은 개선 된 연골 세포 분화, 양쪽 발판없고 내의 다당류 골격 용 생물 반응기에 표시된 줄기 세포의 자기 축합 동적 숙성 혁신적인 전위를 설명.
Introduction
자기 나노 입자는 이미 자기 공명 영상 (MRI)을위한 조영제로 병원에서 사용하고 있으며, 자신의 치료 응용 프로그램을 확대 유지. 예를 들어, 최근 표지 세포 주입 1, 2, 3의 정의 된 부위에서 외부 자기장을 이용하여 생체 내에서 조작 될 수 있고, 지시 된 수 및 / 또는 유지하는 것이 밝혀졌다. 재생 의학, 그들은 혈관 조직 5, 6, 7, 골 8, 연골 (9)를 포함하여 체외 4 조직 조직, 엔지니어링 할 수 있습니다.
관절 연골이 손상이 발생할 때 매우 제한된 세포 외 기질 성분의 수리를, 무혈성 환경 내에 침지된다. 이러한 이유로, researc 위해H는 현재 결함 부위에 이식 할 수 유리질 연골 대체의 기술에 집중된다. 다른 연골 (12, 13)로 분화하는 중간 엽 줄기 세포 (MSC)의 용량을 강조하면서자가 여분을 생성하기 위해, 몇몇 연구 그룹은 셀 소스 (10), (11)자가 연골 세포의 사용을 연구하고있다. 자신의 골수 채취가 매우 간단하고 자신의 표현형 (14)를 잃을 위험이 건강한 연골 세포의 희생을 필요로하지 않기 때문에 여기에 효과적으로 요약 이전의 연구에서, 우리는 MSC를 선택했습니다.
줄기 세포의 연골 분화를 시작하기에 필수적인 초기 단계는 자신의 응축이다. 셀 집계는 일반적으로 원심 분리 또는 micromass 문화 (15)을 사용하여 형성된다; 그러나, 이러한 방법은 축합 neitheR 두꺼운 발판이나 골재의 융합을 조절하는 세포 내 전위 클러스터를 생성 할 가능성을 제시한다. 본 논문에서는 MSC 자기 라벨 및 자기 인력을 이용하여 줄기 세포를 응축에 대한 혁신적인 접근 방식을 설명합니다. 이 기술은 밀리미터 크기의 연골 조직 (9)을 얻기 위해 서로 골재의 융합을 통해 비계가없는 3 차원 구조를 형성하기 위해 입증되었습니다. 두껍고 큰 비계의 자기 시드 또한 설계 조직의 크기를 증가 이식에 대한 더 쉽게 도움을 모양을 디자인하고, 연골 수리 임상 적용의 가능성을 다양 화의 가능성을 허용했다. 여기서, 천연 다당류, 풀루 란, 덱스 트란으로 이루어지는 다공질 지지체에 MSC 자기 시딩 우리 상세히 프로토콜은 비계 이전 줄기 세포 (16) (17)를 한정하기 위해 사용된다. 연골 분화하면 마지막이었다Y는 세포 고밀도 시드 골격의 매트릭스 코어에 연속 영양소 및 기체 확산을 위해 생물 반응기에서 수행 하였다. 세포에 영양분, 연골 세포 성장 인자, 가스를 제공하는 외에, 생물 반응기는 기계적인 자극을 제공했다. 전반적으로, 생물 반응기의 동적 숙성과 함께 줄기 세포를 한정하는 데 사용되는 자기 기술은 현저 연골 분화를 향상시킬 수있다.
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Protocol
마그네틱 장치 1. 건설
주 : 세포 접종에 사용하는 장치는 애플리케이션에 따라서 변경 (도 1). 자기 팁 (지름 750 μm의) 매우 얇아 야하므로 응집체를 형성하는 셀의 수는 2.5 × 105 / 집합으로 제한된다. 1.8 / ㎠ 7mm 두께 발판 종자, 자석은 크게 (직경 3mm)이어야하고, 지지체의 세공을 세포 이동을 보장한다.
- 골재 형성을위한 미세 자석 장치의 구성 (도 1a)
- 알루미늄 판을 통해 0.8 mm의 드릴로 미세 구멍 (직경 3cm, 6 mm 두께)을 만든다.
- 플레이트의 각 구멍에 자기 팁 (지름 750 μm의)을 삽입한다.
- 포화 자화를 보장하는 영구 네오디뮴 자석, 이상이 디스크를 넣습니다.
- 비계 파종위한 장치의 건설 (
- 2.4 cm 2 제곱에 하드 컷 폴리스티렌.
- 1.6 cm (2)의 면적에 걸쳐 동일한 간격으로 9 개 작은 자석 (직경 3mm, 길이 6mm)을 삽입한다.
- 영구 네오디뮴 자석을 통해이 장치를 놓습니다.
2. 줄기 세포의 라벨링
주 : 30 분 (5 ± 0.4 PG 철 / 셀) 시드 0.2 mM의 자성 나노 입자로 표지 동안 줄기 세포를 30 분 (2.6 ± 0.2 PG 철 / 셀) 집합체를 형성하기 위해 0.1 mM의 자성 나노 입자로 표지 된 비계. 이들 나노 입자의 농도 및 배양 시간은 이전에 사용하고 MSC 및 다른 셀 (18, 19)으로 제작하고,이 나노 입자는 세포 생존도 MSC이나 분화 능력에 영향을 판단되어왔다. 줄기 세포에 의해 혼입 된 철 질량 단일 CE 통해 측정LL의 자기 19, 20.
- 근처까지 37 ° C, 5 % CO 2에서 완전한 중간 엽 줄기 세포 성장 매체 (MSCGM) 문화 인간 중간 엽 줄기 세포 (MSC)는 (~ 90 %)을 합류한다.
- 글루타민없이 로스웰 파크 메모리얼 연구소 (RMPI)에서 변성 무 혈청 맥코이의 5A 배지 및 5를 포함하는 : 0.1 또는 0.2 밀리미터 마그 헤 마이트, 시트르산 피복 산화철 (8 nm의 직경 코어 γFe 2 O 3)을 혼합하여, 자기 라벨 솔루션을 준비 mM의 시트르산 나트륨.
- 상기 배지를 폐기 글루타민없는 무 혈청 RPMI 배지로 세포를 린스하고, 150 cm 2 배양 플라스크, 전체 셀을 커버하기 위해 필요한 최소 체적 당의 철 산화물 나노 입자 용액 10 mL를 넣고.
- 37 ° C에서 30 분, 5 % CO 2 동안 배양 한 다음 나노 입자 용액을 버린다. 유모를 내면화하는 글루타민없이 무 혈청 RPMI 배지 5 분간 씻어oparticles 여전히 세포막에 부착.
- RPMI 매체를 취소하고 플라스크 당 전체 MSCGM 매체의 25 mL를 넣어. 37 ℃에서 밤새 인큐베이션하고, 5 % CO 2.
3. 자기 셀 시드
- 갓 50 μM L- 아스코르브 산 2 인산, 0.1 μM 덱사메타손 (dexamethasone), 1 mM 피루브산 나트륨, 0.35 밀리미터 L 프롤린, 1 % 범용 배양을 첨가하여 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM) L 글루타민 높은 포도당을 이용하여 연골 매체를 준비 인슐린, 인간 트랜스페린 및 selenous 산 (ITS-프리믹스) 10 NG / ㎖ 형질 전환 성장 인자 베타 3 (TGF-β3)을 포함하는 보충.
- 5 분 동안 260 × g에서 0.05 % 150 cm-2 배양 플라스크 당 트립신 EDTA 및 원심 분리기의 해리 된 세포를 8 mL로하여, 자기 세포 분리. 배지를 흡인하고, 세포를 재현 탁 계산.
- 양 자기 소자의 상부에 유리 바닥 세포 배양 페트리 접시 (35mm)를 놓는다.
- m으로agnetically 집합체 당 (증착 될 수있다 (16) 집계까지) 2.5 × 105 개 표지화 된 세포를 포함하는 가능한 가장 작은 양 (더 8보다 μL)을 증착 부드럽게 페트리 접시에 연골 매체 3 mL를 첨가하고, 응집물을 형성한다. 이 구 상체를 형성 할 수 있도록하여 이동하지 않고 20-30 분 동안 배양 접시 두었다가 37 ° C, 5 % CO 2의 인큐베이터에, 16 응집체를 함유하는 페트리 접시를 포함하여 전체 장치를 배치했다.
- 양식 제어 집계는 동일한 프로토콜을 다음과 TGF-β3없이 연골 매체 전체 매체를 교체합니다.
- , 3 차원 집계 구조를 생성 8 이중선을 형성하고 융합을 시작 8 일째에 접촉이 집계를 놓습니다. 하루 11, 4 네 쌍둥이를 형성하기 위해 2 개의 이중 병합합니다. 마지막으로, 최종 구조물을 얻기 위해 15 일에 4 네 쌍둥이 퓨즈.
- 동시에 × 105 2.5 원심 분리하여 응집체를 형성 (260)에서 줄기 세포를 표지(15); 또는 TGF-β3없이 연골 배지 1.5 mL를 15-㎖의 튜브에 5 분간 g (샘플 및 제어를위한 각각).
- 종자 발판 자기 적하려면 페트리 접시에 각각 건조 발판을 놓습니다. 풀루 란 / 덱스 트란 (21)로 이루어진 다당류 다공성 지지체를 사용합니다. 각 지지체를 들어, TGF-β3없이 연골 배지 350 μL, 2 × 106 표지 줄기 세포를 희석 신중 지지체 상에 세포를 피펫.
- 골격 내의 전체 세포 침투를 허용하기 위해 37 ℃에서 5 분 동안 인큐베이션 한 다음 부드럽게 또는 페트리 접시 (각각 시료 또는 제어를위한) TGF-β3없이 연골 배지 3 ㎖을 추가한다.
- 골격 기공 한정 통해 세포 이동을 허용하도록 2 내지 4 일 동안 37 ° C CO에서의 자기 장치의 발판 cellularized 부화 5 %.
- 동시에, 함께 발판을 시드 2 × 10 (6)
연골 세포로의 분화 (4)
참고 : 배양 4 일 후, 자석을 제거하고 연골 성숙 중 하나를 페트리 접시 (정적 상태) 또는 생물 반응기 (동적 조건)에서에 계속. 대조군 샘플은 TGF-β3없이 연골 매체 정적 조건에서 숙성된다.
- 정적 조건에서, 같은 배양 접시에서 cellularized 비계 또는 집계를 유지한다. 이십일일을 위해 일주일에 두 번 연골 매체를 변경합니다.
- 동적 상태에서 생물 반응기를 준비한다.
- 제조 업체의 프로토콜에 따라 적절한 길이로 실리콘 튜브를 잘라.
- 500 ㎖의 배양 챔버, 튜브, 2 웨이 회전기 및 케이지 모든 재료를 압력솥.
- 멸균 microbio로 생물 반응기의 부품 배치논리적 안전 역. 제조업체의 지침에 따라 2 방향 회전기와 문화 챔버에 튜브를 연결합니다.
- 조심 멸균 주걱을 이용하여 살균 케이지로 cellularized 발판 옮긴다. 케이지 당 2 발판을 놓습니다. 새장 준비가되면, 더 회전시 이동을 유지하기 위해 뚜껑의 바늘에 삽입. 연골 배지로 배양 챔버를 채우고 케이지를 함유하는 뚜껑을 닫는다.
- 연골 매체와 튜브를 채우기 위해 기포를 제거하기 위해 연동 펌프를 켭니다.
- 두고 바이오 리액터의 모터로 채워진 챔버를 고정하고 암과 챔버 모두 회전을 제어하는 컴퓨터를 켜.
- 암부와 챔버 모두에 5 분당 회전 수 (rpm)의 회전을 적용한다. cellularized 비계의 연속 급지 10 rpm의 유속으로 연동 펌프를 조정한다.
참고 : RNA 추출에 앞서, 효소 솔루션으로 발판을 소화.
- 풀루 100 μL (40 U / ㎖) 및 무 혈청 DMEM 배지에 850 mL의 dextranase 50 μL (60 ㎎ / ㎖)을 첨가하여 효소 용액 1 ㎖를 준비한다.
- , 무 혈청 DMEM 배지로 두 번 발판을 씻어 매체를 폐기하고, 비계 당 효소 용액 800 μL를 추가합니다. 부드러운 교반하에 37 ℃에서 15-30 분 동안 인큐베이션.
- 발판이 완전히 용해 될 때 신중 매체 대기음, 10 분 동안 300 × g에서 ㄱ 1.5mL 용량 튜브에 세포를 포함하는 용액을 원심 분리 전송 × 1 멸균 인산 완충 식염수 (PBS), 원심 분리기의 회 씻어 300 × 10 분간 g 및 RNA 분리 용액으로 세포를 재 - 보류.
- , 집계에서 RNA를 추출 RNA 분리 용액에 회전 타원체를 배치하고완전히 RNA 추출을 수행하기 전에 호모 게 나이저를 사용하여 분쇄.
- 제조업체의 지침에 따라 총 RNA 추출을위한 키트를 사용하여 RNA를 분리합니다.
- ,의 dNTP 믹스 1 μL (10 mM의 각), 40 U / ㎖의 RNase 억제제 랜덤 프라이머 250-ng를 사용하여 제조사의 지침에 따라 역전사 효소를 이용하여 총 RNA의 400 ng의 보완적인 DNA 합성; 반응의 최종 부피는 20 μL이다. 반응의 끝에서 100 μL의 최종 용적을 수득 증류수 80 μL를 추가한다.
- 정량적 폴리머 라제 연쇄 반응 (PCR)의 경우, 10 배 희석 된 cDNA와 같은 aggrecan (AGC) 및 콜라겐 II (골 II) 등의 관심의 유전자의 상대적인 발현을 정량화하는 형광 시약을 포함하는 PCR 혼합물을 사용한다. 기준 유전자 리보솜 단백질 대형 P0 (RPLP0)으로 유전자 발현의 수준을 정상화. ΔΔCT 식 - 2로 계산을 수행, ΔΔCT = ΔCT 차별화 조건 곳 - 제어 ΔCT 조건을 의미하고, 각 ΔCT 관심 유전자의 CT 나타냄 - 참조 유전자 (RPLP0)의 CT.
- 평균 값은 평균 (SEM)의 표준 오차를 ± 통계적 측정치를 결정한다. n 개의 ≥ 2 독립적 인 실험과 분석을 수행합니다. 원심 펠렛 자기 융합 (* p <0.05)의 통계적 차이를 분석하기 위해 스튜던트 t 검정을 사용한다. 제어 지지체 차별화 발판 사이와 통계적 차이 (* p <0.05)을 분석하는 크루스 칼 - 월리스 시험 (일방향 ANOVA의 비모수)와 중요도를 결정한다.
6. 조직 학적 분석
- 멸균 1 × PBS로 cellularized 지지체 또는 응집체 린스 1 시간 동안 실온에서 10 % 포르말린 용액에 이들을 고정, 1 × PBS로 헹군다.
- 의 PBS를 제거 최적의 해부 할에 샘플을 포함g 온도 화합물 OCT () 및 액체 질소에 침지 펜탄 욕이를 동결. -20 ° C에서 샘플을 저장합니다. 응집체 또는 cellularized 골격 12 μm의 8 μm의 저온부를 획득하기 위하여 저온 유지 장치로 샘플을 잘라.
- 톨루엔을 사용하여 명확히, 100 % 에탄올로 탈수시키고, 수돗물로 헹구고, 2 분 동안 0.5 % 톨루이딘 블루 용액으로 저온부를 염색하고 광학 현미경위한 장착 매체 슬라이드 마운트.
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Representative Results
우선, 골재를 개별적으로 2.5 × 105 개 표지 줄기 세포를 (도 2A)을 증착에 의해 미소 자석을 사용하여 형성 될 수있다. 이 하나의 집합체 (~ 크기가 0.8 mm)는 다음 순차적으로, 자기 유도 융합에 더 큰 구조 덕분에 융합 될 수있다. 예를 들어, 연골 성숙의 8 일째에, 집계는 이중선을 형성하는 한 쌍의 접촉에 넣고; 네 쌍둥이 2 이중선을 병합하여 11 일째에 조립 하였다; 마지막으로, 15 일째에, (4) 네 쌍둥이 4 × 106 세포 (~ 사이즈 4mm) (도 2B)의 합계와, 초기에 형성된 응집물 (16)을 포함하는 3 차원 구조물을 형성하기 위해 융합 하였다. 둘째, 동일한 자력 기술은 발판 내의 세포 집합체를 형성하기 위해 사용되어왔다. 지지체는 자기 소자를 통해 접종 하였다 조밀 (도 2c 정확한 마이크로 자석 위치에서 상기 지지체의 세공 내에 세포를 농축 보였다). 세포가 자력 (수동 시드)없이 지지체 내에 파종 하였다 대조적으로, 그들은 균일하게 분포되는 것으로 밝혀졌다. Cellularized 지지체는 동적 숙성 조건 (도 3b) 하에서 연골 프로세스를 수행하는 생물 반응기 챔버에 부착 케이지 (도 3A)에 삽입 하였다. 이러한 생물 반응기는 영양과 가스 교환을 개선하고 전달함으로써 기계적 자극을 제공한다. 부드러운 3 차원 조직 재생의 생성자에서 권장하는대로 팔과 챔버 모두의 회전 속도는 5 rpm으로 조정 하였다. 매체의 연속적인 공급을 제공하는 연동 펌프를 10 rpm으로 설정 하였다.
모든 세포 조직의 조건 (용융 골재 골격 내의 시드) 및 (생물 반응기 내에서 또는없이) 조직의 성숙, 유전자 발현은 25 일에 분석 하였다 자기 융착에 의해 형성된 조직이 유의 나타났다함께 aggrecan 발현의 증가 추세를 원심 분리 (도 4a)에 의해 얻어진 펠릿에 비해 콜라겐 II 발현 ficant 증가. cellularized 지지체를 들어, 우리의 증가를 수득 aggrecan 및 골격은 자력없이 시드에 비해 콜라겐 II 발현은 유의 한 콜라겐 II-때 자기 시드를 사용 하였다. 또한, 두 유전자의 발현은 자기 시드 동적 분화 (도 4b)와 결합 될 때 (골 상당한 II) 더 높았다.
조직 학적 분석은 또한 글리코 사 미노 글리 칸 (GAG)을 공개하는 톨루이딘 블루 염색을 이용하여, 예를 들면, 수행 하였다. 청색 - 보라색 (도 5a)에 의해 대해서 분명히으로 16 개 골재의 연속 자기 융합, GAG 풍부한 침착을 나타내었다. 공사장 공중 발판를 들어, 만 자기 톨루이딘 블루 염색 하였다 시드. GAG conten골격은 바이오 리액터 (도 5b)보다 정적 (도 5c)에서 구별 될 때 t는 높았다. 종합적으로, 이러한 결과는 연골을 향상 골격 내에 자성 응집 자기 시드의 가능성을 보여준다. 또한 생물 반응기 내에서 동적 성숙 조건이 훨씬 더 유리한 효율적으로 차별화 있음을 나타냅니다.
상기 자기 소자도 1 건설. (A) 응집체를 형성하기위한 자기 장치의 예 : 알루미늄 판 (0.8 ㎛의 직경의 구멍)을 드릴로 구멍을 뚫고, 팁은 각각의 구멍에 삽입 된 후, 포화 자화를 확보 영구 네오디뮴 자석에 배치. (B) 자기 장치는 지지체 시드 9 개 직접 만든 구멍이었다 (24mm 2)와 하드 폴리스티렌포화 자화를 확보 영구 네오디뮴 자석에 배치. 소형 자석 (직경 3mm) 다음 장치를 형성하는 각 구멍에 삽입 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
줄기 세포 및 시드 2. 자기 라벨 그림. (A) 세포는 37 ° C에서 30 분 동안 철 산화물 나노 입자로 표지 된 줄기. (B) 16 타원체 미소 자석의 네트워크에 흡착 표지화 된 세포에서 형성되었다. 응집체 3 일 전에 형성된 이중선의 융합에 의해 하루 11에 네 쌍둥이로 통합되었다. 네 쌍둥이는 최종 설계 조직을 구성하기 위해 하루 15에 융합되었다. 유리 - 바닥 접시에 넣고, (C)는 비계, 또는 글로리밖으로 자기 힘. 세포가 균일하지 않고 자석 시드 골격에 분포 등장하면서 4 일째, 괴성 줄기 세포의 반점은 자기 시드 지지체 관찰되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
cellularized 비계 3. 동적 성숙을 그림. 자기 또는 수동 파종 후 (A)는 cellularized 발판은 방해를 피하기 위해 케이지에 넣었다. 캡의 바늘을 사용하여 고정 (B) 케이지, 연골 매체로 채워진 바이오 리액터의 용기에 넣었다. 바이오 리액터는 독립적으로 제어 된 속도 (12 rpm으로 아암 챔버 각각에 대한 1-35 RPM)와 축 회전을 적용 하였다. 연동 펌프가 연속적으로 제공 메디칼음. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
25 일 연골 세포에서 특정 유전자의 발현은도 4 (A)의 MSC 타원체의 자기 유도 융합 원심 분리에 의해 형성된 펠릿에 비해 콜라겐 II의 상당한 증가를 나타내었다. * 스튜던트 t 검정 (p 값 <0.05)를 사용하여 통계적으로 유의 한 차이를 나타낸다. (B) II 명확 생물 반응기에 자기 시드 동적 숙성의 조합으로 구별 발판 증가 하였다 aggrecan 콜라겐의 발현. 유전자의 mRNA 발현은 RPLP0 정규화했고 (1 ~ ± SEM)를 제어하는 임의의 장치에 대하여 표현. 결과는 2 ~ 4 개의 독립적 인 실험 ± SEM 의미로 표시된다. * deno크루스 칼 - 월리스 시험 (일방향 ANOVA 비모수 시험) (p 값 <0.05)를 사용하여 통계적으로 유의 한 차이를 TES. (-) : 자석없이 파종; (+) : 자력으로 시드. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
25. 글리코 사 미노 글리 칸 (GAG) 보증금은 청자색 착색에 의해 입증되는 날에 글리코 사 미노 글리 칸의 그림 5. 조직 학적 염색. (A)는 포지티브 톨루이딘 블루 염색 16 응집체의 연속 용융에 의한 최종 연골 구조의 8 ㎛의 저온부에서 관찰되었다. 자기 정적 (B) 후에 시드 지지체 또는 동적 (C)의 조건으로 12 ㎛의 저온부 분명히 보여그 GAG 함량은 생물 반응기에서 차별화 된 발판에서 높았다. 화살표 분화 된 세포의 집계를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에 제시된 기술은 자성 나노 입자의 국제화에 의존하기 때문에 그들이 세포 내 지역화하면 첫째, 하나의 중요한 문제는 나노 입자의 결과이다. 이는 철 나노 입자 잠재 독성 또는 노광 (19), (22)의 크기, 코팅, 및 시간에 따라 손상 분화 능력을 트리거 할 수 있다는 사실이다. 캡슐화 철 나노 입자의 형태 magnetoferritin 생물학적 자성 나노 입자 (24) (23)을 사용하고, 또는 단순 시트르산 코팅 적절한 농도로 사용 된 18 그러나, 몇몇 연구는 세포 생리학에 영향을 보이지 않고있다. 또한, 산화철 나노 입자 (MSC와 연골 용)이 논문에서 설명 된 것과 유사한 조건에서 사용될 때, 최근 증명 그 nanoparti의 신속하고 거의 전체 저하사이클 사용은 세포의 설립 및 MSC의 회전 타원체의 형성시 약 10 일 내에 엔도 좀 내에서 발생합니다. 흥미롭게도,이 거대한 저하는 페리틴 단백질 내에서 무료 철의 효율적인 저장과 연관이 있었다와 미래의 임상 응용 (25) 잘 본딩, 세포 철 대사에 매우 제한적인 영향의 결과.
또 다른 중요한 점은 연골을 시작하는 세포 압축의 요구 사항입니다. 통상적으로, 세포의 축합은 원심 분리를 통해 달성되고; 그러나,이 방법은 세포의 낮은 숫자 (이상, 2.5 × 105 개 세포)에 의해 제한된다. 이 숫자 과거, 영양소와 가스는 세포 괴사를 유발, 골재의 중심에 확산 할 수 없다. 여기에서, 골재로 표지 된 줄기 세포의 자기 축합은 3D는 연골 조직의 재생을 위해 구축 형성하는 중요한 방법으로 나타난다. 이러한 자기 절차는 다른 저자들에 의해 사용되어왔다3D 타원체 구축 : 자기 부상에 의해 자계 (26)를 현지화하는 셀 (23)의 철 핀 해리 후에 판의 상부에 배치 된 자석. 그러나, 자기 부상은 총 융합 상기 단계에 적합하지 않는 것. 자기 여기 방법이 제안과 대조적으로, 우리는 단계별 연골 조직 구조를 얻기 위해 모든 융합 단계를 제어 할 수있다. 요컨대, 이러한 다단계 공정은 골재 빌딩 블록으로 줄기 세포를 한정 시작하고 큰 구조에서 이러한 블록의 융합 따른다. 이 지지체없는 줄기 세포 응집 과정의 주요 단계는 다음과 같다 : 첫째, 하나 하나의 단일 대형의 형성을 방지하기 위해, 융합 단계를 제어하며, 가능한 한 제로서 세포의 작은 부피와 각각의 집합체를 형성해야 골재. 여기에서 얻어진 조직은 콜라겐 II와 aggrecan이 풍부했다. 또한 advantag 제시가요 형상 및 크기를 갖는 발판과 무되는 ES.
자기 방식은 두껍고 큰 골격 내의 줄기 세포를 유도하는 데 사용되었다; 다양한 모양과 크기의 디자인에 대한 또 다른 대안. 세포의 전반적인 균일 한 분포를 가지고 너무 적은 없으며, 너무 많은 셀 손실을 피하기 위해 둘 : 여기에서 중요한 단계는 세포의 적절한 볼륨으로 발판을 시드 (seed)하는 것입니다. 자기 힘은 이전에 유치하고 비계 내에서 세포를 유지하고 세포 시딩 (27), (28)을 강화하기 위해 사용되었다. 여기서, 다당류 지지체의 기공 내에서 충분한 세포 응축 성공 연골되었다. 자화 cellularized 지지체는 그 이축 회전 생물 반응기 덕분에 의해 제공된 전달 / 전단 스트레스 자극에 노출 될 때 세포 외 기질 생산은 현저하게 향상되었다. 그것은 MUL 다른 연구에서 밝혀졌다TI 축 하중 조건은 연골 조직 (29)으로부터 형성의 품질을 향상시켰다. 단 압축력은 30, 31, 32에 적용되는 기존의 기술과 비교했을 때 신규 생물 반응기 개념은 실제 이득을 제공한다.
결론적으로, 연골 분화를 위해, 표지 된 줄기 세포의 자기 한정의 사용 형태 조작 응집체뿐 아니라 mm 크기의 연골 세포 구조의 생성을 허용 비계 종자한다. 또한, 동적 차별화와 자기 세포 파종을 결합하는 재생 의학 애플리케이션을위한 가치있는 새로운 도구를 제공합니다.
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
저자는 생물 반응기와의 도움을 QuinXell 기술 및 CellD, 특히 로타르 그래너만 도미니크 Ghozlan을 인정하고 싶습니다. 우리는 풀루 란 / 덱스 트란 다당류 발판으로 우리를 제공 캐서린 르 화장을, 감사합니다. 이 작품은 유럽 연합 (ERC-2014-COG 프로젝트 마티스 648779)에 의해 그리고 AgenceNationalede 라 공들인 (ANR), 프랑스 (MagStem 프로젝트 ANR-11 SVSE5)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Iron oxide (maghemite) nanoparticules (γ-Fe2O3) | PHENIX - University Paris 6 | Made and given by C. Ménager | Mean diameter of 8.1 nm and negative surface charge |
| Polysaccharide Pullulan/Dextran scaffolds | LIOAD - University Nantes | Made and given by C. Le Visage | Prepared from a 75:25 mixture of pullulan/dextran in alkaline conditions (10 M NaOH). Porosity: 185-205 µm; Thickness: 7 mm; Surface area: 1.8 cm2. |
| TisXell Regeneration System | QuinXell Technologies | QX900-002 | Biaxial bioreactor with 500 mL culture chamber |
| Cage for scaffolds: Histosette II M492 | VWR | 720-0909 | |
| Mesenchymal Stem Cell (MSC) | Lonza | PT-2501 | Three independant batches have been used |
| MSCGM BulletKit medium | Lonza | PT-3001 | For the complete medium, add the provided BulletKit (containing serum, glutamine and antibiotics) to the MSCGM medium |
| DMEM with Glutamax I | Life Technologies | 31966-021 | No sodium pyruvate, no HEPES |
| RPMI medium 1640, no Glutamine | Life Technologies | 31870-025 | No sodium pyruvate, no HEPES |
| PBS w/o CaCl2 w/o MgCl2 | Life Technologies | 14190-094 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25300-054 | |
| Penicillin (10,000 U/mL) / Streptomycin (10,000 µg/mL) | Life Technologies | 15140-122 | |
| ITS Premix Universal Culture Supplement (20x) | Corning | 354352 | |
| Sodium pyruvate solution 100 mM | Sigma | S8636 | |
| L-Ascorbic Acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | Prepare the concentrated solution (25 mM) in distilled water extemporaneously |
| L-Proline | Sigma | P5607 | Prepare the 175 mM stock solution diluted in distilled water and store at 4 °C |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | Prepare the 1 mM stock solution diluted in Ethanol 100% and store at -20 °C |
| TGF-beta 3 protein 10 µg | Interchim | 30R-AT028 | |
| Tri-sodium citrate | VWR | 33615.268 | Prepare the 1 M stock solution diluted in distilled water and store at 4 °C |
| Pullulanase from Bacillus acidopullulyticus | Sigma | P2986 | |
| Dextranase from Chaetomium erraticum | Sigma | D0443 | |
| NucleoSpin RNA Extraction Kit | Macherey-Nagel | 740955.5 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Life Technologies | 18064-014 | |
| Random Primer - Hexamer | Promega | C1181 | 500 µg/mL: Use diluted 1/2 and put 1 µL per sample |
| Recombinant RNAs in ribonuclease inhibitor | Promega | N2511 | 40 U/µL: put 1 µL per sample |
| PCR nucleotide dNTP mix (10 mM each) | Roche | 10842321 | |
| SyBr Green PCR Master Mix | Life Technologies | 4368708 | |
| Step One Plus Real-Time PCR System | Life Technologies | 4381792 | |
| Formalin solution 10% neutral buffered | Sigma | HT5012 | |
| OCT solution | VWR | 361603E | |
| Isopentane | Sigma | M32631 | |
| Toluidine blue O | VWR | 1.15930.0025 | |
| Ethanol absolute | VWR | 20821.310 | |
| Toluene | VWR | 1.08323.1000 | |
| Mounting medium Pertex | Histolab | 840 | |
| RPLP0 Primer for qPCR | Eurogentec | 5'-TGCATCAGTAC CCCATTCTATCAT-3'; 5'-AAGGTGTAATC CGTCTCCACAGA-3' |
|
| Aggrecan Primer for qPCR | Eurogentec | 5'-TCTACCGCTGCGAGGTGAT-3'; 3'-TGTAATGGAACACGATGCCTTT-5' | |
| Collagen II Primer for qPCR | Eurogentec | 5'-ACTGGATTGACCCCAACCAA-3'; 3'-TCCATGTTGCAGAAAACCTTCA-5' |
References
- Naumova, A. V., Modo, M., Moore, A., Murry, C. E., Frank, J. A.
- Edmundson, M., Thanh, N. T., Song, B. Nanoparticles based stem cell tracking in regenerative medicine. Theranostics. 3 (8), 573-582 (2013).
- Di Corato, R., et al. High-resolution cellular MRI: gadolinium and iron oxide nanoparticles for in-depth dual-cell imaging of engineered tissue constructs. ACS Nano. 7 (9), 7500-7512 (2013).
- Xu, F., et al. Three-dimensional magnetic assembly of microscale hydrogels. Adv Mater. 23 (37), 4254-4260 (2011).
- Kito, T., et al. iPS cell sheets created by a novel magnetite tissue engineering method for reparative angiogenesis. Sci Rep. 3, 1418 (2013).
- Mironov, V., Kasyanov, V., Markwald, R. R. Nanotechnology in vascular tissue engineering: from nanoscaffolding towards rapid vessel biofabrication. Trends Biotechnol. 26 (6), 338-344 (2008).
- Mattix, B. M., et al. Janus magnetic cellular spheroids for vascular tissue engineering. Biomaterials. 35 (3), 949-960 (2014).
- Henstock, J., El Haj, A. Controlled mechanotransduction in therapeutic MSCs: can remotely controlled magnetic nanoparticles regenerate bones? Regen Med. 10 (4), 377-380 (2015).
- Fayol, D., et al. Use of magnetic forces to promote stem cell aggregation during differentiation, and cartilage tissue modeling. Adv Mater. 25 (18), 2611-2616 (2013).
- Bartlett, W., et al. Autologous chondrocyte implantation versus matrix-induced autologous chondrocyte implantation for osteochondral defects of the knee: a prospective, randomised study. J Bone Joint Surg Br. 87 (5), 640-645 (2005).
- Batty, L., Dance, S., Bajaj, S., Cole, B. J. Autologous chondrocyte implantation: an overview of technique and outcomes. ANZ J Surg. 81, 18-25 (2011).
- Song, L., Baksh, D., Tuan, R. S. Mesenchymal stem cell-based cartilage tissue engineering: cells, scaffold and biology. Cytotherapy. 6 (6), 596-601 (2004).
- Boeuf, S., Richter, W. Chondrogenesis of mesenchymal stem cells: role of tissue source and inducing factors. Stem Cell Res Ther. 1 (4), 31 (2010).
- Kock, L., van Donkelaar, C. C., Ito, K. Tissue engineering of functional articular cartilage: the current status. Cell Tissue Res. 347 (3), 613-627 (2012).
- Schon, B. S., et al. Validation of a high-throughput microtissue fabrication process for 3D assembly of tissue engineered cartilage constructs. Cell Tissue Res. , (2012).
- Robert, D., et al. Magnetic micro-manipulations to probe the local physical properties of porous scaffolds and to confine stem cells. Biomaterials. 31 (7), 1586-1595 (2010).
- Luciani, N., et al. Successful chondrogenesis within scaffolds, using magnetic stem cell confinement and bioreactor maturation. Acta Biomaterialia. 37, 101-110 (2016).
- Wilhelm, C., Gazeau, F. Universal cell labelling with anionic magnetic nanoparticles. Biomaterials. 29 (22), 3161-3174 (2008).
- Fayol, D., Luciani, N., Lartigue, L., Gazeau, F., Wilhelm, C. Managing magnetic nanoparticle aggregation and cellular uptake: a precondition for efficient stem-cell differentiation and MRI tracking. Adv Healthc Mater. 2 (2), 313-325 (2013).
- Wilhelm, C., Gazeau, F., Bacri, J. C. Magnetophoresis and ferromagnetic resonance of magnetically labeled cells. Eur Biophys J. 31 (2), 118-125 (2002).
- Autissier, A., Le Visage, C., Pouzet, C., Chaubet, F., Letourneur, D. Fabrication of porous polysaccharide-based scaffolds using a combined freeze-drying/cross-linking process. Acta Biomater. 6 (9), 3640-3648 (2010).
- Singh, N., Jenkins, G. J. S., Asadi, R., Doak, S. H. Potential toxicity of superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPION). Nano Reviews. 1, (2010).
- Lee, J. H., Hur, W. Scaffold-free formation of a millimeter-scale multicellular spheroid with an internal cavity from magnetically levitated 3T3 cells that ingested iron oxide-containing microspheres. Biotechnol Bioeng. 111 (5), 1038-1047 (2014).
- Mattix, B., et al. Biological magnetic cellular spheroids as building blocks for tissue engineering. Acta Biomaterialia. 10 (2), 623-629 (2014).
- Mazuel, F., et al. Massive Intracellular Biodegradation of Iron Oxide Nanoparticles Evidenced Magnetically at Single-Endosome and Tissue Levels. ACS Nano. 10 (8), 7627-7638 (2016).
- Kim, J. A., et al. High-throughput generation of spheroids using magnetic nanoparticles for three-dimensional cell culture. Biomaterials. 34 (34), 8555-8563 (2013).
- Shimizu, K., Ito, A., Honda, H. Enhanced cell-seeding into 3D porous scaffolds by use of magnetite nanoparticles. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 77 (2), 265-272 (2006).
- Sensenig, R., Sapir, Y., MacDonald, C., Cohen, S., Polyak, B. Magnetic nanoparticle-based approaches to locally target therapy and enhance tissue regeneration in vivo. Nanomedicine (Lond). 7 (9), 1425-1442 (2012).
- Waldman, S. D., Couto, D. C., Grynpas, M. D., Pilliar, R. M., Kandel, R. A. Multi-axial mechanical stimulation of tissue engineered cartilage: review. Eur Cell Mater. 13, 66-74 (2007).
- Takahashi, I., et al. Compressive force promotes sox9, type II collagen and aggrecan and inhibits IL-1beta expression resulting in chondrogenesis in mouse embryonic limb bud mesenchymal cells. J Cell Sci. 111 (14), 2067-2076 (1998).
- Campbell, J. J., Lee, D. A., Bader, D. L. Dynamic compressive strain influences chondrogenic gene expression in human mesenchymal stem cells. Biorheology. 43, 455-470 (2006).
- Vunjak-Novakovic, G., et al. Bioreactor cultivation conditions modulate the composition and mechanical properties of tissue-engineered cartilage. J Orthop Res. 17 (1), 130-138 (1999).
