Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

3 डी चुंबकीय स्टेम सेल एकत्रीकरण और बायोरिएक्टर परिपक्वता उपास्थि उत्थान के लिए

Published: April 27, 2017 doi: 10.3791/55221
Automatic Translation
1, 1, 1
1Laboratoire Matière et Systèmes Complexes (MSC), UMR 7057 CNRS and University Paris Diderot

Summary

स्टेम सेल से उपास्थिजनन संस्कृति की स्थिति ठीक ट्यूनिंग की आवश्यकता है। यहाँ, हम कोशिकाओं संघनक के लिए एक चुंबकीय दृष्टिकोण प्रस्तुत करते हैं, एक आवश्यक कदम उपास्थिजनन आरंभ करने के लिए। इसके अलावा, हम बताते हैं कि एक बायोरिएक्टर में गतिशील परिपक्वता सेलुलर निर्माणों को यांत्रिक उत्तेजना लागू होता है और उपास्थि बाह्य मैट्रिक्स उत्पादन को बढ़ाता है।

Abstract

उपास्थि इंजीनियरिंग एक इन विट्रो कार्यात्मक देशी ऊतक के समान प्रत्यारोपण बनाने में कठिनाइयों की वजह से एक चुनौती बनी हुई है। एक दृष्टिकोण है हाल ही में ऑटोलॉगस प्रतिस्थापन के विकास के लिए पता लगाया chondrocytes में स्टेम कोशिकाओं के भेदभाव शामिल है। इस उपास्थिजनन, स्टेम सेल के लिए आवश्यक है की संघनन की एक डिग्री शुरू करने के लिए; इसलिए, हम चुंबकीय संघनक कोशिकाओं की व्यवहार्यता का प्रदर्शन किया, दोनों मोटी scaffolds और पाड़ मुक्त भीतर, सेल अट्रैक्टर के रूप में छोटी चुंबकीय क्षेत्र स्रोतों का उपयोग। यह चुंबकीय दृष्टिकोण भी कुल संलयन मार्गदर्शन और पाड़ मुक्त, संगठित का निर्माण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, तीन आयामी (3 डी) आकार में कई मिलीमीटर ऊतकों। एक उन्नत आकार होने के अलावा, ऊतक चुंबकीय चालित संलयन द्वारा गठित कोलेजन द्वितीय की अभिव्यक्ति में एक उल्लेखनीय वृद्धि प्रस्तुत किया, और एक समान प्रवृत्ति aggrecan अभिव्यक्ति के लिए मनाया गया। के रूप में देशी उपास्थि बलों टी कराया गया थाटोपी अपने 3 डी संरचना को प्रभावित किया, गतिशील परिपक्वता भी प्रदर्शन किया था। एक बायोरिएक्टर कि यांत्रिक उत्तेजनाओं प्रदान करता है एक 21 दिन की अवधि में चुंबकीय वरीयता प्राप्त scaffolds संस्कृति के लिए इस्तेमाल किया गया था। बायोरिएक्टर परिपक्वता काफी हद तक cellularized scaffolds में उपास्थिजनन सुधार; बाह्य मैट्रिक्स इन परिस्थितियों में प्राप्त कोलेजन द्वितीय और aggrecan में समृद्ध था। इस काम अभिनव सुधार chondrogenic भेदभाव, दोनों पाड़ मुक्त और भीतर polysaccharide scaffolds के लिए एक बायोरिएक्टर में लेबल स्टेम कोशिकाओं के चुंबकीय संक्षेपण और गतिशील परिपक्वता की क्षमता की रूपरेखा।

Introduction

चुंबकीय नैनोकणों पहले से ही चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) के लिए इसके विपरीत एजेंट के रूप में क्लिनिक में किया जाता है, और उनके चिकित्सीय अनुप्रयोगों के विस्तार रखने के लिए। उदाहरण के लिए, यह हाल ही में दिखाया गया है कि लेबल कोशिकाओं आरोपण 1, 2, 3 के एक परिभाषित स्थल पर / एक बाह्य चुंबकीय क्षेत्र का उपयोग कर विवो में हेरफेर किया जा सकता है और निर्देश दिया जा सकता है और या बनाए रखा। पुनर्योजी चिकित्सा में, वे इन विट्रो 4 में आयोजित ऊतकों, संवहनी ऊतक 5, 6, 7, हड्डी 8, और उपास्थि 9 सहित इंजीनियर के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

संधि उपास्थि एक avascular वातावरण में डूब जाता है, बाह्य मैट्रिक्स घटकों की मरम्मत बहुत सीमित कर रही है जब नुकसान होते हैं। इस कारण से, शोध के लिएज वर्तमान में पारदर्शी उपास्थि प्रतिस्थापन कि दोष स्थल पर प्रत्यारोपित किया जा सकता है की इंजीनियरिंग पर केंद्रित है। आदेश में एक ऑटोलॉगस प्रतिस्थापन का उत्पादन करने में, कुछ अनुसंधान समूहों, एक सेल स्रोत 10, 11 के रूप में ऑटोलॉगस chondrocytes के उपयोग को तलाश रहे हैं, जबकि दूसरों मीजेनकाइमल स्टेम कोशिका (एमएससी) की क्षमता chondrocytes 12, 13 में अंतर करने के लिए जोर देते हैं। पिछले अध्ययनों यहाँ recapitulated में, हम, एमएससी चयनित उनके अस्थि मज्जा नमूना के रूप में काफी सरल है और स्वस्थ chondrocytes, जो उनके phenotype 14 खोने का जोखिम के बलिदान की आवश्यकता नहीं है।

एक प्रारंभिक कदम स्टेम सेल के chondrogenic भेदभाव की शुरुआत करने के लिए आवश्यक उनके संघनन है। सेल समुच्चय आमतौर पर या तो centrifugation या Micromass संस्कृति 15 का उपयोग कर का गठन कर रहे हैं; हालांकि, ये संक्षेपण तरीकों neitheआर मोटी scaffolds और न ही संभावित समुच्चय के विलय को नियंत्रित करने के भीतर कोशिका समूहों बनाने की क्षमता मौजूद है। इस पत्र में, हम एमएससी चुंबकीय लेबलिंग और चुंबकीय आकर्षण का उपयोग कर स्टेम सेल संघनक करने के लिए एक अभिनव प्रयासों का वर्णन। इस तकनीक को एक मिलीमीटर पैमाने पर उपास्थि ऊतक 9 प्राप्त करने के लिए एक दूसरे के साथ समुच्चय के विलय के माध्यम से पाड़ मुक्त 3 डी निर्माणों के रूप में साबित किया गया है। मोटी और बड़ी scaffolds के चुंबकीय बोने भी इंजीनियर ऊतक के आकार में वृद्धि, आरोपण के लिए एक आकार और अधिक आसानी से उपयोगी डिजाइनिंग, और उपास्थि की मरम्मत में नैदानिक ​​अनुप्रयोगों के लिए संभावित विविधता लाने की संभावना की अनुमति दी है। यहाँ, हम विस्तार प्राकृतिक पॉलीसैकराइड, पुलुलान, और dextran से बना झरझरा scaffolds में एमएससी के चुंबकीय बोने के लिए प्रोटोकॉल, मचान पहले से स्टेम कोशिकाओं 16, 17 को सीमित करने के लिए इस्तेमाल किया। Chondrogenic भेदभाव finall थाy scaffolds कोशिकाओं के एक उच्च घनत्व के साथ वरीयता प्राप्त की मैट्रिक्स कोर में निरंतर पोषक तत्व और गैस प्रसार सुनिश्चित करने के लिए एक बायोरिएक्टर में प्रदर्शन किया। कोशिकाओं को पोषक तत्वों, chondrogenic विकास कारकों और गैस उपलब्ध कराने के अलावा, बायोरिएक्टर यांत्रिक उत्तेजना की पेशकश की। कुल मिलाकर, चुंबकीय स्टेम सेल सीमित करने के लिए इस्तेमाल किया प्रौद्योगिकी, एक बायोरिएक्टर में गतिशील परिपक्वता के साथ संयुक्त, स्पष्ट रूप से chondrogenic भेदभाव सुधार कर सकते हैं।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. चुंबकीय उपकरणों के निर्माण

नोट: (चित्रा 1) सेल बोने के लिए इस्तेमाल किया उपकरणों आवेदन के आधार पर बदलती। समुच्चय के रूप में करने के लिए, कोशिकाओं की संख्या, 2.5 × 10 5 / कुल तक ही सीमित तो चुंबकीय सुझावों बहुत पतली (व्यास में 750 सुक्ष्ममापी) होना चाहिए। 1.8 सेमी 2/7 मिमी मोटी scaffolds बीज के लिए, मैग्नेट बड़ा (व्यास में 3 मिमी) होना चाहिए और पाड़ के छिद्रों के माध्यम से कोशिका प्रवास सुनिश्चित करेगा।

  1. कुल गठन के लिए सूक्ष्म मैग्नेट के साथ एक उपकरण के निर्माण (चित्रा 1 ए)
    1. एल्यूमीनियम प्लेट के माध्यम से एक 0.8-मिमी ड्रिल के साथ सूक्ष्म छेद (व्यास में 3 सेमी और 6 मिमी मोटी) बनाओ।
    2. एक चुंबकीय टिप (व्यास में 750 सुक्ष्ममापी) थाली के प्रत्येक छेद में डालें।
    3. एक स्थायी neodymium चुंबक है, जो संतृप्ति को चुंबकन सुनिश्चित करता है पर इस डिस्क रखें।
  2. पाड़ बोने के लिए एक उपकरण का निर्माण (
  3. 2.4 सेमी 2 वर्गों में कठिन polystyrene काटें।
  4. 1.6 सेमी 2 के सतह क्षेत्र के ऊपर एक समान दूरी पर 9 छोटे मैग्नेट (व्यास में 3 मिमी, 6 म लोंग) डालें।
  5. इस उपकरण के लिए एक स्थायी neodymium चुंबक से अधिक रखें।

2. स्टेम सेल लेबलिंग

नोट: स्टेम कोशिकाओं, 30 मिनट (2.6 ± 0.2 स्नातकोत्तर लोहा / सेल) समुच्चय के रूप में के लिए 0.1 मिमी चुंबकीय नैनोकणों के साथ लेबल किया गया, जबकि वे 30 मिनट (5 ± 0.4 स्नातकोत्तर लोहा / सेल) बीज के लिए 0.2 मिमी चुंबकीय नैनोकणों के साथ लेबल रहे थे scaffolds। ये nanoparticle में सांद्रता और ऊष्मायन बार पहले उपयोग किया गया है और एमएससी और अन्य कोशिकाओं 18, 19 के लिए प्रकाशित किया है, और यह निर्धारित किया गया है कि नैनोकणों न सेल व्यवहार्यता और न ही एमएससी भेदभाव क्षमता पर असर पड़ा। लोहा बड़े पैमाने पर स्टेम सेल द्वारा शामिल एकल ce के माध्यम से मापा गया थाll magnetophoresis 19, 20।

  1. 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 में संस्कृति मानव मीजेनकाइमल स्टेम कोशिका (एमएससी) पूरा मध्योतक मूल कोशिकाओं की वृद्धि मध्यम (MSCGM) में पास जब तक संगम के लिए (~ 90%)।
  2. Glutamine के बिना सीरम मुक्त मैककॉय के 5 ए मध्यम रोजवेल पार्क मेमोरियल संस्थान (RMPI) पर संशोधित में और 5 शामिल हैं: 0.1 या 0.2 मिमी maghemite साइट्रेट में लिपटे लोहे के आक्साइड (8 एनएम व्यास कोर γFe 2 हे 3) के मिश्रण से चुंबकीय लेबलिंग समाधान तैयार मिमी सोडियम साइट्रेट।
  3. मध्यम त्यागें, glutamine के बिना सीरम मुक्त RPMI मध्यम के साथ कोशिकाओं कुल्ला, और प्रति 150 सेमी 2 संस्कृति फ्लास्क, न्यूनतम मात्रा सभी कोशिकाओं को कवर करने के लिए आवश्यक आयरन आक्साइड nanoparticle समाधान के 10 एमएल जोड़ें।
  4. 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट और 5% सीओ 2 के लिए सेते हैं और फिर nanoparticle समाधान त्यागें। glutamine नेन भली बिना सीरम मुक्त RPMI मध्यम के साथ 5 मिनट के लिए कुल्लाoparticles अभी भी प्लाज्मा झिल्ली से जुड़ी।
  5. RPMI मध्यम त्यागें और कुप्पी प्रति पूरा MSCGM माध्यम के 25 एमएल जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते हैं और 5% सीओ 2।

3. चुंबकीय सेल सीडिंग

  1. हाल में 50 माइक्रोन एल एस्कॉर्बिक एसिड 2 फॉस्फेट, 0.1 सुक्ष्ममापी डेक्सामेथासोन, 1 मिमी सोडियम पाइरूवेट, 0.35 मिमी एल प्रोलाइन, 1% सार्वभौमिक संस्कृति जोड़कर chondrogenic मध्यम Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) एल glutamine के साथ उच्च ग्लूकोज का उपयोग कर तैयार इंसुलिन, मानव transferrin और selenous एसिड (आईटीएस-Premix), और 10 एनजी / एमएल रूपांतरित होने वाले विकास कारक-बीटा 3 (TGF-β3) युक्त पूरक।
  2. 5 मिनट के लिए 260 × छ पर अलग कोशिकाओं प्रति 150 सेमी 2 संस्कृति फ्लास्क 0.05% ट्रिप्सिन- EDTA और अपकेंद्रित्र के 8 एमएल का उपयोग कर चुंबकीय कोशिकाओं अलग करें। मध्यम Aspirate और फिर से निलंबित कोशिकाओं गिनती।
  3. दोनों चुंबकीय उपकरणों के शीर्ष पर एक गिलास तह सेल संस्कृति पेट्री डिश (35 मिमी) रखें।
  4. मीटर करने के लिएagnetically समुच्चय के रूप में, पेट्री डिश के लिए chondrogenic माध्यम की 3 एमएल जोड़ने और धीरे से छोटी मात्रा संभव (कोई 8 की तुलना में अधिक μL) 2.5 × 10 5 लेबल कोशिकाओं कुल प्रति (16 समुच्चय अप करने के लिए जमा किया जा सकता) युक्त जमा। यह चलती है, यह spheroids के लिए फार्म की अनुमति के बिना 20-30 मिनट के लिए पेट्री डिश छोड़ दो, और फिर 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर पूरा उपकरण को रख देता, 16 समुच्चय युक्त पेट्री डिश सहित इनक्यूबेटर में।
  5. प्रपत्र नियंत्रण समुच्चय ही प्रोटोकॉल का पालन और TGF-β3 बिना chondrogenic मध्यम के साथ पूरा मध्यम बदलें।
    1. 3 डी कुल निर्माण उत्पन्न करने के लिए 8 दिन पर संपर्क में 2 समुच्चय जगह 8 दोहरी फार्म और संलयन आरंभ करने के लिए। 11 दिन, 2 दोहरी विलय 4 लेनेवाले बच्चे के रूप में। अंत में, अंतिम संरचना प्राप्त करने के लिए 15 दिन 4 लेनेवाले बच्चे फ्यूज।
    2. इसी समय, 2.5 × 10 5 centrifuging द्वारा समुच्चय के रूप में 260 से स्टेम सेल लेबल15; के साथ या बिना TGF-β3 chondrogenic माध्यम की 1.5 एमएल के साथ 15 एमएल ट्यूबों में 5 मिनट के लिए ग्राम (नमूना और नियंत्रण के लिए, क्रमशः)।
  6. बीज scaffolds चुंबकीय करने के लिए, एक पेट्री डिश में प्रत्येक सूखे पाड़ जगह। Polysaccharide झरझरा पुलुलान / dextran 21 के बने मचान का उपयोग करें। प्रत्येक पाड़ के लिए, बिना TGF-β3 2 × 10 6 chondrogenic माध्यम के 350 μL में लेबल स्टेम कोशिकाओं को कमजोर और ध्यान से पाड़ पर कोशिकाओं विंदुक।
    1. 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए सेते हैं पाड़ के भीतर पूर्ण सेल प्रवेश के लिए अनुमति देने के लिए और फिर धीरे से के साथ या बिना पेट्री डिश के लिए TGF-β3 (नमूना या नियंत्रण, क्रमशः के लिए) chondrogenic माध्यम की 3 एमएल जोड़ें।
    2. 37 डिग्री सेल्सियस पर अपनी चुंबकीय उपकरण पर cellularized पाड़ सेते हैं और 5% सीओ 2 से 4 दिनों के लिए पाड़ pores और कारावास के माध्यम से कोशिका प्रवास के लिए अनुमति देने के लिए।
  7. इसी समय, के साथ scaffolds बीज 2 × 10 6

4. Chondrocytes में विभेदन

ध्यान दें: ऊष्मायन के 4 दिनों के बाद, चुंबक हटाने और chondrogenic परिपक्वता या तो एक पेट्री डिश (स्थिर स्थिति) या एक बायोरिएक्टर (गतिशील स्थिति) में में जारी है। नकारात्मक नियंत्रण के नमूने के बिना TGF-β3 chondrogenic माध्यम के साथ स्थिर स्थिति में परिपक्व होते हैं।

  1. स्थिर स्थिति में, एक ही पेट्री डिश में cellularized scaffolds या समुच्चय रहते हैं। 21 दिन के लिए chondrogenic मध्यम सप्ताह में दो बार बदलें।
  2. गतिशील परिस्थितियों में, बायोरिएक्टर तैयार करते हैं।
    1. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार उचित लंबाई में सिलिकॉन टयूबिंग काटें।
    2. 500 एमएल संस्कृति कक्ष, ट्यूबिंग, 2 तरह rotators, और पिंजरों: सभी सामग्री आटोक्लेव।
    3. बायोरिएक्टर भागों एक बाँझ microbio में रखेंतार्किक सुरक्षा स्टेशन। 2 तरह rotators करने और निर्माता के निर्देशों के संस्कृति कक्ष के ट्यूबिंग कनेक्ट करें।
    4. ध्यान से एक बाँझ लेपनी का उपयोग कर निष्फल पिंजरों में cellularized scaffolds हस्तांतरण। पिंजरे प्रति 2 scaffolds रखें। जब पिंजरों के लिए तैयार हैं, उन्हें ढक्कन के सुइयों में डालने के लिए उन्हें आगे रोटेशन के दौरान बढ़ने से रखने के लिए। chondrogenic माध्यम के साथ संस्कृति चैम्बर भरें और पिंजरों युक्त ढक्कन के साथ उसे बंद करें।
  3. क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप को चालू chondrogenic माध्यम के साथ ट्यूबिंग भरने के लिए और हवा के बुलबुले को खत्म करने।
  4. रखें और बायोरिएक्टर की मोटर में भरा कक्ष सुरक्षित और कंप्यूटर, जो हाथ की और कक्ष के दोनों रोटेशन नियंत्रण चालू करें।
  5. दोनों हाथ और कक्ष पर प्रति मिनट 5 रोटेशन (आरपीएम) की एक घूर्णन गति को लागू करें। cellularized scaffolds के निरंतर खिला के लिए 10 आरपीएम के प्रवाह की दर पर क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप को समायोजित करें।

नोट: शाही सेना निकासी करने से पहले, एक एंजाइमी समाधान के साथ scaffolds पचाने।

  1. pullulanase के 100 μL (40 यू / एमएल) और सीरम मुक्त DMEM माध्यम के 850 एमएल के लिए dextranase के 50 μL (60 मिलीग्राम / एमएल) जोड़कर एंजाइमी समाधान के 1 एमएल तैयार करें।
  2. सीरम मुक्त DMEM माध्यम के साथ दो बार scaffolds कुल्ला, मध्यम त्यागें, और पाड़ प्रति एंजाइमी समाधान के 800 μL जोड़ें। कोमल आंदोलन के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर 15-30 मिनट के लिए सेते हैं।
  3. जब पाड़ पूरी तरह भंग है, 10 मिनट के लिए 300 × छ पर समाधान 1.5 एमएल ट्यूब कोशिकाओं से युक्त, अपकेंद्रित्र हस्तांतरण, ध्यान से मध्यम aspirate, बाँझ 1 × फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस), अपकेंद्रित्र में साथ दो बार कुल्ला 10 मिनट के लिए 300 × छ, और आरएनए अलगाव समाधान में कोशिकाओं को फिर से रोक देते हैं।
  4. समुच्चय से शाही सेना को निकालने के लिए, शाही सेना अलगाव समाधान में spheroids जगह है औरपूरी तरह से शाही सेना निष्कर्षण प्रदर्शन से पहले एक homogenizer का उपयोग कर उन्हें कुचलने।
  5. आरएनए निर्माता के निर्देशों के अनुसार कुल शाही सेना निकासी के लिए एक किट का उपयोग अलग।
  6. निर्माता के निर्देशों के अनुसार रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस का उपयोग कर कुल शाही सेना के 400 एनजी से पूरक डीएनए सिंथेसाइज़, 250 एनजी यादृच्छिक प्राइमरों, dNTP मिश्रण का 1 μL (10 मिमी प्रत्येक), और 40 यू / एमएल RNase अवरोध करनेवाला उपयोग करते हुए; प्रतिक्रिया के अंतिम मात्रा 20 μL है। प्रतिक्रिया के अंत में, 100 μL के अंतिम मात्रा प्राप्त करने के लिए आसुत जल का 80 μL जोड़ें।
  7. मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन प्रतिक्रिया (पीसीआर) के लिए, 10 × पतला सीडीएनए के साथ, इस तरह के aggrecan (AGC) और कोलेजन द्वितीय (कर्नल द्वितीय) के रूप में ब्याज की जीन, के रिश्तेदार अभिव्यक्ति आकलन करना बहुत पीसीआर मिश्रण एक फ्लोरोसेंट अभिकर्मक युक्त का उपयोग करें। संदर्भ जीन Ribosomal प्रोटीन, बड़े, P0 (RPLP0) के साथ जीन अभिव्यक्ति के स्तर को सामान्य बनाते हैं। ΔΔCT सूत्र - 2 के साथ परिकलन, जहां ΔΔCT = ΔCT विभेदित हालत की - ΔCT नियंत्रण हालत का मतलब है, और प्रत्येक ΔCT ब्याज की जीन की सीटी का प्रतिनिधित्व करता है - संदर्भ जीन (RPLP0) की सीटी।
  8. सांख्यिकीय माप का निर्धारण के रूप में मतलब मूल्यों मतलब (SEM) की मानक त्रुटि ±। n ≥ 2 स्वतंत्र प्रयोगों के साथ विश्लेषण करें। विद्यार्थी t- परीक्षण का उपयोग करें centrifuged छर्रों और चुंबकीय fusions (* पी <0.05) के बीच सांख्यिकीय अंतर का विश्लेषण करने के लिए। एक Kruskal वालिस परीक्षण (एक तरह से एनोवा nonparametric) के साथ महत्व को निर्धारित विभेदित scaffolds के बीच और नियंत्रण पाड़ के साथ सांख्यिकीय अंतर (* पी <0.05) का विश्लेषण करने के लिए।

6. histological विश्लेषण

  1. बाँझ 1 × पीबीएस के साथ cellularized scaffolds या समुच्चय कुल्ला, कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए 10% formalin समाधान में उन्हें ठीक है, और 1 × पीबीएस के साथ कुल्ला।
  2. पीबीएस निकालें, इष्टतम काटने में नमूने एम्बेडछ तापमान यौगिक (OCT), और उन्हें तरल नाइट्रोजन में डूबे एक isopentane स्नान में फ्रीज। -20 डिग्री सेल्सियस पर नमूना संग्रहित करें। एक cryostat समुच्चय या cellularized scaffolds के लिए 12 सुक्ष्ममापी के लिए 8-सुक्ष्ममापी cryosections प्राप्त करने के लिए के साथ नमूने काटें।
  3. 2 मिनट के लिए 0.5% toluidine नीले समाधान के साथ cryosections दाग, नल के पानी में कुल्ला, 100% इथेनॉल के साथ निर्जलीकरण, टोल्यूनि का उपयोग कर स्पष्ट है, और प्रकाश माइक्रोस्कोपी के लिए एक बढ़ते मध्यम के साथ स्लाइड माउंट।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

सबसे पहले, समुच्चय को व्यक्तिगत रूप से 2.5 × 10 5 लेबल स्टेम सेल बैंक में जमा (चित्रा 2A) द्वारा सूक्ष्म चुंबक का उपयोग का गठन किया जा सकता है। ये एक समुच्चय (~ आकार में 0.8 मिमी) तो अनुक्रमिक, चुंबकीय प्रेरित संलयन के लिए बड़ा संरचनाओं धन्यवाद में जुड़े हुए किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, chondrogenic परिपक्वता के 8 दिन, समुच्चय जोड़े दोहरी के लिए फार्म में संपर्क में रखा गया था; जन्म लेनेवाले 2 दोहरी मर्ज करके 11 दिन पर इकट्ठा कर रहे थे; और अंत में, 15 दिन, 4 जन्म लेनेवाले एक 3 डी शुरू में गठन समुच्चय के 16 युक्त निर्माण के लिए फार्म जुड़े हुए थे, 4 × 10 6 कोशिकाओं (~ आकार में 4 मिमी) (चित्रा 2 बी) के कुल के साथ। दूसरा, एक ही चुंबकीय आकर्षण तकनीक scaffolds के भीतर सेल समुच्चय के रूप में इस्तेमाल किया गया है। Scaffolds चुंबकीय डिवाइस पर वरीयता प्राप्त कर रहे थे और घनी पाड़ के छिद्रों के भीतर कोशिकाओं सघन का प्रदर्शन किया, सटीक माइक्रो चुंबक स्थानों पर (चित्रा 2C)। इसके विपरीत, जब कोशिकाओं चुंबकीय आकर्षण (निष्क्रिय बोने) के बिना एक पाड़ के भीतर वरीयता प्राप्त कर रहे थे, वे समान रूप से वितरित किया जा पाए गए। Cellularized scaffolds तो पिंजरों (चित्रा 3A) बायोरिएक्टर कक्ष से जुड़ी गतिशील परिपक्वता की स्थिति (चित्रा 3 बी) के तहत chondrogenic प्रक्रिया निष्पादित करने में डाला गया था। इस तरह की एक बायोरिएक्टर पोषक तत्व और गैस आदान-प्रदान में सुधार और पारगमन द्वारा यांत्रिक उत्तेजना प्रदान करता है। दोनों हाथ और कक्ष की घूर्णन गति 5 आरपीएम में समायोजित किया गया, के रूप में नरम 3 डी ऊतक पुनर्जनन के लिए निर्माता द्वारा सिफारिश की। एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप कि मध्यम की सतत आपूर्ति प्रदान करता है 10 rpm पर स्थापित किया गया था।

सेल संगठन के सभी शर्तों (जुड़े हुए समुच्चय और scaffolds के भीतर बोने) और ऊतक परिपक्वता (भीतर या बिना एक बायोरिएक्टर) के लिए, जीन अभिव्यक्ति 25 दिन पर विश्लेषण किया गया था ऊतक चुंबकीय संलयन द्वारा गठित एक signi से पता चलागोली centrifugation (चित्रा 4 ए) के द्वारा प्राप्त की तुलना में कोलेजन द्वितीय अभिव्यक्ति में ficant वृद्धि, एक साथ aggrecan अभिव्यक्ति का एक बढ़ा प्रवृत्ति के साथ। cellularized scaffolds के लिए, हम में वृद्धि प्राप्त aggrecan और कोलेजन द्वितीय अभिव्यक्ति-महत्वपूर्ण कोलेजन के लिए द्वितीय जब चुंबकीय बोने, इस्तेमाल किया गया था के रूप में की तुलना करने के लिए scaffolds चुंबकीय बलों के बिना वरीयता प्राप्त। इसके अलावा, दोनों जीनों की अभिव्यक्ति में बहुत अधिक (कर्नल द्वितीय के लिए महत्वपूर्ण) जब चुंबकीय बोने गतिशील भेदभाव (चित्रा 4 बी) के साथ संयुक्त किया गया था।

ऊतकीय विश्लेषण भी ग्लाइकोसअमिनोग्लाइकन्स (जीएजी) प्रकट करने के लिए एक toluidine नीला दाग का उपयोग कर उदाहरण के लिए, प्रदर्शन किया गया। 16 समुच्चय के अनुक्रमिक चुंबकीय संलयन, जीएजी की प्रचुर मात्रा बयान का प्रदर्शन के रूप में नीले-बैंगनी रंग (चित्रा 5 ए) द्वारा दिखाई। मचान के लिए, केवल उन चुंबकीय वरीयता प्राप्त toluidine नीले रंग के साथ दाग रहे थे। जीएजी सामग्री केजब मचान एक बायोरिएक्टर (चित्रा 5 ब) के बजाय स्थिर (चित्रा 5C) में विभेदित किया गया टी अधिक था। एक साथ लिया, इन परिणामों scaffolds के भीतर चुंबकीय एकत्रीकरण और चुंबकीय बोने की क्षमता प्रदर्शित उपास्थिजनन बढ़ाने के लिए। यह भी पता चलता है कि बायोरिएक्टर भीतर गतिशील परिपक्वता की स्थिति और अधिक कुशल भेदभाव के लिए अनुकूल हैं।

आकृति 1
चित्र 1 चुंबकीय उपकरणों का निर्माण। (ए) कुल गठन के लिए एक चुंबकीय उपकरण का उदाहरण: एल्यूमीनियम प्लेट (0.8 सुक्ष्ममापी व्यास छेद) drilled किया गया था और सुझाव दिए गए प्रत्येक छेद में डाला गया और उसके बाद एक स्थायी neodymium चुंबक है, जो संतृप्ति को चुंबकन सुनिश्चित किया पर रख दिया गया। (बी) चुंबकीय उपकरण पाड़ बीज के: कठिन polystyrene 9 मैन्युअल बनाया छेद (24 मिमी 2) के साथ थाएक स्थायी neodymium चुंबक है, जो संतृप्ति को चुंबकन सुनिश्चित किया पर रख दिया गया। छोटे मैग्नेट (व्यास में 3 मिमी) फिर डिवाइस के रूप में प्रत्येक छेद में डाला गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्र 2. स्टेम कोशिकाओं और बोने के चुंबकीय लेबलिंग। (ए) स्टेम कोशिकाओं 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए लोहे के आक्साइड नैनोकणों के साथ लेबल रहे थे। (बी) Spheroids 16 सूक्ष्म मैग्नेट के एक नेटवर्क से आकर्षित लेबल कोशिकाओं से गठन किया गया। समुच्चय दोहरी 3 दिन पहले गठन के संलयन द्वारा 11 दिन पर जन्म लेनेवाले बच्चे में मिला दिया गया। जन्म लेनेवाले तब अंतिम इंजीनियर ऊतक के निर्माण के लिए 15 दिन पर जुड़े हुए थे। (ग) एक पाड़, एक कांच की तह डिश में रखा गया है, के साथ या के साथ वरीयता मिलीबाहर चुंबकीय बलों। 4 दिन, जमा स्टेम सेल के धब्बे, चुंबकीय वरीयता प्राप्त पाड़ में मनाया गया, जबकि कोशिकाओं समान रूप से पाड़ एक चुंबक के बिना वरीयता प्राप्त में वितरित दिखाई दिया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्र 3. cellularized scaffolds के गतिशील परिपक्वता। (ए) चुंबकीय या निष्क्रिय बोने के बाद, cellularized scaffolds पिंजरों में डाल दिया गया व्यवधान से बचने के। (बी) के पिंजरे, टोपी के सुइयों का उपयोग तय, chondrogenic मध्यम से भर बायोरिएक्टर के बर्तन में रखा गया था। बायोरिएक्टर एक स्वतंत्र रूप से नियंत्रित गति (1-12 rpm और हाथ और कक्ष, क्रमशः के लिए 1-35 आरपीएम) के साथ द्विअक्षीय रोटेशन लागू होता है। एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप लगातार मेडी प्रदान कीउम। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. 25 दिन पर विशेष chondrogenic जीनों की अभिव्यक्ति (ए) एमएससी spheroids के चुंबकीय प्रेरित संलयन गोली centrifugation द्वारा गठित की तुलना में कोलेजन द्वितीय में एक उल्लेखनीय वृद्धि देखी गई। * विद्यार्थी t- परीक्षण (पी-मूल्य <0.05) का उपयोग कर एक सांख्यिकीय अंतर को दर्शाता है। (बी) aggrecan और कोलेजन की अभिव्यक्ति द्वितीय स्पष्ट रूप से एक बायोरिएक्टर में चुंबकीय बोने और गतिशील परिपक्वता के संयोजन के साथ विभेदित scaffolds में वृद्धि हुई थी। जीन अभिव्यक्ति RPLP0 mRNA के लिए सामान्यीकृत था और (~ 1 ± SEM) में मनमाने ढंग से इकाइयों रिश्तेदार व्यक्त नियंत्रित करने के लिए। परिणाम प्रस्तुत कर रहे हैं इसका मतलब है के रूप में दो से चार स्वतंत्र प्रयोगों की ± SEM। * DenoKruskal वालिस परीक्षण (एक तरह से एनोवा nonparametric परीक्षण) (पी-मूल्य <0.05) का उपयोग कर एक सांख्यिकीय अंतर टीईएस। (-): चुंबक के बिना बोने; (+): चुंबकीय बलों के साथ बोने। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5. ऊतकीय दिन ग्लाइकोसअमिनोग्लाइकन्स 25. ग्लाइकोसमिनोग्लाइकन (जीएजी) जमा नीली बैंगनी रंगाई इसका सबूत हैं की धुंधला। (ए) एक सकारात्मक toluidine नीला दाग 16 समुच्चय के अनुक्रमिक संलयन से प्राप्त अंतिम उपास्थि संरचना के 8 सुक्ष्ममापी cryosections में मनाया गया। मचान या गतिशील (सी) की स्थिति चुंबकीय के बाद आंकड़े (बी) वरीयता प्राप्त की 12 सुक्ष्ममापी cryosections स्पष्ट रूप से पता चला हैकि जीएजी सामग्री एक बायोरिएक्टर में विभेदित scaffolds में अधिक था। तीर विभेदित कोशिकाओं के समुच्चय संकेत मिलता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

सबसे पहले, क्योंकि यहां प्रस्तुत तकनीक चुंबकीय नैनोकणों के internalization पर भरोसा करते हैं, एक महत्वपूर्ण मुद्दा नैनोकणों के परिणाम एक बार वे कोशिकाओं के भीतर स्थानीय बनाना है। ऐसा नहीं है कि लोहे के नैनोकणों संभावित विषाक्तता या उनके आकार, कोटिंग, और जोखिम 19, 22 के समय के आधार बिगड़ा भेदभाव क्षमता गति प्रदान कर सकते सच है। हालांकि, कई अध्ययनों जब समझाया लोहा नैनोकणों magnetoferritin के रूप में, एक जैविक चुंबकीय nanoparticle 24 में 23 का उपयोग किया गया है, या एक सरल साइट्रेट कोटिंग और पर्याप्त सांद्रता 18 के साथ इस्तेमाल किया गया सेलुलर फिजियोलॉजी पर कोई प्रभाव नहीं दिखाई है। इसके अलावा, जब लोहे के आक्साइड नैनोकणों (एमएससी के साथ और उपास्थिजनन के लिए) इस पत्र में वर्णित उन लोगों के रूप इसी तरह की स्थिति में इस्तेमाल किया गया है, हम हाल ही में प्रदर्शन किया है कि nanoparti की एक तेजी से और लगभग कुल गिरावटcles सेलुलर समावेश और एमएससी उपगोल गठन पर के बारे में 10 दिनों में endosomes के भीतर होती है। दिलचस्प बात यह है इस बड़े पैमाने पर गिरावट ferritin प्रोटीन के भीतर मुक्त लोहे की कुशल भंडारण के साथ जुड़े और सेलुलर लौह चयापचय पर एक बहुत ही सीमित प्रभाव के परिणामस्वरूप, भविष्य नैदानिक अनुप्रयोगों 25 अच्छी तरह से boding किया गया था।

एक अन्य महत्वपूर्ण बिंदु सेल संघनन की आवश्यकता उपास्थिजनन आरंभ करने के लिए है। आमतौर पर, कोशिकाओं का संक्षेपण centrifugation के माध्यम से हासिल की है, हालांकि, इस विधि कोशिकाओं की कम संख्या (नहीं से अधिक 2.5 × 10 5 कोशिकाओं) द्वारा सीमित है। इस संख्या में विगत, पोषक तत्वों और गैस समुच्चय के केंद्र के लिए फैलाना नहीं कर सकते, सेल परिगलन ट्रिगर। इधर, समुच्चय में लेबल स्टेम कोशिकाओं के चुंबकीय संक्षेपण एक महत्वपूर्ण विधि उपास्थि ऊतक पुनर्जनन के लिए 3 डी का निर्माण के रूप में के रूप में प्रकट होता है। इस तरह के एक चुंबकीय प्रक्रिया के लिए अन्य लेखकों द्वारा इस्तेमाल किया गया हैएक चुंबक कोशिकाओं 23 की या लोहे पिन के साथ पृथक्करण चुंबकीय क्षेत्र 26 स्थानीय बनाना के बाद थाली के शीर्ष पर रखा के साथ चुंबकीय उत्तोलन द्वारा: 3 डी spheroids का निर्माण। हालांकि, चुंबकीय उत्तोलन कुल संलयन के आगे के चरणों के लिए अनुकूल होने के लिए प्रकट नहीं होता। इसके विपरीत, के साथ चुंबकीय विधि यहाँ प्रस्तावित है, हम सब संलयन चरणों एक कदम-दर-कदम उपास्थि ऊतक निर्माण प्राप्त करने के लिए नियंत्रित कर सकते हैं। संक्षेप में, इस बहु-चरण प्रक्रिया कुल बिल्डिंग ब्लॉक्स में स्टेम सेल के कारावास के साथ शुरू होता है और एक बड़ा संरचना में इन ब्लॉकों के विलय के बाद आता है। इस पाड़ मुक्त स्टेम सेल एकत्रीकरण प्रक्रिया के महत्वपूर्ण चरणों का पालन कर रहे हैं: पहला, एक, संभव और दूसरी के रूप में कोशिकाओं के रूप में छोटे एक मात्रा के साथ प्रत्येक समग्र रूप चाहिए एक एक एकल, बड़े के गठन से बचने के लिए संलयन चरणों नियंत्रण करना होगा कुल। ऊतक यहाँ प्राप्त कोलेजन द्वितीय और aggrecan में समृद्ध था। यह भी लाभ प्रस्तुतलचीला ज्यामिति और आकार होने के और पाड़ से मुक्त होने का तों।

चुंबकीय दृष्टिकोण भी मोटी और बड़ी scaffolds के भीतर स्टेम सेल मार्गदर्शन किया गया था; विभिन्न आकृति और आकार के डिजाइन के लिए एक और विकल्प। न तो किसी भी सेल नुकसान से बचने के भी कोशिकाओं की एक समग्र सजातीय वितरण के लिए थोड़ा, और न ही बहुत ज्यादा: यहां महत्वपूर्ण कदम कोशिकाओं का एक उचित मात्रा के साथ scaffolds बीज है। चुंबकीय बलों पहले से आकर्षित करने और scaffolds के भीतर कोशिकाओं को बनाए रखने और सेल बोने 27, 28 को बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया गया। इधर, polysaccharide scaffolds के छिद्रों के भीतर पर्याप्त सेल संक्षेपण सफल उपास्थिजनन का नेतृत्व किया। बाह्य मैट्रिक्स उत्पादन उल्लेखनीय सुधार किया गया था जब चुंबकीय cellularized scaffolds पारगमन / कतरनी तनाव अपने द्वि-अक्षीय रोटेशन के लिए बायोरिएक्टर धन्यवाद द्वारा प्रदान की उत्तेजनाओं का शिकार हुए। यह अन्य अध्ययनों कि एमयूएल में दिखाया गया हैti-अक्षीय लोड हो रहा है की स्थिति chondrocytes 29 से गठित ऊतकों की गुणवत्ता में सुधार। इस उपन्यास बायोरिएक्टर अवधारणा कोई वास्तविक लाभ प्रस्तुत करता है जब मौजूदा तकनीक, जहां केवल संपीड़न बलों 30, 31, 32 से लागू होते हैं की तुलना में।

अंत में, chondrogenic भेदभाव के लिए, लेबल स्टेम कोशिकाओं के चुंबकीय कारावास के उपयोग के लिए फार्म और हेरफेर समुच्चय के साथ-साथ मिलीमीटर आकार उपास्थि सेलुलर निर्माणों के निर्माण के लिए अनुमति दी scaffolds बीज के। इसके अलावा, गतिशील भेदभाव के साथ चुंबकीय सेल बोने के संयोजन पुनर्योजी चिकित्सा अनुप्रयोगों के लिए एक मूल्यवान नया उपकरण प्रदान करता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

लेखकों बायोरिएक्टर के साथ उनकी मदद के लिए QuinXell टेक्नोलॉजीज और CellD, विशेष रूप से लोथर ग्रैनमन और डोमिनिक घोजलान स्वीकार करने के लिए करना चाहते हैं। हम कैथरीन Le व्यक्तित्व है, जो हमें पुलुलान / dextran polysaccharide scaffolds के साथ प्रदान की धन्यवाद। इस काम के यूरोपीय संघ (ERC-2014-कॉग परियोजना मैटिस 648,779) द्वारा और AgenceNationalede ला Recherche (ANR), फ्रांस (MagStem परियोजना ANR -11 SVSE5) द्वारा समर्थित किया गया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Iron oxide (maghemite) nanoparticules (γ-Fe2O3) PHENIX - University Paris 6 Made and given by C. Ménager Mean diameter of 8.1 nm and negative surface charge
Polysaccharide Pullulan/Dextran scaffolds LIOAD - University Nantes Made and given by C. Le Visage Prepared from a 75:25 mixture of pullulan/dextran in alkaline conditions (10 M NaOH). Porosity: 185-205 µm; Thickness: 7 mm; Surface area: 1.8 cm2.
TisXell Regeneration System QuinXell Technologies QX900-002 Biaxial bioreactor with 500 mL culture chamber 
Cage for scaffolds: Histosette II M492  VWR 720-0909
Mesenchymal Stem Cell (MSC) Lonza PT-2501 Three independant batches have been used
MSCGM BulletKit medium Lonza PT-3001 For the complete medium, add the provided BulletKit (containing serum, glutamine and antibiotics) to the MSCGM medium
DMEM with Glutamax I Life Technologies 31966-021 No sodium pyruvate, no HEPES
RPMI medium 1640, no Glutamine Life Technologies 31870-025 No sodium pyruvate, no HEPES
PBS w/o CaCl2 w/o MgCl2 Life Technologies 14190-094
0.05% Trypsin-EDTA (1x) Life Technologies 25300-054
Penicillin (10,000 U/mL) / Streptomycin (10,000 µg/mL) Life Technologies 15140-122
ITS Premix Universal Culture Supplement (20x) Corning 354352
Sodium pyruvate solution 100 mM Sigma S8636
L-Ascorbic Acid 2-phosphate Sigma A8960 Prepare the concentrated solution (25 mM) in distilled water extemporaneously
L-Proline Sigma P5607 Prepare the 175 mM stock solution diluted in distilled water and store at 4 °C
Dexamethasone Sigma D4902 Prepare the 1 mM stock solution diluted in Ethanol 100% and store at -20 °C
TGF-beta 3 protein 10 µg Interchim 30R-AT028
Tri-sodium citrate VWR 33615.268 Prepare the 1 M stock solution diluted in distilled water and store at 4 °C
Pullulanase from Bacillus acidopullulyticus Sigma P2986
Dextranase from Chaetomium erraticum Sigma D0443
NucleoSpin RNA Extraction Kit Macherey-Nagel 740955.5
SuperScript II Reverse Transcriptase Life Technologies 18064-014
Random Primer - Hexamer  Promega C1181 500 µg/mL: Use diluted 1/2 and put 1 µL per sample
Recombinant RNAs in ribonuclease inhibitor Promega N2511 40 U/µL: put 1 µL per sample
PCR nucleotide dNTP mix (10 mM each) Roche 10842321
SyBr Green PCR Master Mix Life Technologies 4368708
Step One Plus Real-Time PCR System Life Technologies 4381792
Formalin solution 10% neutral buffered Sigma HT5012
OCT solution VWR 361603E
Isopentane Sigma M32631
Toluidine blue O VWR 1.15930.0025
Ethanol absolute VWR 20821.310
Toluene VWR 1.08323.1000
Mounting medium Pertex Histolab 840
RPLP0 Primer for qPCR Eurogentec 5'-TGCATCAGTAC
CCCATTCTATCAT-3';
5'-AAGGTGTAATC
CGTCTCCACAGA-3'
Aggrecan Primer for qPCR Eurogentec 5'-TCTACCGCTGCGAGGTGAT-3'; 3'-TGTAATGGAACACGATGCCTTT-5'
Collagen II Primer for qPCR Eurogentec 5'-ACTGGATTGACCCCAACCAA-3'; 3'-TCCATGTTGCAGAAAACCTTCA-5'

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Naumova, A. V., Modo, M., Moore, A., Murry, C. E., Frank, J. A. Clinical imaging in regenerative medicine. Nat Biotechnol. 32 (8), 804-818 (2014).
  2. Edmundson, M., Thanh, N. T., Song, B. Nanoparticles based stem cell tracking in regenerative medicine. Theranostics. 3 (8), 573-582 (2013).
  3. Di Corato, R., et al. High-resolution cellular MRI: gadolinium and iron oxide nanoparticles for in-depth dual-cell imaging of engineered tissue constructs. ACS Nano. 7 (9), 7500-7512 (2013).
  4. Xu, F., et al. Three-dimensional magnetic assembly of microscale hydrogels. Adv Mater. 23 (37), 4254-4260 (2011).
  5. Kito, T., et al. iPS cell sheets created by a novel magnetite tissue engineering method for reparative angiogenesis. Sci Rep. 3, 1418 (2013).
  6. Mironov, V., Kasyanov, V., Markwald, R. R. Nanotechnology in vascular tissue engineering: from nanoscaffolding towards rapid vessel biofabrication. Trends Biotechnol. 26 (6), 338-344 (2008).
  7. Mattix, B. M., et al. Janus magnetic cellular spheroids for vascular tissue engineering. Biomaterials. 35 (3), 949-960 (2014).
  8. Henstock, J., El Haj, A. Controlled mechanotransduction in therapeutic MSCs: can remotely controlled magnetic nanoparticles regenerate bones? Regen Med. 10 (4), 377-380 (2015).
  9. Fayol, D., et al. Use of magnetic forces to promote stem cell aggregation during differentiation, and cartilage tissue modeling. Adv Mater. 25 (18), 2611-2616 (2013).
  10. Bartlett, W., et al. Autologous chondrocyte implantation versus matrix-induced autologous chondrocyte implantation for osteochondral defects of the knee: a prospective, randomised study. J Bone Joint Surg Br. 87 (5), 640-645 (2005).
  11. Batty, L., Dance, S., Bajaj, S., Cole, B. J. Autologous chondrocyte implantation: an overview of technique and outcomes. ANZ J Surg. 81, 18-25 (2011).
  12. Song, L., Baksh, D., Tuan, R. S. Mesenchymal stem cell-based cartilage tissue engineering: cells, scaffold and biology. Cytotherapy. 6 (6), 596-601 (2004).
  13. Boeuf, S., Richter, W. Chondrogenesis of mesenchymal stem cells: role of tissue source and inducing factors. Stem Cell Res Ther. 1 (4), 31 (2010).
  14. Kock, L., van Donkelaar, C. C., Ito, K. Tissue engineering of functional articular cartilage: the current status. Cell Tissue Res. 347 (3), 613-627 (2012).
  15. Schon, B. S., et al. Validation of a high-throughput microtissue fabrication process for 3D assembly of tissue engineered cartilage constructs. Cell Tissue Res. , (2012).
  16. Robert, D., et al. Magnetic micro-manipulations to probe the local physical properties of porous scaffolds and to confine stem cells. Biomaterials. 31 (7), 1586-1595 (2010).
  17. Luciani, N., et al. Successful chondrogenesis within scaffolds, using magnetic stem cell confinement and bioreactor maturation. Acta Biomaterialia. 37, 101-110 (2016).
  18. Wilhelm, C., Gazeau, F. Universal cell labelling with anionic magnetic nanoparticles. Biomaterials. 29 (22), 3161-3174 (2008).
  19. Fayol, D., Luciani, N., Lartigue, L., Gazeau, F., Wilhelm, C. Managing magnetic nanoparticle aggregation and cellular uptake: a precondition for efficient stem-cell differentiation and MRI tracking. Adv Healthc Mater. 2 (2), 313-325 (2013).
  20. Wilhelm, C., Gazeau, F., Bacri, J. C. Magnetophoresis and ferromagnetic resonance of magnetically labeled cells. Eur Biophys J. 31 (2), 118-125 (2002).
  21. Autissier, A., Le Visage, C., Pouzet, C., Chaubet, F., Letourneur, D. Fabrication of porous polysaccharide-based scaffolds using a combined freeze-drying/cross-linking process. Acta Biomater. 6 (9), 3640-3648 (2010).
  22. Singh, N., Jenkins, G. J. S., Asadi, R., Doak, S. H. Potential toxicity of superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPION). Nano Reviews. 1, (2010).
  23. Lee, J. H., Hur, W. Scaffold-free formation of a millimeter-scale multicellular spheroid with an internal cavity from magnetically levitated 3T3 cells that ingested iron oxide-containing microspheres. Biotechnol Bioeng. 111 (5), 1038-1047 (2014).
  24. Mattix, B., et al. Biological magnetic cellular spheroids as building blocks for tissue engineering. Acta Biomaterialia. 10 (2), 623-629 (2014).
  25. Mazuel, F., et al. Massive Intracellular Biodegradation of Iron Oxide Nanoparticles Evidenced Magnetically at Single-Endosome and Tissue Levels. ACS Nano. 10 (8), 7627-7638 (2016).
  26. Kim, J. A., et al. High-throughput generation of spheroids using magnetic nanoparticles for three-dimensional cell culture. Biomaterials. 34 (34), 8555-8563 (2013).
  27. Shimizu, K., Ito, A., Honda, H. Enhanced cell-seeding into 3D porous scaffolds by use of magnetite nanoparticles. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 77 (2), 265-272 (2006).
  28. Sensenig, R., Sapir, Y., MacDonald, C., Cohen, S., Polyak, B. Magnetic nanoparticle-based approaches to locally target therapy and enhance tissue regeneration in vivo. Nanomedicine (Lond). 7 (9), 1425-1442 (2012).
  29. Waldman, S. D., Couto, D. C., Grynpas, M. D., Pilliar, R. M., Kandel, R. A. Multi-axial mechanical stimulation of tissue engineered cartilage: review. Eur Cell Mater. 13, 66-74 (2007).
  30. Takahashi, I., et al. Compressive force promotes sox9, type II collagen and aggrecan and inhibits IL-1beta expression resulting in chondrogenesis in mouse embryonic limb bud mesenchymal cells. J Cell Sci. 111 (14), 2067-2076 (1998).
  31. Campbell, J. J., Lee, D. A., Bader, D. L. Dynamic compressive strain influences chondrogenic gene expression in human mesenchymal stem cells. Biorheology. 43, 455-470 (2006).
  32. Vunjak-Novakovic, G., et al. Bioreactor cultivation conditions modulate the composition and mechanical properties of tissue-engineered cartilage. J Orthop Res. 17 (1), 130-138 (1999).

Tags

जैव अभियांत्रिकी अंक 122 चुंबकीय बलों चुंबकीय मीजेनकाइमल स्टेम कोशिका उपास्थि दोष उपास्थिजनन बायोरिएक्टर ऊतक इंजीनियरिंग
3 डी चुंबकीय स्टेम सेल एकत्रीकरण और बायोरिएक्टर परिपक्वता उपास्थि उत्थान के लिए
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Van de Walle, A., Wilhelm, C.,… More

Van de Walle, A., Wilhelm, C., Luciani, N. 3D Magnetic Stem Cell Aggregation and Bioreactor Maturation for Cartilage Regeneration. J. Vis. Exp. (122), e55221, doi:10.3791/55221 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter