Summary
Хондрогенез из стволовых клеток требует тонкой настройки условия культивирования. Здесь мы представляем магнитный подход для конденсации клеток, существенный шаг для инициирования хондрогенеза. Кроме того, мы покажем, что динамическое Созревание в биореакторе применяется механическое раздражение на клеточные конструкции и повышает хрящевой внеклеточный матрикс.
Abstract
Хрящ инжиниринг остается проблемой из - за трудности в создании функционального имплантат в пробирке , похожий на нативную ткань. Подход недавно исследовали для развития аутологичных замены предполагает дифференциацию стволовых клеток в хондроциты. Для того, чтобы инициировать этот хондрогенез, степень уплотнения стволовых клеток требуется; Таким образом, мы показали возможность магнитно-конденсационные клеток, как в толстых подмостях и строительных лесов, свободные, с использованием миниатюрных источников магнитного поля в виде клеточных аттракторов. Этот магнитный подход был также использован для руководства совокупного слияния и построить помост свободного, организованный, трехмерный (3D) ткани на несколько миллиметров в размере. В дополнении к наличию усовершенствованного размера, ткань, образованная магнитным приводу слияния представлена значительному увеличение экспрессии коллагена II, и подобная тенденция наблюдались для аггрекан экспрессии. Как родной хрящ был подвергнут сил тшлю повлиял на его структуру 3D, динамическое созревание также было проведено. Биореактор, который обеспечивает механические раздражители использовали для культуры магнитно высевают каркасы в течение периода в 21 дней. Биореактор созревание в значительной степени улучшен хондрогенезе в cellularized строительных лесов; внеклеточный матрикс, полученный в этих условиях был богат коллагеном II и аггреканен. Эта работа описывает инновационный потенциал магнитного конденсации меченых стволовых клеток и динамического созревания в биореакторе для улучшения хондрогенной дифференциации, как строительные леса, свободных и внутри полисахаридные строительных лесов.
Introduction
Магнитные наночастицы уже используются в клинике в качестве контрастных агентов для магнитно-резонансной томографии (МРТ), и их терапевтическое применение продолжать расширяться. Например, недавно было показано , что меченые клетки можно манипулировать в естественных условиях с помощью внешнего магнитного поля и может быть направлен и / или поддерживать на определенном месте имплантации 1, 2, 3. В регенеративной медицине, они могут быть использованы для конструирования тканей , организованных в пробирке 4, в том числе сосудистой ткани 5, 6, 7, 8, кости и хряща 9.
Суставной хрящ погружает в аваскулярной среде, что делает ремонт внеклеточных компонентов матрицы очень ограниченный при возникновении повреждений. По этой причине, researcч в настоящее время сосредоточена на проектировании гиалиновых хрящевых замен, которые могут быть имплантированы в месте дефекта. Для того , чтобы произвести замену аутологичной, некоторые исследовательские группы изучают использование аутологичных хондроцитов в качестве источника клеток 10, 11, в то время как другие подчеркивают способность мезенхимальных стволовых клеток (МСК) дифференцироваться в хондроциты 12, 13. В предыдущих исследованиях здесь воспроизводятся, мы выбрали MSC, так как их отбор проб костного мозга достаточно прост и не требует принесения в жертву здоровых хондроцитов, которые рискуют потерять свой фенотип 14.
Одним из первых шагов необходимо инициировать хондрогенную дифференцировку стволовых клеток являются их конденсацией. Клеточные агрегаты , как правило , формируются с использованием либо центрифугирования или Micromass культуры 15; Однако, эти методы конденсации neitheг представить потенциал, чтобы создать кластеры клеток в пределах толстых лесов, ни потенциала, чтобы контролировать слияние агрегатов. В этой статье мы описываем новаторский подход к конденсации стволовых клеток с использованием MSC магнитной маркировки и магнитного притяжения. Эта техника была доказана , чтобы сформировать строительные леса , свободные 3D конструкций через слияние агрегатов друга с другом , чтобы получить миллиметровый масштаб хрящевой ткани 9. Магнитный высев и толстых больших лесов также позволил возможность увеличения размера сконструированной ткани, проектируя форму с большей готовностью полезной для имплантации, а также диверсификации потенциала для клинического применения в восстановлении хрящей. Здесь мы подробно протокол для магнитного высева MSC в пористые каркасы , состоящих из природных полисахаридов, пуллулана, и декстраны, каркасы , которые ранее использовались для удержания стволовых клеток 16, 17. Хондрогенная дифференцировка finallу проводил в биореакторе, чтобы обеспечить непрерывные питательные вещества и диффузию газа в матрице сердцевину каркасов, посеянных с высокой плотностью клеток. Помимо обеспечения питательных веществ, хондрогенные факторов роста и газа к клеткам, биореактор предложил механическую стимуляцию. В целом, магнитная технология, используемая для удержания стволовых клеток, в сочетании с динамическим созреванием в биореакторе, может заметно улучшить хондрогенную дифференциацию.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Построение магнитных устройств
Примечание: Устройства , используемые для посева клеток варьируются в зависимости от применения (рисунок 1). Для формирования агрегатов, количество клеток ограничено до 2,5 × 10 5 / совокупности, так что магнитные наконечники должны быть очень тонкими (750 мкм в диаметре). Для семян на 1,8 см 2/7 мм толщины строительных лесов, магниты должны быть больше (3 мм в диаметре) и будут обеспечивать миграцию клеток через пору строительных лесов.
- Конструкция устройства с микро-магнитов для образования агрегатов (Фигура 1А)
- Сделать микроотверстия с 0,8-мм сверлом через алюминиевые пластины (3 см в диаметре и толщиной 6 мм).
- Вставьте магнитный наконечник (750 мкм в диаметре) в каждое отверстие пластины.
- Поместите этот диск через постоянный неодимовый магнит, который обеспечивает намагниченность насыщения.
- Строительство устройства для строительных лесов высева (
- Вырезать жесткий полистирол в 2,4 см 2 квадратов.
- Вставка 9 маленьких магнитов (3 мм в диаметре, длиной 6 мм) на равном расстоянии над площадью поверхности 1,6 см 2.
- Поместите это устройство на постоянный неодимовый магнит.
2. Stem Cell Этикетировочное
Примечание: Стволовые клетки метили 0,1 мМ магнитных наночастиц в течение 30 мин (2,6 ± 0,2 пг железа / клеток) с образованием агрегатов, в то время как они были помечены 0,2 мМ магнитных наночастиц в течение 30 мин (5 ± 0,4 пг железа / клеток) семени строительные леса. Эти концентрации наночастиц и времени инкубации были использованы ранее , и опубликованы для MSC и других клеток 18, 19, и было установлено , что наночастицы влияет ни на жизнеспособность клеток , ни потенциала дифференциации MSC. Железа масса включена стволовые клетки измеряли с помощью одного-CeLL магнитофорез 19, 20.
- Культура человека мезенхимальные стволовые клетки (MSC) в полной среде мезенхимальных стволовых роста клеток (MSCGM) при 37 ° С и 5% СО 2 до вблизи до слияния (~ 90%).
- Подготовка магнитного раствора маркировки путем смешивания 0,1 или 0,2 мМ маггемитовой цитрат покрытия оксида железа (γFe 2 O 3; сердечник: 8 нм в диаметре) в бессывороточной 5 Маккой среды модифицированного Институте Roswell Park Memorial (RMPI) без глутамина и содержащих 5 мМ цитрат натрия.
- Удалите среды, промыть клетки с бессывороточной RPMI средой без глутамина, и добавляют 10 мл раствора железа оксида наночастиц на 150 см 2 культуральной колбы, минимальный объем , необходимый , чтобы покрыть все клетки.
- Инкубируют в течение 30 мин при 37 ° С и 5% CO 2 , а затем выбросить раствор наночастиц. Полоскание в течение 5 мин с бессывороточной RPMI средой без глутамина интернализации в нанoparticles все еще прикреплен к плазматической мембране.
- Удалите среду RPMI и добавляют 25 мл полной среды MSCGM на колбу. Инкубируют в течение ночи при 37 ° С и 5% СО 2.
3. Магнитный сотовый Посев
- Свеже подготовить хондрогенный среду с использованием Дульбекко в модификации Дульбекко (DMEM) высокий уровень глюкозы с L-глутамина, добавляя 50 мкМ L-аскорбиновой кислоты 2-фосфата, 0,1 мкМ дексаметазон, 1 мМ пирувата натрия, 0,35 мМ L-пролин, 1% универсальной культуры добавка, содержащая инсулин, трансферрин человека и селенистой кислоты (ITS-премикса) и 10 нг / мл трансформирующего фактора роста бета-3 (& beta; 3-ТФР).
- Отделить магнитные клетки с использованием 8 мл 0,05% трипсином-ЭДТА на 150 см 2 культуральной колбы и центрифуги диссоциированных клеток при 260 × г в течение 5 мин. Аспирируйте среды и считать ресуспендировали клетки.
- Поместите прозрачным дном культивирования клеток чашки Петри (35 мм) в верхней части обоих магнитных устройств.
- Для мagnetically образуют агрегаты, добавляют 3 мл хондрогенной среды в чашке Петри и осторожно депонировать наименьший объем возможного (не более 8 мкл) , содержащий 2,5 × 10 5 клеток на меченых агрегата (до 16 агрегатов могут быть осаждены). Оставьте чашку Петри в течение 20-30 мин , не перемещая его, что позволяет ему формировать сфероиды, а затем поместить полное устройство, в том числе чашки Петри , содержащей 16 заполнителей в инкубатор при 37 ° С и 5% CO 2.
- агрегаты управления формы по тому же протоколу и заменить полную среду с хондрогенной средой без TGF-В3.
- Для того, чтобы генерировать совокупный конструкцию 3D, 2 место агрегатов в контакт на 8-й день, чтобы сформировать 8 дублеты и инициировать синтез. На 11-й день, объединить 2 дублеты с образованием 4 четверок. И, наконец, предохранитель 4 четверок на 15-й день, чтобы получить конечную структуру.
- В то же время, образуют агрегаты центрифугирования 2,5 × 10 5 клетки помечены стволовых при 26015; г в течение 5 мин в 15-мл пробирки с 1,5 мл хондрогенной среды с добавлением или без TGF-& beta; 3 (для образца и контроля, соответственно).
- Магнитны семенных подмости, поместите каждую высушенную леску в чашку Петри. Использование полисахаридные пористых каркасов , изготовленных из пуллулана / декстран 21. Для каждого помост, развести 2 × 10 6 меченых стволовых клеток в 350 мкл среды без хондрогенной TGF-В3 и осторожно пипеткой клетки на помост.
- Инкубировать в течение 5 мин при 37 ° С, чтобы обеспечить проникновение в клетки полного каркаса, а затем осторожно добавляют 3 мл хондрогенной среды с или без TGF-& beta; 3 (для образца или контроля, соответственно) в чашку Петри.
- Инкубируйте cellularized леску на его магнитном устройстве при 37 ° С и 5% СО 2 в течение 4 дней , чтобы обеспечить миграцию клеток через пору строительных лесов и заключение.
- В то же время, семена строительных лесов с 2 × 10 6
4. Дифференцирование в хондроциты
Примечание: После 4 дней инкубации, удалить магниты и продолжить хондрогенное созревание либо в чашке Петри (статические условия) или в биореакторе (динамические условия). Отрицательные контрольные образцы выдерживаются в статических условиях при хондрогенной среде без TGF-& beta; 3.
- В статических условиях, сохранить cellularized подмости или агрегатов в той же чашке Петри. Изменение хондрогенный среду дважды в неделю в течение 21 дней.
- В динамических условиях, подготовить биореактор.
- Вырезать силиконовые трубки на соответствующей длины в соответствии с протоколом производителя.
- Автоклав все материалы: 500 мл культуры в камере, насосно-компрессорных, 2-полосная ротаторы, и садках.
- Поместите биореактор части в стерильный Microbioлогической безопасности станции. Подключите трубку к 2-полосным ротаторам и к культуре камере в соответствии с инструкциями изготовителя.
- Аккуратно перенести cellularized каркасов в стерилизованные клетки с использованием стерильного шпателя. Поместите 2 подмости на клетку. Когда клетки готовы, вставить их в иглы крышки, чтобы держать их от перемещения во время дальнейшего вращения. Заполните камеру культуры с хондрогенной средой и закрыть его с крышкой, содержащей клетку.
- Включите шланговый насос для заполнения трубки с хондрогенной среды и удаления пузырьков воздуха.
- Поместите и закрепите камеру, заполненную в двигатель биореактора и включите компьютер, который контролирует вращение оба плеча и камеры.
- Нанесите скорость вращения 5 оборотов в мин (оборотов в минуту) на обоих руку и камерой. Настройка перистальтического насоса при скорости потока 10 оборотов в минуту для непрерывной подачи из cellularized каркасов.
Примечание: Перед экстракции РНК, переваривать каркасы с раствором ферментативного.
- Подготовить 1 мл ферментативного раствора добавлением 100 мкл пуллуланазы (40 ед / мл) и 50 мкл декстраназы (60 мг / мл) до 850 мл свободной от сыворотки DMEM среды.
- Промыть каркасы дважды бессывороточной DMEM среде, отказаться от среды, и добавить 800 мкл ферментативного раствора на строительных лесов. Инкубировать в течение 15-30 мин при температуре 37 ° С при осторожном перемешивании.
- Когда каркас полностью растворяется, перенести раствор, содержащий клетки в пробирку 1,5 мл, центрифуге при 300 × г в течение 10 мин, тщательно аспирата среду, в два раза промыть стерильной 1 × фосфатно-солевом буфере (PBS), центрифуге при 300 × г в течение 10 мин, и вновь приостановить клетки в растворе для выделения РНК.
- Для того, чтобы извлечь РНК из агрегатов, поместите сфероидов в растворе изоляции РНК иполностью подавить их с помощью гомогенизатора перед проведением экстракции РНК.
- Изолировать РНК с использованием набора для экстракции суммарной РНК в соответствии с инструкциями изготовителя.
- Синтезировать комплементарную ДНК от 400 нг тотальной РНК с использованием обратной транскриптазы в соответствии с инструкциями производителя, используя 250-нг случайных праймеров, 1 мкл смеси дНТФ (10 мМ каждого), и 40 Ед / мл РНКазы ингибитора; конечный объем реакции 20 мкл. В конце реакции, добавить 80 мкл дистиллированной воды с получением конечного объема 100 мкл.
- Для количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР), используют смесь ПЦР, содержащий флуоресцентный реагент для количественного определения относительной экспрессии генов, представляющих интерес, таких как аггрекан (AGC) и коллагена II (COL II), 10 × разбавленной кДНК. Нормализация уровней экспрессии генов с рибосомным белком контрольного гена, Большой, Р0 (RPLP0). Выполните расчеты с 2 - формула ΔΔCT, Где ΔΔCT = & Delta; ЕТ дифференцированное состояние - среднее & Delta; ЕТ состояние управления, и каждый представляет собой & Delta; ЕТ КТ интерес гену - КТ эталонного гену (RPLP0).
- Определение статистических измерений, как средние значения ± стандартная ошибка среднего (SEM). Выполните анализ с п ≥ 2 независимых экспериментов. Используйте Т-тест Стьюдента для анализа статистических различий между центрифугированными гранулами и магнитным слитыми (* р <0,05). Определяют значение с критерия Крускала-Уоллиса (односторонний ANOVA непараметрической) анализировать статистические различия между дифференцированными подмостей и с контрольной эшафот (* р <0,05).
6. Гистологический анализ
- Промыть cellularized каркасы или агрегаты со стерильным 1 × PBS, фиксируют их в 10% растворе формалина в течение 1 ч при комнатной температуре, и промывают 1 × PBS.
- Удалить PBS, встраивать образцы в оптимальном разрезалг Температура соединение (ОКТ), и заморозить их в ванне изопентана, погруженной в жидком азоте. Хранить образец при -20 ° С. Вырезать образцы с криостатом, чтобы получить 8-мкм криосрезов для агрегатов или 12-мкм для cellularized каркасов.
- Пятно криосрезов с 0,5% толуидиновым синим раствором в течение 2 мин, промыть в водопроводной воде, обезвоживают со 100% -ный этанолом, уточнение с использованием толуола, и смонтировать слайды с монтажной средой для световой микроскопии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Во- первых, агрегаты могут быть индивидуально сформированы с использованием микро-магнитов путем осаждения 2,5 × 10 5 меченых стволовых клеток (фиг.2А). Эти агрегаты одиночные (~ 0,8 мм по размеру), могут быть затем слиты в более крупные структуры, благодаря последовательному, магнитоиндуцированного слияния. Так, например, на 8-е дня хондрогенного созревания, агрегаты были помещены в контакте в парах с образованием дублеты; квадруплетные были собраны на 11-й день путем слияния 2 дублета; и , наконец, на 15 -й день, 4 квадруплетные были слиты с образованием 3D - конструкцию , содержащую 16 из первоначально образованных агрегатов, в общей сложности 4 × 10 6 клеток (~ 4 мм по размеру) (рис 2В). Во-вторых, тот же метод магнитного притяжения используется для формирования клеточных агрегатов внутри каркасов. Каркасы высевали над магнитным устройством и показал плотно конденсируется клеток в порах каркаса, в местах , точных микро-магнитов (рис 2C). В отличие от этого, когда клетки высевали в пределах помост без магнитного притяжения (пассивное высева), они были найдены, чтобы быть равномерно распределены. Cellularized каркасы затем были вставлены в клетки (рис 3А) , прикрепленных к камере биореактора для выполнения хондрогенного процесса в динамических условиях созревания (фигура 3В). Такой биореактор улучшает питательные вещества и газов обменов и обеспечивает механическую стимуляцию трансдукцией. Скорость вращения обоих кронштейна и камеры доводили до 5 оборотов в минуту, в соответствии с рекомендациями конструктору для мягкой регенерации тканей 3D. Перистальтический насос, который обеспечивает непрерывную подачу среды была установлена на уровне 10 оборотов в минуту.
Для всех условий организации клеток (сплавленных агрегатов и посева в каркасах) и созревание тканей (в биореакторе или без него), экспрессия гена была проанализирована на 25 день Ткани, образованное слиянием магнитного показала СИГВВПувеличение ficant экспрессии коллагена II по сравнению с таблеткой , полученной центрифугированием (фиг.4А), вместе с увеличением тенденции аггрекана экспрессии. Для cellularized строительных лесов, мы получили увеличение аггреканны и коллаген II, выражение-значимое для коллагена II-, когда был использована магнитные затравки, по сравнению с каркасами высевают без магнитных сил. Кроме того, экспрессия обоих генов была значительно выше (значение для Col II) , когда магнитное затравки была объединена с динамической дифференциации (фиг.4В).
Гистологические анализы были также выполнены, например, с использованием толуидинового синего пятна, чтобы выявить гликозаминогликана (ГАГА). Последовательное магнитное слияние 16 агрегатов выставлены обильные отложения ГАГ, о чем свидетельствует сине-фиолетового цвета (рис 5А). Для подмостей, только те магнитно высевают окрашивали толуидиновым синим. GAG contenт была выше , когда каркасы были дифференцированы в биореакторе (фигура 5В), чем статический (5С). Взятые вместе, эти результаты демонстрируют потенциал магнитной агрегации и магнитного высева в пределах строительных лесов для повышения хондрогенеза. Он также указывает на то, что динамические условия созревания в биореакторе гораздо более благоприятной для эффективной дифференциации.
Рисунок 1. Построение магнитных устройств. (А) Пример магнитного устройства для образования агрегатов: алюминиевая пластина была пробурена (отверстие мкм диаметра 0,8) и наконечники были вставлены в каждой лунке , а затем помещает на постоянная неодимовый магнит, что обеспечивало намагничивание до насыщения. (Б) Магнитное устройство семян подмостей: твердый полистирол (24 мм 2) с 9 вручную из отверстий былоразмещены на постоянной неодимовый магнит, что обеспечивало намагниченность насыщения. Маленькие магниты (3 мм в диаметре) были затем вставляют в каждое отверстие, чтобы сформировать устройство. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Магнитные маркировки стволовых клеток и посева. (А) Стволовые клетки метили наночастицы оксида железа в течение 30 мин при 37 ° С. (B) сфероиды были сформированы из меченых клеток , привлеченной сетью 16 микро-магнитов. Агрегаты были объединены в четверок на 11-й день путем слияния дублетов, образованных за 3 дня до. В квадруплетном были затем сливают на 15-е дня, чтобы построить окончательные сконструированные ткани. (C) леска, помещает в стеклянном дне блюда, вносил затравку илииз магнитных сил. На 4-е дня, наблюдались пятна уплотненных стволовых клеток в магнитно-затравке помоста, в то время как клетки появились равномерно распределены в помосте затравки без магнита. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Динамическая созреванию cellularized каркасов. (А) После того, как магнитный или пассивного высева, cellularized каркасы были помещены в клетки , чтобы избежать срыва. (В) Клетки, фиксированные с помощью иглы колпачка, были помещены в сосуд биореактора , заполненной хондрогенной средой. Биореактор применяется двухосный вращение с независимо регулируемой скоростью (1-12 оборотов в минуту и 1-35 оборотов в минуту для руки и камеры, соответственно). Перистальтический насос непрерывно при условии, Mediгм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4. Экспрессия специфических генов хондрогенных на день 25. (А) магнитоиндуцированный слияние MSC сфероидов показало значительное увеличение коллагена II по сравнению с таблеткой , образованной путем центрифугирования. * Обозначает статистически достоверное отличие с помощью Т-теста Стьюдента (р-значение <0,05). (В) Выражение аггрекан и коллагена II , были четко увеличилось в каркасах дифференцированных с комбинацией магнитной высева и динамического созревания в биореакторе. экспрессии генов были нормализованы на мРНК RPLP0 и выражала в произвольных единицах по сравнению с контрольным (~ 1 ± SEM). Результаты представлены в виде средних значений ± SEM от двух до четырех независимых экспериментов. * ДиноTes статистическую разницу с помощью теста Крускала-Уоллиса (однофакторного дисперсионного анализа непараметрический тест) (р-значение <0,05). (-): Посев без магнита; (+): Затравки с магнитными силами. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5. Гистологическое окрашивание гликозаминогликанов на день 25. гликозаминогликановых (ГАГ) отложения свидетельствуют сине-фиолетовой окраски. (А) Положительные толуидиновое синее пятно наблюдались в 8 мкм криосрезов конечной хрящевой структуры , полученной из последовательного слияния 16 агрегатов. В 12-мкм криосрезы каркасов с магнитным посеянных после статического (В) или динамическими (C) условиях ясно показали ,что содержание ГАГ было выше в каркасах дифференцированных в биореакторе. Стрелки указывают агрегаты дифференцированных клеток. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Во-первых, потому что методы, представленные здесь, основаны на интернализации магнитных наночастиц, один важный вопрос, является результатом наночастиц, когда они локализуются в клетках. Это верно , что наночастицы железа могут вызвать потенциальную токсичность или нарушенную способность дифференциации в зависимости от их размера, покрытия, и времени экспозиции 19, 22. Тем не менее, некоторые исследования не показали никакого влияния на клеточной физиологии , когда наночастицы железа инкапсулированные были использованы 23 в форме magnetoferritin, биологической магнитной наночастицы 24, или были использованы с простым цитрата покрытием и адекватных концентраций 18. Кроме того, когда наночастицы оксида железа были использованы в том же условиях, которые описан в данной работе (с MSC и хондрогенез), недавно мы показали, что быстрая и практически полная деградация nanopartiCles происходит внутри эндосом приблизительно через 10 дней после клеточного включения и образования MSC сфероида. Интересно, что это массовое ухудшение было связанно с эффективным хранением свободного железа в ферритине белки и в результате очень ограниченное влияние на клеточном метаболизме железа, предвещающее хорошо для будущих клинических применений 25.
Другой важный момент является требованием клеточного уплотнения для инициирования хондрогенеза. Как правило, конденсация клеток достигается за счет центрифугирования; Однако, этот способ ограничен небольшим числом клеток (не более 2,5 × 10 5 клеток). Прошлое это число, питательные вещества и газ не могут диффундировать к центру агрегатов, вызывая некроз клеток. Здесь, магнитная конденсация меченых стволовых клеток в агрегаты появляется в качестве важного способа для формирования 3D-конструкции для регенерации хрящевой ткани. Такая магнитная процедура была использована другими авторами впостроить 3D сфероидов: с помощью магнитной левитации с помощью магнита , размещенного на верхней части пластины после диссоциации клеток 23 или с железными штырями , чтобы локализовать магнитное поле 26. Однако, магнитная левитация не по всей видимости, подходит для дальнейших этапов совокупного синтеза. В противоположность этому, с магнитным метод, предложенный здесь, мы можем контролировать все этапы слияния, чтобы получить конструкцию хрящевой ткани шаг за шагом. Вкратце, этот многоступенчатый процесс начинается с удержанием стволовых клеток в совокупность строительных блоков и сопровождается слиянием этих блоков в более крупную структуру. Критические этапы этой стволовой процедуры агрегации клеток строительных лесов, свободных являются следующие: во-первых, необходимо формировать каждый агрегат с, как небольшой объем клеток, как это возможно, и второй, необходимо контролировать шаги слитые, чтобы избежать образования единой, большой агрегат. Ткани, полученные здесь, были богаты коллагеном II и аггреканен. Он также представил advantagES наличия гибкой геометрии и размера, и того, чтобы быть леска свободной.
Магнитный подход был также использован для направления стволовых клеток в толстых и больших строительных лесах; другая альтернатива для конструкции различных форм и размеров. Важный шаг здесь является семенами строительных лесов с соответствующим объемом клеток: ни слишком мало, чтобы иметь общее гомогенное распределение клеток, и не слишком много, чтобы избежать потерь клеток. Магнитные силы были ранее использованы для привлечения и удержания клеток в каркасах и усилить клеточный высев 27, 28. Здесь, достаточная конденсация клеток в порах полисахаридных каркасов привела к успешному хондрогенезу. Продукции внеклеточного матрикса была заметно улучшена, когда магнитно-cellularized каркасы были подвергнуты стресс-раздражители / сдвига трансдукции, предоставляемых биореактора благодаря его би-осевого вращения. Это было показано в других исследованиях, MULти-осевые условия нагрузки улучшилось качество тканей , образованных из хондроцитов 29. Эта новая концепция биореактора представляет собой реальный прирост по сравнению с существующими методами, где только сила сжатий применяется 30, 31, 32.
В заключении, для хондрогенной дифференциации, использование магнитного удержания меченых стволовых клеток для формирования и манипулировать агрегаты, а также семена строительных лесов, разрешенные для создания миллиметрового размера хрящевых клеточных конструкций. Кроме того, сочетание магнитного посева клеток с динамической дифференциацией представляет собой ценный новый инструмент для приложений регенеративной медицины.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы отметить QuinXell технологии и CellD, в частности, Лотар Граннманн и Доминик Гозлан за их помощь в биореакторе. Мы благодарим Екатерину Le Visage, который предоставил нам с пуллулановыми / декстранами полисахаридов каркасов. Эта работа была поддержана Европейским Союзом (проект ERC-2014-CoG Матисса 648779) и по AgenceNationalede ла Recherche (ANR), Франция (проект MagStem ANR-11 SVSE5).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Iron oxide (maghemite) nanoparticules (γ-Fe2O3) | PHENIX - University Paris 6 | Made and given by C. Ménager | Mean diameter of 8.1 nm and negative surface charge |
| Polysaccharide Pullulan/Dextran scaffolds | LIOAD - University Nantes | Made and given by C. Le Visage | Prepared from a 75:25 mixture of pullulan/dextran in alkaline conditions (10 M NaOH). Porosity: 185-205 µm; Thickness: 7 mm; Surface area: 1.8 cm2. |
| TisXell Regeneration System | QuinXell Technologies | QX900-002 | Biaxial bioreactor with 500 mL culture chamber |
| Cage for scaffolds: Histosette II M492 | VWR | 720-0909 | |
| Mesenchymal Stem Cell (MSC) | Lonza | PT-2501 | Three independant batches have been used |
| MSCGM BulletKit medium | Lonza | PT-3001 | For the complete medium, add the provided BulletKit (containing serum, glutamine and antibiotics) to the MSCGM medium |
| DMEM with Glutamax I | Life Technologies | 31966-021 | No sodium pyruvate, no HEPES |
| RPMI medium 1640, no Glutamine | Life Technologies | 31870-025 | No sodium pyruvate, no HEPES |
| PBS w/o CaCl2 w/o MgCl2 | Life Technologies | 14190-094 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25300-054 | |
| Penicillin (10,000 U/mL) / Streptomycin (10,000 µg/mL) | Life Technologies | 15140-122 | |
| ITS Premix Universal Culture Supplement (20x) | Corning | 354352 | |
| Sodium pyruvate solution 100 mM | Sigma | S8636 | |
| L-Ascorbic Acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | Prepare the concentrated solution (25 mM) in distilled water extemporaneously |
| L-Proline | Sigma | P5607 | Prepare the 175 mM stock solution diluted in distilled water and store at 4 °C |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | Prepare the 1 mM stock solution diluted in Ethanol 100% and store at -20 °C |
| TGF-beta 3 protein 10 µg | Interchim | 30R-AT028 | |
| Tri-sodium citrate | VWR | 33615.268 | Prepare the 1 M stock solution diluted in distilled water and store at 4 °C |
| Pullulanase from Bacillus acidopullulyticus | Sigma | P2986 | |
| Dextranase from Chaetomium erraticum | Sigma | D0443 | |
| NucleoSpin RNA Extraction Kit | Macherey-Nagel | 740955.5 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Life Technologies | 18064-014 | |
| Random Primer - Hexamer | Promega | C1181 | 500 µg/mL: Use diluted 1/2 and put 1 µL per sample |
| Recombinant RNAs in ribonuclease inhibitor | Promega | N2511 | 40 U/µL: put 1 µL per sample |
| PCR nucleotide dNTP mix (10 mM each) | Roche | 10842321 | |
| SyBr Green PCR Master Mix | Life Technologies | 4368708 | |
| Step One Plus Real-Time PCR System | Life Technologies | 4381792 | |
| Formalin solution 10% neutral buffered | Sigma | HT5012 | |
| OCT solution | VWR | 361603E | |
| Isopentane | Sigma | M32631 | |
| Toluidine blue O | VWR | 1.15930.0025 | |
| Ethanol absolute | VWR | 20821.310 | |
| Toluene | VWR | 1.08323.1000 | |
| Mounting medium Pertex | Histolab | 840 | |
| RPLP0 Primer for qPCR | Eurogentec | 5'-TGCATCAGTAC CCCATTCTATCAT-3'; 5'-AAGGTGTAATC CGTCTCCACAGA-3' |
|
| Aggrecan Primer for qPCR | Eurogentec | 5'-TCTACCGCTGCGAGGTGAT-3'; 3'-TGTAATGGAACACGATGCCTTT-5' | |
| Collagen II Primer for qPCR | Eurogentec | 5'-ACTGGATTGACCCCAACCAA-3'; 3'-TCCATGTTGCAGAAAACCTTCA-5' |
References
- Naumova, A. V., Modo, M., Moore, A., Murry, C. E., Frank, J. A.
- Edmundson, M., Thanh, N. T., Song, B. Nanoparticles based stem cell tracking in regenerative medicine. Theranostics. 3 (8), 573-582 (2013).
- Di Corato, R., et al. High-resolution cellular MRI: gadolinium and iron oxide nanoparticles for in-depth dual-cell imaging of engineered tissue constructs. ACS Nano. 7 (9), 7500-7512 (2013).
- Xu, F., et al. Three-dimensional magnetic assembly of microscale hydrogels. Adv Mater. 23 (37), 4254-4260 (2011).
- Kito, T., et al. iPS cell sheets created by a novel magnetite tissue engineering method for reparative angiogenesis. Sci Rep. 3, 1418 (2013).
- Mironov, V., Kasyanov, V., Markwald, R. R. Nanotechnology in vascular tissue engineering: from nanoscaffolding towards rapid vessel biofabrication. Trends Biotechnol. 26 (6), 338-344 (2008).
- Mattix, B. M., et al. Janus magnetic cellular spheroids for vascular tissue engineering. Biomaterials. 35 (3), 949-960 (2014).
- Henstock, J., El Haj, A. Controlled mechanotransduction in therapeutic MSCs: can remotely controlled magnetic nanoparticles regenerate bones? Regen Med. 10 (4), 377-380 (2015).
- Fayol, D., et al. Use of magnetic forces to promote stem cell aggregation during differentiation, and cartilage tissue modeling. Adv Mater. 25 (18), 2611-2616 (2013).
- Bartlett, W., et al. Autologous chondrocyte implantation versus matrix-induced autologous chondrocyte implantation for osteochondral defects of the knee: a prospective, randomised study. J Bone Joint Surg Br. 87 (5), 640-645 (2005).
- Batty, L., Dance, S., Bajaj, S., Cole, B. J. Autologous chondrocyte implantation: an overview of technique and outcomes. ANZ J Surg. 81, 18-25 (2011).
- Song, L., Baksh, D., Tuan, R. S. Mesenchymal stem cell-based cartilage tissue engineering: cells, scaffold and biology. Cytotherapy. 6 (6), 596-601 (2004).
- Boeuf, S., Richter, W. Chondrogenesis of mesenchymal stem cells: role of tissue source and inducing factors. Stem Cell Res Ther. 1 (4), 31 (2010).
- Kock, L., van Donkelaar, C. C., Ito, K. Tissue engineering of functional articular cartilage: the current status. Cell Tissue Res. 347 (3), 613-627 (2012).
- Schon, B. S., et al. Validation of a high-throughput microtissue fabrication process for 3D assembly of tissue engineered cartilage constructs. Cell Tissue Res. , (2012).
- Robert, D., et al. Magnetic micro-manipulations to probe the local physical properties of porous scaffolds and to confine stem cells. Biomaterials. 31 (7), 1586-1595 (2010).
- Luciani, N., et al. Successful chondrogenesis within scaffolds, using magnetic stem cell confinement and bioreactor maturation. Acta Biomaterialia. 37, 101-110 (2016).
- Wilhelm, C., Gazeau, F. Universal cell labelling with anionic magnetic nanoparticles. Biomaterials. 29 (22), 3161-3174 (2008).
- Fayol, D., Luciani, N., Lartigue, L., Gazeau, F., Wilhelm, C. Managing magnetic nanoparticle aggregation and cellular uptake: a precondition for efficient stem-cell differentiation and MRI tracking. Adv Healthc Mater. 2 (2), 313-325 (2013).
- Wilhelm, C., Gazeau, F., Bacri, J. C. Magnetophoresis and ferromagnetic resonance of magnetically labeled cells. Eur Biophys J. 31 (2), 118-125 (2002).
- Autissier, A., Le Visage, C., Pouzet, C., Chaubet, F., Letourneur, D. Fabrication of porous polysaccharide-based scaffolds using a combined freeze-drying/cross-linking process. Acta Biomater. 6 (9), 3640-3648 (2010).
- Singh, N., Jenkins, G. J. S., Asadi, R., Doak, S. H. Potential toxicity of superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPION). Nano Reviews. 1, (2010).
- Lee, J. H., Hur, W. Scaffold-free formation of a millimeter-scale multicellular spheroid with an internal cavity from magnetically levitated 3T3 cells that ingested iron oxide-containing microspheres. Biotechnol Bioeng. 111 (5), 1038-1047 (2014).
- Mattix, B., et al. Biological magnetic cellular spheroids as building blocks for tissue engineering. Acta Biomaterialia. 10 (2), 623-629 (2014).
- Mazuel, F., et al. Massive Intracellular Biodegradation of Iron Oxide Nanoparticles Evidenced Magnetically at Single-Endosome and Tissue Levels. ACS Nano. 10 (8), 7627-7638 (2016).
- Kim, J. A., et al. High-throughput generation of spheroids using magnetic nanoparticles for three-dimensional cell culture. Biomaterials. 34 (34), 8555-8563 (2013).
- Shimizu, K., Ito, A., Honda, H. Enhanced cell-seeding into 3D porous scaffolds by use of magnetite nanoparticles. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 77 (2), 265-272 (2006).
- Sensenig, R., Sapir, Y., MacDonald, C., Cohen, S., Polyak, B. Magnetic nanoparticle-based approaches to locally target therapy and enhance tissue regeneration in vivo. Nanomedicine (Lond). 7 (9), 1425-1442 (2012).
- Waldman, S. D., Couto, D. C., Grynpas, M. D., Pilliar, R. M., Kandel, R. A. Multi-axial mechanical stimulation of tissue engineered cartilage: review. Eur Cell Mater. 13, 66-74 (2007).
- Takahashi, I., et al. Compressive force promotes sox9, type II collagen and aggrecan and inhibits IL-1beta expression resulting in chondrogenesis in mouse embryonic limb bud mesenchymal cells. J Cell Sci. 111 (14), 2067-2076 (1998).
- Campbell, J. J., Lee, D. A., Bader, D. L. Dynamic compressive strain influences chondrogenic gene expression in human mesenchymal stem cells. Biorheology. 43, 455-470 (2006).
- Vunjak-Novakovic, G., et al. Bioreactor cultivation conditions modulate the composition and mechanical properties of tissue-engineered cartilage. J Orthop Res. 17 (1), 130-138 (1999).
