Summary
幹細胞から軟骨形成は、培養条件の微調整が必要です。ここで、我々は、細胞を集光するための軟骨形成を開始するために不可欠なステップを磁気アプローチを提示します。また、当社は、バイオリアクター内の動的成熟は、細胞の構造に機械的刺激を適用し、軟骨細胞外マトリックスの産生を増強することを示しています。
Abstract
軟骨工学は、ネイティブの組織に似たin vitro機能インプラントを作成するのが困難に起因する課題です。最近、自家代替品の開発のための探求のアプローチは、軟骨細胞への幹細胞の分化に関与します。この軟骨形成を開始するには、幹細胞の圧縮度が要求されます。したがって、我々は、細胞アトラクタとして小型化磁界源を使用して、厚い足場と足場フリー内の両方、磁気凝縮細胞の実現可能性を実証しました。この磁気アプローチはまた、凝集融合を誘導する足場を含まない構築するために使用される組織化、三次元（3D）のサイズの数ミリメートルを組織しました。強化されたサイズを有することに加えて、磁気駆動の融合によって形成された組織は、コラーゲンIIの発現の有意な増加を提示し、同様の傾向がアグリカン発現のために観察されました。ネイティブの軟骨が力トンに供した通り帽子は、その立体構造に影響を与えた、ダイナミックな成熟も行いました。機械的な刺激を提供するバイオリアクターは、21日間にわたって培養物に磁気播種足場を使用しました。バイオリアクターの成熟は、主として細胞化足場に軟骨形成を向上させます。これらの条件下で得られた細胞外マトリックスは、コラーゲンIIおよびアグリカンに富んでいました。この作業は、改善された軟骨形成分化、足場フリーの両方に多糖類の骨格内のバイオリアクター中で標識された幹細胞の磁気凝集及び動的成熟の革新的な可能性を概説します。
Introduction
磁性ナノ粒子は、既に磁気共鳴画像（MRI）用造影剤としてクリニックで使用されており、それらの治療への応用が拡大し続けます。例えば、最近、標識された細胞は、移植1、2、3の定義された部位に外部磁界を用いてin vivoで操作することができ、向けることができ、および/または維持することが示されています。再生医療において、それらは血管組織5、6、7、8、骨、および軟骨9を含むインビトロ 4 で編成組織を操作するために使用することができます。
関節軟骨は、損害が発生したときに、非常に限られた細胞外マトリックス成分の修理を行う、無血管環境に浸漬されます。このため、researc用時間は、現在、欠損部位に移植することができ硝子軟骨置換のエンジニアリングに焦点を当てています。他のものは軟骨12,13に分化する間葉系幹細胞（MSC）の能力を強調しながら、自己置換を生成するために、いくつかの研究グループは、セルソース10、11のような自家軟骨細胞の使用を模索しています。彼らの骨髄採取はかなりシンプルで、自分の表現型14を失う危険健全な軟骨細胞の犠牲を必要としないので、ここで再現した以前の研究では、我々は、MSCを選択しました。
幹細胞の軟骨形成分化を開始するために不可欠早い段階で彼らの結露です。細胞凝集体は、一般に遠心分離またはマイクロマス培養15のいずれかを用いて形成されています。しかし、これらの縮合方法neitheR厚い足場内の細胞クラスタを作成する可能性も凝集体の融合を制御する可能性を提示します。本稿では、MSC磁気標識及び磁気吸引力を利用した幹細胞を凝縮する革新的なアプローチについて説明します。この技術は、ミリメートルスケール軟骨組織9を得るために互いに凝集体の融合を介して足場フリー3D構築物を形成することが証明されています。厚いと大きな足場の磁気播種はまた、改変された組織のサイズを大きくする移植のためより容易に有用な形状を設計、および軟骨修復における臨床応用の可能性を多様化する可能性を可能にしました。ここでは、天然多糖類、プルラン、およびデキストランからなる多孔質足場にMSCの磁気シーディングのために、私たちの詳細プロトコルは、足場は以前幹細胞16、17を閉じ込めるために使用されます。軟骨形成分化がfinallましたyは細胞の高い密度で播種した足場のマトリックスコアに連続的な栄養素とガス拡散を確実にするために、バイオリアクターで行います。細胞に栄養、軟骨形成成長因子、およびガスを提供するだけでなく、バイオリアクターは、機械的刺激を提供しました。全体として、バイオリアクター内で動的成熟と組み合わされた幹細胞を閉じ込めるために使用される磁気技術は、著しく軟骨形成分化を向上させることができます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
磁気デバイスの1建設
注：細胞播種のために使用されるデバイスは、アプリケーションに依存して変化する（ 図1）。磁気チップは（直径750μm）と非常に薄くなければならないので、凝集体を形成するために、細胞数は、2.5×10 5 /集約に限定されます。 1.8センチメートル2月 7日mm厚足場を播種するために、磁石は大きくなければならない（直径3mm）と、足場の孔を通って細胞移動を確実にします。
- 凝集体形成のための微小磁石を有するデバイスの構築（ 図1A）
- アルミニウム板を介して0.8 mmのドリルを有するマイクロ孔（直径3センチ、厚さ6mm）を作ります。
- プレートの各穴に磁気先端（直径750μm）を挿入します。
- 飽和に磁化を確実に永久ネオジム磁石、上でこのディスクを置きます。
- 足場の播種用のデバイスの構築（
- 2.4センチメートル2つの正方形にハードポリスチレンをカット。
- 1.6センチメートル2の表面積にわたって等距離9つの小さな磁石（直径3mm、長6ミリメートル）を挿入します。
- 永久ネオジム磁石の上にこのデバイスを置きます。
2.幹細胞標識
注：これらは30分（5±0.4 pgの鉄/細胞）で播種するために0.2mMの磁性ナノ粒子で標識しつつ、幹細胞は、30分（2.6±0.2 pgの鉄/細胞）凝集体を形成するために0.1mMの磁性ナノ粒子で標識しました足場。これらのナノ粒子の濃度およびインキュベーション時間は、以前に使用し、MSCおよび他の細胞18、19のために公開し、ナノ粒子がどちらの細胞生存率もMSCの分化能に影響を与えたことが確認されているされています。幹細胞に組み込まれた鉄の塊は、単一のCEを介して測定しました。LL磁気泳動19、20。
- 近くまで37℃、5％CO 2で、完全な間葉系幹細胞増殖培地（MSCGM）で培養ヒト間葉系幹細胞（MSC）は、（〜90％）をコンフルエンスまで。
- グルタミンなしロズウェルパーク記念研究所（RMPI）で修飾された無血清マッコイ5A培地および5を含む：0.1又は0.2ミリモルのマグヘマイトクエン酸でコーティングされた鉄酸化物（8 nmの直径コア被着γFe2 O 3）を混合することにより、磁気標識溶液を調製mMクエン酸ナトリウム。
- 、培地を捨てグルタミンなしの無血清RPMI培地で細胞をすすぎ、150-cm 2の培養フラスコ、すべてのセルをカバーするために必要な最小体積当たりの鉄酸化物ナノ粒子溶液10mLを加えます。
- 37℃で30分間インキュベートし、5％CO 2、次いでナノ粒子溶液を捨てます。ナンを内部化するためにグルタミンなし無血清RPMI培地で5分間すすぎますまだ形質膜に付着oparticles。
- RPMI培地を廃棄し、フラスコ当たり完全MSCGM培地25mlを加えます。 37℃で一晩インキュベートし、5％CO 2。
3.磁気細胞播種
- 新たに50μMのL-アスコルビン酸-2-リン酸、0.1μMデキサメタゾン、1mMピルビン酸ナトリウム、0.35 mMのL-プロリン、1％ユニバーサル培養を添加することにより、L-グルタミンを有するダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）、高グルコースを用いて軟骨形成培地を調製インスリン、ヒトトランスフェリン、および亜セレン酸（ITS-プレミックス）、及び10ng / mLの形質転換増殖因子ベータ3（TGF-β3）を含むサプリメント。
- 150-cm 2の培養フラスコ及び遠心あたり0.05％トリプシン-EDTA 8mLの5分間260×gで解離した細胞を用いた磁気細胞を切り離します。メディアを吸引除去し、再懸濁した細胞を数えます。
- 両方の磁気デバイスの上部にガラス底細胞培養ペトリ皿（34 mm）を置きます。
- Mにagnetically、凝集体を形成するペトリ皿に軟骨形成培地3mlを加え、穏やかに（16の凝集体まで堆積させることができる）集計当たり2.5×10 5個の標識細胞を含有する可能最小体積（これ以上8以下μL）を堆積させます。それはスフェロイドを形成することができ、それを移動させずに20-30分間ペトリ皿を残し、その後、37℃、5％CO 2インキュベーター中に、16の凝集体を含有するペトリ皿を含む、完全なデバイスを配置します。
- フォームコントロール凝集同じプロトコルに従い、TGF-β3なし軟骨形成培地を完全培地を交換してください。
- 3D集合体構築物を作製するために、8つのダブレットを形成し、融合を開始することを8日目に接触して2骨材を配置します。 11日目に、4つの四つ組を形成する2つのダブレットをマージします。最後に、最終構造を得るために15日目に4つの四つ組を融合。
- 同時に、2.5×10 5を遠心分離することによってフォーム凝集体が260で幹細胞を標識し15; TGF-β3を伴うまたは伴わない軟骨形成培地1.5 mlを15 mLチューブ中で5分間G（サンプルおよびコントロールのための、それぞれ）。
- シード足場を磁気的には、ペトリ皿に各乾燥足場を置きます。プルラン/デキストラン21で作られた多糖類の多孔質足場を使用してください。各足場のために、TGF-β3なし軟骨形成培地350μL中に2×10 6個の標識された幹細胞を希釈し、慎重に足場上に細胞をピペット。
- 足場内で完全細胞侵入を可能にするために37℃で5分間インキュベートし、次いで穏やかにペトリ皿に（試料又はコントロールのため、それぞれ）TGF-β3の有無にかかわらず軟骨形成培地3mlを加えます。
- 足場の孔および閉じ込めを介して細胞の移動を可能にするために、4日間、37℃、5％CO 2での磁気デバイスで細胞化足場をインキュベートします。
- 2×10 6と同時に、シード足場
軟骨細胞への分化4.
注：インキュベーションの4日後、磁石を除去し、ペトリ皿（静的条件）またはバイオリアクター（動的条件）のいずれかで軟骨成熟を続けます。陰性対照サンプルは、TGF-β3なし軟骨形成培地で静的条件下で熟成されます。
- 静的条件では、同一のシャーレに細胞化スカフォールドまたは凝集体を保ちます。 21日間、1週間に2回軟骨形成培地を変更します。
- 動的条件下では、バイオリアクターを準備します。
- 製造業者のプロトコルに従って適切な長さでシリコーンチューブを切断します。
- 500mLの培養チャンバー、チューブ、2ウェイ回転子、及びケージ：すべての材料をオートクレーブ。
- 滅菌microbioにバイオリアクター部品を配置論理的な安全ステーション。製造者の指示に従って2ウェイ回転子に、培養室にチューブを接続します。
- 注意深く滅菌スパチュラを用いて滅菌ケージに細胞化スカフォールドを移します。ケージ当たり2つの足場を置きます。ケージの準備が整ったら、さらに回転中に移動するからそれらを保つために蓋の針に挿入してください。軟骨形成培地で培養室を記入し、ケージを含む蓋を閉じます。
- 軟骨形成培地でチューブを埋めるために蠕動ポンプの電源を入れ、気泡を排除します。
- 配置及びバイオリアクターのモータに充填されたチャンバを固定し、アームのチャンバの両方の回転を制御するコンピュータの電源をオン。
- アームチャンバの両方に毎分5つの回転（RPM）の回転速度を適用します。細胞化スカフォールドの連続供給のために10回転の流量で、蠕動ポンプを調整します。
注：RNA抽出の前に、酵素溶液を用いて足場を消化します。
- 無血清DMEM培地850 mLにプルラナーゼの100μL（40 U / mL）およびデキストラナーゼの50μLた（60mg / ml）を添加することによって酵素溶液1mLを調製します。
- 、無血清DMEM培地で2回足場をすすぐメディアを破棄し、足場あたりの酵素液800μLを加えます。穏やかな撹拌下37°Cで15〜30分間インキュベートします。
- 足場が完全に溶解されたときに、1.5 mLのチューブに細胞を含む溶液を転送する、10分間、300×gで遠心分離、注意深く滅菌1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で2回すすぎ、培地を吸引、遠心分離に300×10分間、G、およびRNA単離溶液で再懸濁細胞。
- 、凝集体からRNAを抽出し、RNA単離溶液にスフェロイドを配置することと完全RNA抽出を行う前に、ホモジナイザーを使用してそれらをつぶします。
- 製造業者の説明書に従って全RNA抽出用キットを用いてRNAを単離します。
- 250 ngのランダムプライマー、dNTP混合物1μL（各10mM）、及び40 U / mLのRNase阻害剤を用いて、製造者の指示に従って逆転写酵素を用いて総RNA 400 ngのから相補的DNAを合成します。反応の最終容量は20μLです。反応の終了時に、100μLの最終体積を得るために、蒸留水80μLを加えます。
- 定量的ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）のために、10倍希釈のcDNAを用いて、そのようなアグリカン（AGC）及びコラーゲンII（COL II）として目的の遺伝子の相対的発現を定量するための蛍光試薬を含むPCRミックスを使用します。参照遺伝子リボソームタンパク質、大、P0（RPLP0）で遺伝子発現のレベルを標準化。 ΔΔCT式- 2で計算を実行、ΔΔCT=ΔCTは、分化状態の場合 - 制御条件のΔCTを意味し、各ΔCTは、目的の遺伝子のCT表す - 参照遺伝子（RPLP0）のCT。
- 平均（SEM）の標準誤差±平均値などの統計的測定値を決定します。 n個の≥2つの独立した実験と解析を行います。遠心分離し、ペレットおよび磁気融合（* P <0.05）との間に統計的差異を分析するためにスチューデントのt検定を使用してください。分化足場の間の制御足場（* P <0.05）と統計的差異を分析するためにクラスカル・ワリス検定（ANOVAは、ノンパラメトリック一方向）で有意性を決定します。
6.組織学的分析
- 滅菌1×PBSで細胞化スカフォールドまたは凝集体をすすぎ、室温で1時間10％ホルマリン溶液でそれらを修正し、1×PBSでリンス。
- PBSを削除し、最適なcuttinでサンプルを埋め込みますG温度化合物（OCT）、及び液体窒素中に浸漬イソペンタン浴でそれらを凍結。 -20°Cでサンプルを保管してください。凝集体または細胞化スカフォールド12ミクロン、8ミクロンの凍結切片を得るために、クライオスタットを用いてサンプルを切断。
- 2分間0.5％トルイジンブルー溶液を用いて凍結切片を染色し、水道水ですすぎ、100％エタノールで脱水し、トルエンを用いて明らかにし、光学顕微鏡用の封入剤でスライドをマウントします。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
まず、凝集体は、個々の幹細胞（ 図2A）を標識した2.5×10 5を堆積することにより微小磁石を用いて形成することができます。これらの単一集合体（サイズ〜0.8ミリメートル）は、より大きな構造にシーケンシャル、磁気的に誘導し融合のおかげで融合させることができます。例えば、軟骨成熟の8日目に、凝集体がダブレットを形成するように対に接触するように配置しました。四つ組は2つのダブレットをマージすることにより、11日目に組み立てました。そして最後に、15日目に、4つの四つ組は、4×10 6個の細胞（〜大きさ4mm）（ 図2B）の合計と、最初に形成された凝集体16を含む3次元構造体を形成するために融合させました。第二に、同じ磁気吸引技術は、足場内の細胞の凝集体を形成するために使用されています。足場は、磁気デバイス上に播種し、正確な微小磁石の位置（ 図2Cにおいて、足場の孔内に密に凝縮した細胞を示しました）。細胞を磁気吸引（受動播種）することなく、足場内に播種したコントラストにより、それらが均等に分散されることが見出されました。細胞化足場は、動的成熟条件（ 図3B）の下で軟骨形成プロセスを実行するために、バイオリアクターチャンバに取り付けられたケージ（ 図3A）に挿入しました。そのようなバイオリアクターは、栄養素およびガス交換を改善し、形質導入によって機械的刺激を提供します。ソフト3D組織再生のためのコンストラクタによって推奨されるようにアームとチャンバの両方の回転速度は、5回転に調整しました。媒体の連続的な供給を提供し、蠕動ポンプを10 RPMに設定しました。
全ての細胞組織の条件（融合凝集体および足場内播種）及び（バイオリアクター内の有無にかかわらず）、組織の成熟のために、遺伝子発現は、25日目に分析した磁気融合によって形成された組織はsigniを示しました。一緒にアグリカン発現の増加傾向と、遠心分離（ 図4A）によって得られたペレットと比較してコラーゲンII発現のficant増加。細胞化スカフォールドのために、我々は、アグリカンおよびコラーゲンII発現の有意コラーゲンII磁性播種磁気力なしで播種足場と比較して、使用されたために増加し得ます。加えて、両方の遺伝子の発現は、磁気シーディングは、動的分化（ 図4B）と組み合わせた場合（COL IIのための重要な）はるかに高かったです。
組織学的分析はまた、グリコサミノグリカン（GAG）を明らかにするためにトルイジンブルー染色を用いて、例えば、実施しました。青紫色（ 図5A）によってevincedとして16の凝集体の連続磁気融合は、GAGの豊富な堆積を示しました。足場のために、のみ磁気トルイジンブルーで染色した播種しました。 GAG conten足場は、バイオリアクター（ 図5B）よりむしろ静的（ 図5C）に分化させたときtは高かったです。まとめると、これらの結果は、軟骨形成を強化するために足場内磁気集約と磁気シーディングの可能性を示します。また、バイオリアクター内の動的な成熟条件がはるかに有利な効率的な分化のためであることを示しています。
磁気デバイスの図1.建設。凝集体形成のための磁気デバイスの（A）例：アルミニウム板（0.8μmの直径の孔）を穿孔し、先端が各穴に挿入した後、飽和磁化を確保永久ネオジム磁石、上に置きました。足場に播種するために（B）磁気デバイス：ハードポリスチレン（24ミリメートル2）9つの手動で行う穴付きました飽和磁化を確保永久ネオジム磁石上に置きました。小さな磁石（直径3mm）は、デバイスを形成するために、各穴に挿入しました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
幹細胞と播種の2磁気標識図。 （A）細胞を37℃で30分間酸化鉄ナノ粒子で標識した幹。 （B）スフェロイドは16微小磁石のネットワークによって引き付け標識された細胞から形成されました。凝集体は、3日前に形成された二重の融合により、11日目に四つ組にマージされました。四つ組は、最終的な設計組織を構築するために15日目に融合させました。 （C）ガラス底の皿に入れ足場は、、又はを播種しました磁力アウト。細胞を均一にすることなく磁石播種足場に分布登場しながら、4日目に、圧縮された幹細胞のスポットは、磁気播種足場で観察されました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
細胞化スキャフォールドの3動的な成熟を図。 （A）は、磁気又は受動播種後、細胞化スカフォールドは、混乱を避けるためにケージに入れました。キャップの針を用いて固定（B）ケージは、軟骨形成培地を充填したバイオリアクターの容器に入れました。バイオリアクターは、独立して制御された速度（1~12 rpmのアームとチャンバ、それぞれのために1-35 RPM）で回転軸を適用しました。連続メディを提供蠕動ポンプええと。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
日25上の特定の軟骨遺伝子の発現図4（A）MSCスフェロイドの磁気的に誘導された融合は、遠心分離により形成されたペレットと比較してコラーゲンIIの有意な増加を示しました。 *スチューデントのt検定（p値<0.05）を使用して、統計的有意差を示しています。 （B）アグリカンおよびコラーゲンIIの発現が明らかに磁気播種およびバイオリアクターにおける動的成熟の組み合わせで分化足場に増加しました。遺伝子発現はRPLP0 mRNAに対して正規化し、対照（〜1±SEM）に対して任意の単位で表しました。結果は、2〜4個の独立した実験の平均±SEMとして提示されています。 *電王クラスカル・ワリス検定（一方向ANOVAノンパラメトリック検定）（p値<0.05）を用いて統計的差をTES。 （ - ）：磁石なしに播種。 （+）：磁力で播種。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
25.グリコサミノグリカン（GAG）堆積物が青紫色の呈色によって証明されている日にグリコサミノグリカンの図5.組織学的染色 。 （A）は 、正のトルイジンブルー染色は16の凝集体のシーケンシャル融合から得られた最終的な軟骨構造の8μmの凍結切片において観察されました。磁気静的（B）の後に播種足場または動的（C）条件の12-μmの凍結切片は、明らかに示しました。そのGAGの内容は、バイオリアクターで分化足場に高かったです。矢印は、分化した細胞の集合体を示しています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ここで紹介するテクニックは、磁性ナノ粒子の内在化に依存しているため、彼らは、細胞内局在したらまず、一つの重要な問題は、ナノ粒子の結果です。鉄ナノ粒子は、それらのサイズ、コーティング、及び露光19の時間に応じて潜在的な毒性または障害分化能力、22をトリガすることができることは事実です。カプセル化された鉄ナノ粒子は、マグネトの形態、生物学的磁性ナノ粒子24で23を使用した、または単純なクエン酸塩コーティング及び適切な濃度18と共に使用した場合しかし、いくつかの研究は、細胞生理に影響を示しませんでした。また、酸化鉄ナノ粒子（MSCとともにおよび軟骨形成のために）この論文に記載されているものと同様の条件で使用した場合、我々は最近実証そのnanopartiの迅速かつほぼ完全分解クレスは、細胞取り込みおよびMSCのスフェロイド形成時に約10日でエンドソーム内で発生します。興味深いことに、この巨大な劣化はフェリチンタンパク質内遊離鉄の効率的なストレージと関連していたし、将来の臨床応用25のためにもボンディング、細胞の鉄代謝に非常に限られた影響が生じました。
もう一つの重要な点は、軟骨形成を開始するために、セルコンパクションの要件です。通常、細胞の凝縮を遠心分離することによって達成されます。しかし、この方法は、細胞の数が少ない（以上2.5×10個の5細胞）によって制限されます。この数を超えて、栄養素やガスが細胞壊死を誘発する、集合体の中央に拡散することはできません。ここで、凝集体にラベルされた幹細胞の磁気凝集は、軟骨組織再生のための3D構造を形成するための重要な方法として表示されます。このような磁気手続きはに他の著者によって使用されてきました3Dスフェロイドを構築：磁場26を局在化するために、細胞23の解離後、または鉄ピンとプレートの上に置かれた磁石を有する磁気浮上。しかし、磁気浮上を集約融合のさらなる段階のために適していることが表示されません。これとは対照的に、ここで提案されている磁気方式で、我々はステップバイステップの軟骨組織の構築を取得するために、すべての融合ステップを制御することができます。手短に言えば、この多段階プロセスは、集合ビルディングブロックへの幹細胞の閉じ込めから始まり、より大きな構造へのこれらのブロックの融合が続きます。この足場フリー幹細胞凝集手順の重要なステップは以下の通りである：最初に、一つ一つが大きい、単一の形成を回避するために、融合手順を制御する必要があり、可能な第二のような細胞のような小容量の各集合体を形成しなければなりません集計。ここで得られた組織は、コラーゲンIIおよびアグリカンに富んでいました。またadvantagを発表しました柔軟な形状およびサイズを有する足場を含まないというES。
磁気アプローチも厚いと大きな足場内に幹細胞を誘導するために使用しました。様々な形や大きさの設計のための別の代替。細胞の全体的な均一な分布を持っているどちらも少なすぎる、また任意のセル損失を避けるためにあまりにも多く：ここに重要なステップは、細胞の適切な音量で足場をシードすることです。磁力は、以前に引き付け、足場内の細胞を保持し、細胞播種27、28を強化するために使用されました。ここで、多糖類の足場の細孔内に十分な細胞結露が成功した軟骨形成につながりました。磁気細胞化スカフォールドは、その二軸回転にバイオリアクターのおかげによって提供される形質導入/せん断応力刺激を行った場合に細胞外マトリックス産生が顕著に向上しました。これは、MUL、他の研究で示されていますTI-軸負荷条件は、軟骨細胞29から形成された組織の品質を向上させます。唯一の圧縮力が30、31、32を適用されている既存の技術と比較した場合、この新しいバイオリアクターの概念は、実際のゲインを提示します。
結論として、軟骨形成分化のために、標識された幹細胞の磁気閉じ込めの使用は、形成及び操作凝集体を、ならびにミリメートルサイズの軟骨細胞構築物の作成のために許可された足場を播種することができます。また、動的な分化に磁気細胞播種を組み合わせることにより、再生医療応用のための貴重な新しいツールを提供します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者は、開示することは何もありません。
Acknowledgments
著者は、バイオリアクターでの彼らの助けのためにQuinXell技術とCellD、特にロサー・グランマンとドミニーク・ゴーズラン確認したいと思います。私たちは、プルラン/デキストラン多糖類の足場を提供してくれキャサリンルヴィサージュを、感謝します。この作品は、欧州連合（ERC-2014-重心プロジェクトマティス648779）によっておよびAgenceNationaledeラRECHERCHE（ANR）、フランス（MagStemプロジェクトANR-11 SVSE5）によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Iron oxide (maghemite) nanoparticules (γ-Fe2O3) | PHENIX - University Paris 6 | Made and given by C. Ménager | Mean diameter of 8.1 nm and negative surface charge |
| Polysaccharide Pullulan/Dextran scaffolds | LIOAD - University Nantes | Made and given by C. Le Visage | Prepared from a 75:25 mixture of pullulan/dextran in alkaline conditions (10 M NaOH). Porosity: 185-205 µm; Thickness: 7 mm; Surface area: 1.8 cm2. |
| TisXell Regeneration System | QuinXell Technologies | QX900-002 | Biaxial bioreactor with 500 mL culture chamber |
| Cage for scaffolds: Histosette II M492 | VWR | 720-0909 | |
| Mesenchymal Stem Cell (MSC) | Lonza | PT-2501 | Three independant batches have been used |
| MSCGM BulletKit medium | Lonza | PT-3001 | For the complete medium, add the provided BulletKit (containing serum, glutamine and antibiotics) to the MSCGM medium |
| DMEM with Glutamax I | Life Technologies | 31966-021 | No sodium pyruvate, no HEPES |
| RPMI medium 1640, no Glutamine | Life Technologies | 31870-025 | No sodium pyruvate, no HEPES |
| PBS w/o CaCl2 w/o MgCl2 | Life Technologies | 14190-094 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25300-054 | |
| Penicillin (10,000 U/mL) / Streptomycin (10,000 µg/mL) | Life Technologies | 15140-122 | |
| ITS Premix Universal Culture Supplement (20x) | Corning | 354352 | |
| Sodium pyruvate solution 100 mM | Sigma | S8636 | |
| L-Ascorbic Acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | Prepare the concentrated solution (25 mM) in distilled water extemporaneously |
| L-Proline | Sigma | P5607 | Prepare the 175 mM stock solution diluted in distilled water and store at 4 °C |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | Prepare the 1 mM stock solution diluted in Ethanol 100% and store at -20 °C |
| TGF-beta 3 protein 10 µg | Interchim | 30R-AT028 | |
| Tri-sodium citrate | VWR | 33615.268 | Prepare the 1 M stock solution diluted in distilled water and store at 4 °C |
| Pullulanase from Bacillus acidopullulyticus | Sigma | P2986 | |
| Dextranase from Chaetomium erraticum | Sigma | D0443 | |
| NucleoSpin RNA Extraction Kit | Macherey-Nagel | 740955.5 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Life Technologies | 18064-014 | |
| Random Primer - Hexamer | Promega | C1181 | 500 µg/mL: Use diluted 1/2 and put 1 µL per sample |
| Recombinant RNAs in ribonuclease inhibitor | Promega | N2511 | 40 U/µL: put 1 µL per sample |
| PCR nucleotide dNTP mix (10 mM each) | Roche | 10842321 | |
| SyBr Green PCR Master Mix | Life Technologies | 4368708 | |
| Step One Plus Real-Time PCR System | Life Technologies | 4381792 | |
| Formalin solution 10% neutral buffered | Sigma | HT5012 | |
| OCT solution | VWR | 361603E | |
| Isopentane | Sigma | M32631 | |
| Toluidine blue O | VWR | 1.15930.0025 | |
| Ethanol absolute | VWR | 20821.310 | |
| Toluene | VWR | 1.08323.1000 | |
| Mounting medium Pertex | Histolab | 840 | |
| RPLP0 Primer for qPCR | Eurogentec | 5'-TGCATCAGTAC CCCATTCTATCAT-3'; 5'-AAGGTGTAATC CGTCTCCACAGA-3' |
|
| Aggrecan Primer for qPCR | Eurogentec | 5'-TCTACCGCTGCGAGGTGAT-3'; 3'-TGTAATGGAACACGATGCCTTT-5' | |
| Collagen II Primer for qPCR | Eurogentec | 5'-ACTGGATTGACCCCAACCAA-3'; 3'-TCCATGTTGCAGAAAACCTTCA-5' |
References
- Naumova, A. V., Modo, M., Moore, A., Murry, C. E., Frank, J. A.
- Edmundson, M., Thanh, N. T., Song, B. Nanoparticles based stem cell tracking in regenerative medicine. Theranostics. 3 (8), 573-582 (2013).
- Di Corato, R., et al. High-resolution cellular MRI: gadolinium and iron oxide nanoparticles for in-depth dual-cell imaging of engineered tissue constructs. ACS Nano. 7 (9), 7500-7512 (2013).
- Xu, F., et al. Three-dimensional magnetic assembly of microscale hydrogels. Adv Mater. 23 (37), 4254-4260 (2011).
- Kito, T., et al. iPS cell sheets created by a novel magnetite tissue engineering method for reparative angiogenesis. Sci Rep. 3, 1418 (2013).
- Mironov, V., Kasyanov, V., Markwald, R. R. Nanotechnology in vascular tissue engineering: from nanoscaffolding towards rapid vessel biofabrication. Trends Biotechnol. 26 (6), 338-344 (2008).
- Mattix, B. M., et al. Janus magnetic cellular spheroids for vascular tissue engineering. Biomaterials. 35 (3), 949-960 (2014).
- Henstock, J., El Haj, A. Controlled mechanotransduction in therapeutic MSCs: can remotely controlled magnetic nanoparticles regenerate bones? Regen Med. 10 (4), 377-380 (2015).
- Fayol, D., et al. Use of magnetic forces to promote stem cell aggregation during differentiation, and cartilage tissue modeling. Adv Mater. 25 (18), 2611-2616 (2013).
- Bartlett, W., et al. Autologous chondrocyte implantation versus matrix-induced autologous chondrocyte implantation for osteochondral defects of the knee: a prospective, randomised study. J Bone Joint Surg Br. 87 (5), 640-645 (2005).
- Batty, L., Dance, S., Bajaj, S., Cole, B. J. Autologous chondrocyte implantation: an overview of technique and outcomes. ANZ J Surg. 81, 18-25 (2011).
- Song, L., Baksh, D., Tuan, R. S. Mesenchymal stem cell-based cartilage tissue engineering: cells, scaffold and biology. Cytotherapy. 6 (6), 596-601 (2004).
- Boeuf, S., Richter, W. Chondrogenesis of mesenchymal stem cells: role of tissue source and inducing factors. Stem Cell Res Ther. 1 (4), 31 (2010).
- Kock, L., van Donkelaar, C. C., Ito, K. Tissue engineering of functional articular cartilage: the current status. Cell Tissue Res. 347 (3), 613-627 (2012).
- Schon, B. S., et al. Validation of a high-throughput microtissue fabrication process for 3D assembly of tissue engineered cartilage constructs. Cell Tissue Res. , (2012).
- Robert, D., et al. Magnetic micro-manipulations to probe the local physical properties of porous scaffolds and to confine stem cells. Biomaterials. 31 (7), 1586-1595 (2010).
- Luciani, N., et al. Successful chondrogenesis within scaffolds, using magnetic stem cell confinement and bioreactor maturation. Acta Biomaterialia. 37, 101-110 (2016).
- Wilhelm, C., Gazeau, F. Universal cell labelling with anionic magnetic nanoparticles. Biomaterials. 29 (22), 3161-3174 (2008).
- Fayol, D., Luciani, N., Lartigue, L., Gazeau, F., Wilhelm, C. Managing magnetic nanoparticle aggregation and cellular uptake: a precondition for efficient stem-cell differentiation and MRI tracking. Adv Healthc Mater. 2 (2), 313-325 (2013).
- Wilhelm, C., Gazeau, F., Bacri, J. C. Magnetophoresis and ferromagnetic resonance of magnetically labeled cells. Eur Biophys J. 31 (2), 118-125 (2002).
- Autissier, A., Le Visage, C., Pouzet, C., Chaubet, F., Letourneur, D. Fabrication of porous polysaccharide-based scaffolds using a combined freeze-drying/cross-linking process. Acta Biomater. 6 (9), 3640-3648 (2010).
- Singh, N., Jenkins, G. J. S., Asadi, R., Doak, S. H. Potential toxicity of superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPION). Nano Reviews. 1, (2010).
- Lee, J. H., Hur, W. Scaffold-free formation of a millimeter-scale multicellular spheroid with an internal cavity from magnetically levitated 3T3 cells that ingested iron oxide-containing microspheres. Biotechnol Bioeng. 111 (5), 1038-1047 (2014).
- Mattix, B., et al. Biological magnetic cellular spheroids as building blocks for tissue engineering. Acta Biomaterialia. 10 (2), 623-629 (2014).
- Mazuel, F., et al. Massive Intracellular Biodegradation of Iron Oxide Nanoparticles Evidenced Magnetically at Single-Endosome and Tissue Levels. ACS Nano. 10 (8), 7627-7638 (2016).
- Kim, J. A., et al. High-throughput generation of spheroids using magnetic nanoparticles for three-dimensional cell culture. Biomaterials. 34 (34), 8555-8563 (2013).
- Shimizu, K., Ito, A., Honda, H. Enhanced cell-seeding into 3D porous scaffolds by use of magnetite nanoparticles. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 77 (2), 265-272 (2006).
- Sensenig, R., Sapir, Y., MacDonald, C., Cohen, S., Polyak, B. Magnetic nanoparticle-based approaches to locally target therapy and enhance tissue regeneration in vivo. Nanomedicine (Lond). 7 (9), 1425-1442 (2012).
- Waldman, S. D., Couto, D. C., Grynpas, M. D., Pilliar, R. M., Kandel, R. A. Multi-axial mechanical stimulation of tissue engineered cartilage: review. Eur Cell Mater. 13, 66-74 (2007).
- Takahashi, I., et al. Compressive force promotes sox9, type II collagen and aggrecan and inhibits IL-1beta expression resulting in chondrogenesis in mouse embryonic limb bud mesenchymal cells. J Cell Sci. 111 (14), 2067-2076 (1998).
- Campbell, J. J., Lee, D. A., Bader, D. L. Dynamic compressive strain influences chondrogenic gene expression in human mesenchymal stem cells. Biorheology. 43, 455-470 (2006).
- Vunjak-Novakovic, G., et al. Bioreactor cultivation conditions modulate the composition and mechanical properties of tissue-engineered cartilage. J Orthop Res. 17 (1), 130-138 (1999).
