Summary
Chondrogenesis מתאי גזע דורש כוונון עדין תנאי התרבות. כאן, אנו מציגים גישה מגנטית עבור עיבוי תאים, צעד חיוני ליזום chondrogenesis. בנוסף, אנו מראים כי התבגרות דינמית בתוך bioreactor חלה גירוי מכאני כדי המבנים הסלולר ומשפרת ייצור תאי מטריקס סחוסים.
Abstract
הנדסת סחוס עדיין מהווה אתגר בשל קשיים ביצירת שתל במבחנה תפקודית דומה רקמות הילידים. גישה בחנה לאחרונה לפיתוח תחליפים אוטולוגי כרוך הבידול של תאי גזע לתוך כונדרוציטים. כדי ליזום chondrogenesis זה, מידה של דחיסה של תאי הגזע נדרש; ומכאן, הראינו את הכדאיות של תאי עיבוי מגנטי, הוא בתוך פיגומים עבים פיגום ללא שימוש במקורות שדה מגנטיים מיניאטורי כמו משיכת תא. גישה מגנטית זה גם שמשה להנחות היתוך צבירה לבנות פיגום ללא, מאורגן, תלת ממדי (3D) רקמות כמה מילימטרים בגודלם. בנוסף בעל גודל משופר, הרקמה הנוצרת על-ידי היתוך מגנטי מונחה הציגה גידול משמעותי בביטוי של קולגן השנייה, ומגמה דומה נצפתה עבור ביטוי aggrecan. כמו סחוס הילידים היה נתון הכוחות tכובע השפיע מבנה 3D שלה, התבגרות דינמית גם בוצעה. Bioreactor המספק גירויים מכאניים שמש לתרבות הפיגומים המגנטיים הזורעים לאורך תקופה של 21 יום. התבגרות Bioreactor השתפרה במידה רבה chondrogenesis לתוך פיגומי cellularized; מטריקס שהושג בתנאים אלה היה עשיר קולגן השני aggrecan. עבודה זו מתארת את הפוטנציאל החדשני של התעבות המגנטית של תאי גזע שכותרתו והתבגרות דינמית בתוך bioreactor לבידול chondrogenic משופר, הוא פיגומי פוליסכריד הפיגום ללא ובתוך.
Introduction
חלקיקים מגנטיים משמשים כבר במרפאת בתור סוכנים בניגוד עבור דימות תהודה מגנטית (MRI), והיישומים הטיפוליים שלהם ולשמור על רחבה. לדוגמא, הוכח לאחרונה כי תאי שכותרתו ניתן להשפיע in vivo באמצעות שדה מגנטי חיצוני ויכולים להיות מופנים ו / או נשמרו אתר מוגדר של השתלה 1, 2, 3. ברפואת רגנרטיבית, הם יכולים לשמש כדי להנדס רקמות מאורגנות במבחנה 4, כוללים כלי דם ברקמה 5, 6, 7, 8 עצם, ואת סחוס 9.
סחוס במפרק שקוע בסביבת avascular, עושה תיקונים של רכיבי מטריקס מוגבלים מאוד כאשר הנזקים להתרחש. מסיבה זו, research מתמקדת כרגע על ההנדסה של החלפות סחוס hyaline שניתן מושתלות באתר הפגם. על מנת לייצר תחליף עצמי, כמה קבוצות מחקר בוחנות את השימוש של כונדרוציטים אוטולוגי כמקור תא 10, 11, בעוד שאחרים מדגישים את היכולת של תאי גזע מזנכימיים (MSC) להתמיין chondrocytes 12, 13. במחקרים קודמים סכמו כאן, בחרנו MSC, כמו דגימת מח העצם שלהם היא פשוטה למדי ואינו דורשת את ההקרבה של כונדרוציטים בריאים, אשר עלולים לאבד פנוטיפ שלהם 14.
מוקדם צעד חיוני כדי ליזום את בידול chondrogenic של תאי גזע הוא ההתעבות שלהם. אגרגטים תא נוצרים בדרך כלל באף אחת צנטריפוגה או micromass תרבות 15; עם זאת, שיטות התעבות האלה neither להציג את הפוטנציאל ליצור צבירי תאים בתוך פיגומים עבים ולא את הפוטנציאל לשלוט ההיתוך של אגרגטים. במאמר זה, אנו מתארים גישה חדשנית עיבוי בתאי גזע באמצעות תיוג MSC מגנטי משיכה מגנטית. טכניקה זו הוכחה כדי ליצור מבני 3D ללא פיגום באמצעות שילוב של אגרגטים אחד עם השני כדי להשיג רקמות סחוס בקנה מידת מילימטר 9. זריעת מגנטי של פיגומים עבים וגדולים גם אפשרה את האפשרות של הגדלת הגודל של הרקמות המהונדסות, עיצוב צורה יותר בקלות שימושית עבור השתלה, ולגוון את הפוטנציאל עבור יישומים קליניים תיקון סחוס. כאן, אנו בפירוט את הפרוטוקול עבור הזריעה המגנטית של MSC לתוך פיגומים נקבוביים מורכבים סוכרים טבעיים, pullulan, פולימרים, פיגומים השתמשו בעבר כדי להגביל תאי גזע 16, 17. בידול Chondrogenic היה finally המבוצעת bioreactor כדי להבטיח מזין רציף דיפוזיה גז לתוך ליבת המטריצה של הפיגומים שנזרעו עם צפיפות גבוהה של תאים. מלבד מתן חומרים מזינים, גורמי גדילה chondrogenic, וגז אל התאים, bioreactor המוצעים גירוי מכני. בסך הכל, הטכנולוגיה המגנטית נהגה להגביל תאי גזע, בשילוב עם התבגרות דינמית bioreactor, יכולה לשפר בידול chondrogenic ניכרה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. בניית התקנים מגנטיים
הערה: המכשירים המשמשים זריעת תאים משתנים בהתאם ליישום (איור 1). כדי ליצור אגרגטים, מספר התאים מוגבל 2.5 × 10 5 / המצרפי, כך העצות המגנטיות חייבות להיות דקות מאוד (750 מיקרומטר קוטר). כדי לזרוע את פיגומי 1.8 סנטימטר 2/7-עבה מ"מ, המגנטים חייבים להיות גדולים יותר (3 מ"מ קוטר) ויבטיחו נדידת תאי הדרך הנקבובית של הפיגום.
- בניית מכשיר עם-מגנטים מיקרו עבור היווצרות המצרפי (איור 1A)
- הפוך-חורים מיקרו עם מקדח 0.8 מ"מ באמצעות צלחות אלומיניום (3 ס"מ קוטר ו 6 מ"מ עובי).
- הכנס קצה מגנטי (750 מיקרומטר קוטר) לתוך כל חור של הצלחת.
- מניחים דיסק זה מעל מגנט ניאודימיום קבע, אשר מבטיח המגנטיזציה רוויה.
- בניית מכשיר זריעת פיגום (
- חותכים פוליסטירן קשה לתוך 2.4 ס"מ 2 ריבועים.
- הכנס 9 מגנטים קטנים (3 מ"מ קוטר, 6 מ"מ ארוך) במרחק שווה על פני שטח של 1.6 ס"מ 2.
- מניחים את המכשיר על פני מגנט ניאודימיום קבע.
2. תיוג תא גזע
הערה: גזע תאים תויגו עם 0.1 מ"מ חלקיקים מגנטיים עבור 30 דק '(2.6 ± 0.2 pg ברזל / תא) כדי ליצור אגרגטים, תוך שהם תויגו עם 0.2 מ"מ חלקיקים מגנטיים עבור 30 דקות (5 ± 0.4 pg ברזל / תא) לזרע פיגומים. ריכוזי ננו-חלקיקים אלו פעמי דגירה שמשו בעבר ופורסם עבור MSC ותאים אחרים 18, 19, וזה כבר נקבע כי חלקיקים השפיעו לא כדאי תא ולא יכולת בידול MSC. מסת הברזל המשולבת על ידי תאי הגזע נמדדה באמצעות יחיד CEll magnetophoresis 19, 20.
- תאי גזע ותרבות המזנכימה האנושי (MSC) במצע גידול תאי גזע mesenchymal שלם (MSCGM) בשעה 37 ° C ו 5% CO 2 עד סמוך למפגש (~ 90%).
- הכן את הפתרון תיוג מגנטי על ידי ערבוב 0.1 או 0.2 מ"מ מגהמיט תחמוצת ברזל מצופה ציטרט (γFe 2 O 3; הליבה: 8 בקוטר ננומטר) במדיום 5A של סרום ללא מקוי שונה במכון ממוריאל פארק רוזוול (RMPI) ללא גלוטמין ו המכיל 5 נתרן ציטרט מ"מ.
- מחק את המדיום, לשטוף את התאים עם המדיום RPMI סרום ללא ללא גלוטמין, ולהוסיף 10 מ"ל של תמיסת הננו-חלקיק תחמוצת ברזל לכל בקבוק תרבות 150 ס"מ 2, נפח המינימלי הנדרש כדי לכסות את כל התאים.
- דגירה של 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO 2 ואז להשליך את הפתרון ננו-חלקיקים. השרייה במשך 5 דקות עם סרום ללא בינוני RPMI ללא גלוטמין כדי להפנים את נאןoparticles עדיין מחוברת הממברנה.
- מחק את המדיום RPMI ולהוסיף 25 מ"ל של מדיום MSCGM מלאה לכל בקבוק. דגירה לילה בשעה 37 ° C ו 5% CO 2.
3. זריעת תאים מגנטית
- טרי להכין את המדיום chondrogenic באמצעות בינוני הנשר Modified של Dulbecco (DMEM) גלוקוז גבוהה עם L- גלוטמין ידי הוספת 50 מיקרומטר L-אסקורבית חומצה 2-פוספט, 0.1 מיקרומטר dexamethasone, 1 מ"מ פירובט נתרן, 0.35 מ"מ L- פרולין, 1% התרבות האוניברסלית תוסף המכיל אינסולין, transferrin האנושי וחומצה selenous (ITS-Premix), ו 10 ng / mL 3 והפיכת צמיחה גורם-בטא (-β3 TGF).
- לנתק את התאים מגנטי באמצעות 8 מ"ל של 0.05%-EDTA טריפסין לכל בקבוק תרבות 150 ס"מ 2 ו צנטריפוגות התאים ניתק ב 260 × g עבור 5 דקות. לשאוב את המדיום ולספור את התאים מושעה מחדש.
- מניחים בצלחת פטרי תרבית תאים תחתית זכוכית (35 מ"מ) על גבי שני המכשירים מגנטי.
- מ'agnetically ליצור אגרגטים, להוסיף 3 מ"ל של מדיום chondrogenic אל צלחת פטרי להפקיד את נפח הקטן בעדינות האפשר (לא יותר מ 8 μL) המכיל 2.5 × 10 5 תאים שכותרתו לכל המצרפי (עד 16 אגרגטים ניתן להפקיד). השאירו את צלחת פטרי במשך 20-30 דקות מבלי להזיז אותו, שמאפשר לו ליצור spheroids, ולאחר מכן למקם את המכשיר שלם, כולל צלחת פטרי המכילה את 16 אגרגטים, לתוך החממה ב 37 ° C ו 5% CO 2.
- אגרגטים מלאה הטופס הבא באותו פרוטוקול ולהחליף המדיום להשלים עם בינוניות chondrogenic ללא TGF-β3.
- כדי ליצור את המבנה המצרפי 3D, למקם 2 אגרגטים במגע ביום 8 כדי ליצור 8 כפילויות וליזום ההיתוך. ביום 11, למזג 2 כפילויות כדי ליצור 4 רביעיות. לבסוף, פתיל 4 רביעיים ביום 15 כדי להשיג את המבנה הסופי.
- במקביל, ליצור אגרגטים על ידי צנטריפוגה 2.5 × 10 5 שכותרתו בתאי גזע ב 26015; g עבור 5 דקות צינורות 15 מ"ל עם 1.5 מ"ל של מדיום chondrogenic עם או בלי TGF-β3 (עבור מדגם ובקרה, בהתאמה).
- כדי מגנטי פיגומי זרע, למקם כל פיגום יבש לתוך צלחת פטרי. השתמש פיגומים פוליסכריד נקבוביים עשויים pullulan / dextran 21. במשך כל פיגום, לדלל 2 × 10 6 בתאי גזע שכותרתו 350 μL של המדיום chondrogenic ללא-β3 TGF ובזהירות פיפטה תאים על הפיגום.
- דגירה של 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, כדי לאפשר חדירה לתא מלא בתוך הפיגום ואז בעדינות להוסיף 3 מ"ל של מדיום chondrogenic עם או בלי-β3 TGF (עבור מדגם או מלאה, בהתאמה) על צלחת פטרי.
- דגירת גרדום cellularized במכשיר המגנטי שלה ב 37 ° C ו 5% CO 2 עבור 4 ימים כדי לאפשר נדידת תאי הדרך הנקבובית פיגום הריתוק.
- במקביל, זרע פיגומים עם 2 × 10 6
בידול 4. אל chondrocytes
הערה: לאחר 4 ימים של דגירה, להסיר את המגנטים ולהמשיך הבשלת chondrogenic או בצלחת פטרי (תנאים סטטי) או בתוך bioreactor (תנאים דינמיים). דגימות בקרה שליליות התבגרו בתנאים סטטיים עם מדיום chondrogenic ללא-β3 TGF.
- בתנאים סטטיים, לשמור על פיגומים או אגרגטים cellularized באותה צלחת פטרי. שינוי המדיום chondrogenic פעמים בשבוע במשך 21 ימים.
- בתנאים דינאמיים, להכין את bioreactor.
- חותך צינורות סיליקון ב באורך המתאים על פי הפרוטוקול של היצרן.
- חיטוי כל החומרים: תא תרבות 500 מיליליטר, צינורות, מסובבי 2-דרך, ואת כלובים.
- מניחים את חלקי bioreactor לתוך microbio סטרילי תחנת בטיחות הגיונית. חבר את הצינורות אל מסובבי 2-way לתא ההתרבות בעקבות הוראות היצרן.
- להעביר בזהירות את הפיגומים cellularized לתוך כלובים מעוקר באמצעות מרית סטרילי. מניחים 2 פיגומים בכל כלוב. כאשר הכלובים מוכנים, להכניס אותם לתוך המחטים של המכסה כדי לשמור אותם לנוע במהלך סיבוב נוסף. ממלא את חדר התרבות עם מדיום chondrogenic ולסגור אותו עם המכסה המכיל את הכלובים.
- הפעל את משאבת peristaltic למלא את הצינורות עם מדיום chondrogenic וכדי לחסל בועות אוויר.
- מניח ולאבטח את הלילה המלאים לתוך המנוע של bioreactor ולהדליק את המחשב, אשר שולט סיבובים הן של הזרוע ובית הנבחרים.
- החלת מהירות סיבוב של 5 סיבובים לדקה (סל"ד) משתי הזרוע ובית הנבחרים. כוון את המשאבה peristaltic בקצב זרימה של 10 סל"ד עבור האכלה רציפה של הפיגומים cellularized.
התחת = "jove_title"> 5. הפקת רנ"א ניתוח ביטוי גנים
הערה: לפני מיצוי RNA, לעכל את הפיגומים עם פתרון אנזימטי.
- הכן 1 מ"ל של פתרון אנזימטי על ידי הוספת 100 μL של pullulanase (40 U / mL) ו 50 μL של dextranase (60 מ"ג / מ"ל) כדי 850 מ"ל של מדיום סרום ללא DMEM.
- יש לשטוף את הפיגומים פעמיים עם מדיום סרום ללא DMEM, להשליך את המדיום, ולהוסיף 800 μL של פתרון אנזימטי לכל הגרדום. דגירה של 15-30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס מתחת תסיסה עדינה.
- כאשר הפיגום נמס לגמרי, להעביר את פתרון המכיל את התאים לצינור 1.5 מ"ל, צנטריפוגות ב g 300 × עבור 10 דקות, בזהירות לשאוב את המדיום, לשטוף פעמיים עם סטרילי 1 × פוספט שנאגרו מלוחים (PBS), צנטריפוגות ב 300 × g עבור 10 דקות, מחדש להשעות את התאים בתמיסת בידוד RNA.
- כדי לחלץ את RNA מן אגרגטים, למקם הספרואידים בפתרון בידוד RNA ולחלוטין למחוץ אותם באמצעות homogenizer לפני ביצוע חילוץ RNA.
- לבודד את RNA באמצעות ערכה להפקת RNA הכוללת על פי הוראות היצרן.
- לסנתז DNA משלים מ 400 ננוגרם של רנ"א הכל באמצעות transcriptase הפוכה על פי הוראות היצרן, באמצעות 250-ng פריימרים אקראיים, 1 μL של תמהיל dNTP (10 מ"מ כל אחד), ו 40 U / mL RNase מעכב; היקף התגובה הסופי הוא 20 μL. בסוף התגובה, להוסיף 80 μL של מים מזוקקים להשיג נפח סופי של 100 μL.
- לקבלת תגובת שרשרת של פולימראז כמותיים (PCR), להשתמש בשילוב PCR המכיל ריאגנט פלורסנט לכמת את הביטוי היחסי של הגנים של עניין, כגון aggrecan (AGC) וקולגן השנייה (Col II), עם 10 × cDNA מדולל. לנרמל את רמות של ביטוי גנים עם חלבון ריבוזומלי גן התייחסות, גדול, P0 (RPLP0). בצע את החישובים עם 2 - נוסחא ΔΔCT, שבו ΔΔCT = ΔCT של מצב מובחן - אומר ΔCT של מצב מלא, וכל ΔCT מייצג את CT של הגן של עניין - CT של גן ההתייחסות (RPLP0).
- לקבוע מדידות סטטיסטיות כמו ערכים ממוצע ± שגיאת התקן של הממוצע (SEM). לבצע את הניתוח עם ניסויים עצמאיים 2 n ≥. השתמש מבחן t לנתח את ההבדלים הסטטיסטיים בין כדורי centrifuged ו בשילובים מגנטיים (* p <0.05). לקבוע את המשמעות עם מבחן Kruskal-Wallis (פרמטרית חד סטרית ANOVA) לנתח הבדלים סטטיסטיים בין פיגומים מבודלים עם הפיגום המלא (* p <0.05).
6. ניתוח היסטולוגית
- יש לשטוף את הפיגומים או אגרגטים cellularized עם 1 סטרילי × PBS, ולתקן אותן בתמיסת פורמלין 10% עבור 1 שעות בטמפרטורת חדר, ולשטוף עם 1 × PBS.
- הסר את PBS, להטביע את הדגימות עוקצות אופטימליהטמפרטורה מתחם G (אוקטובר), ולהקפיא אותם באמבט איזופנטאן שקוע חנקן נוזלי. חנות המדגם ב -20 מעלות צלזיוס. חותך את הדגימות עם cryostat להשיג cryosections 8-מיקרומטר ליחידות או 12 מיקרומטר עבור פיגומי cellularized.
- הכתם cryosections עם פתרון toluidine כחול 0.5% עבור 2 דקות, לשטוף במי ברז, מייבשים עם 100% אתנול, להבהיר באמצעות טולואן, ולעגן את השקופיות עם הרכבה בינונית עבור מיקרוסקופ אור.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ראשית, אגרגטים יכול להיווצר בנפרד באמצעות מיקרו-מגנטים על ידי הפקדת 2.5 × 10 5 תאי גזע שכותרתו (איור 2 א). אגרגטים יחידים אלה (~ 0.8 מ"מ גודל) לאחר מכן ניתן התמזגו לתוך בזכות מבנים גדולים כדי היתוך רציף, מושרה מגנטי. למשל, ביום 8 של התבגרות chondrogenic, אגרגטים הונחו במגע בזוגות כדי ליצור כפילויות; רביעיות הורכבו ביום 11 על ידי מיזוג 2 כפילויות; ולבסוף, ביום 15, 4 רביעיות היו התמזגו ליצור מבנה 3D המכיל 16 של אגרגטים יצרו בתחילה, עם סך של 4 × 10 6 תאים (~ 4 מ"מ גודל) (איור 2B). שנית, באותה טכניקת משיכה מגנטית שמשה ליצור אגרגטים תא בתוך פיגומים. פיגומים היו זורעים מעל המכשיר מגנטי והראה מרוכז בצפיפות התאים בתוך הנקבוביות של הפיגום, במקומות מיקרו-מגנט מדויק (איור 2C). לעומת זאת, כאשר תאים היו זורע בתוך פיגום ללא משיכה מגנטית (זריעה פסיבית), הם נמצאו שיחולקו באופן שווה. פיגומי Cellularized אז הוכנסו לתוך כלובים (איור 3A) מחוברים לתא bioreactor לבצע תהליך chondrogenic בתנאי התבגרות דינמי (איור 3B). כזה bioreactor משפר חילופי מזין וגז ומספק גירוי מכאני על ידי תמרה. מהירות הסיבוב של שני הזרוע ובית הנבחרים הותאם 5 סל"ד, כפי שהומלץ על ידי בנאי לשחזור רקמות 3D רכה. משאבת peristaltic המספקת אספקה רציפה של מדיום נקבעה 10 סל"ד.
במשך כל התנאים של ארגון התא (אגרגטים התמזגו וזריעה בתוך פיגומים) והתבגרות רקמות (בתוך או בלי bioreactor), ביטוי גנים נותח ביום 25. הרקמה הנוצרת על-ידי היתוך מגנטי הראו משמעותיעליית ficant בביטוי קולגן השני לעומת הגלולה מתקבלת על ידי צנטריפוגה (איור 4 א), יחד עם התחזקות מגמה של ביטוי aggrecan. עבור פיגומים cellularized, השגנו גידול aggrecan וקולגן השנייה ביטוי משמעותי עבור קולגן II-כאשר זריעת מגנטי שימש, לעומת הפיגומים זרע בלי כוחות מגנטיים. בנוסף, את הביטוי של גנים שניהם היה הרבה יותר גבוה (משמעותית עבור Col II) כאשר זריעת מגנטי שולבה עם בידול דינמי (איור 4 ב).
ניתוחים היסטולוגית גם בוצעו, למשל באמצעות כתם כחול toluidine לחשוף את glycosaminoglycans (GAG). ההיתוך המגנטי הרציפים של 16 אגרגטים הציג בתצהיר שפע של GAG, כפי שעולה בבירור מן הצבע הכחול-סגול (איור 5 א). עבור פיגומים, רק מגנטית אלו זורעים הוכתמו toluidine כחול. conten GAGt היה גבוה יותר כאשר הפיגומים הובדלו בתוך bioreactor (איור 5) ולא באופן סטטי (איור 5 ג). יחדיו, תוצאות אלה ממחישות את הפוטנציאל של צבירה מגנטית וזריעה מגנטית בתוך פיגומים כדי לשפר chondrogenesis. הוא גם מציין כי תנאי ההבשלה הדינמיים בתוך bioreactor הם הרבה יותר נוח עבור בידול יעיל.
איור 1. בניית התקנים מגנטיים. (א) דוגמא של מכשיר מגנטי עבור היווצרות המצרפי: צלחת האלומיניום נקדחה (0.8 חורי מיקרומטר קוטר) וטיפים הוכנסו בכל חור ולאחר מכן הניח על מגנט ניאודימיום קבע, אשר הבטיח המגנטיזציה רוויה. (ב) מכשיר מגנטי זרע הגרדום: פוליסטירן קשה (24 מ"מ 2) עם 9 חורים ידני עשוי היהדגש על מגנט ניאודימיום קבע, אשר הבטיח המגנטיזציה רוויה. מגנטים קטנים (3 מ"מ קוטר) הוכנסו מכן לתוך כל חור כדי ליצור את המכשיר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. תיוג מגנטי של תאי גזע וזריעה. (א) בתאי גזע תויגו עם חלקיקי תחמוצת ברזל עבור 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. (ב) Spheroids נוצרו מתאי שכותרתו נמשכים על ידי רשת של 16-מגנטים מיקרו. המצרפים מוזגו לתוך quadruplets ביום 11 על ידי היתוך של הכפילויות נוצרו לפני 3 ימים. הרביעייה היו התמזגה אז ביום 15 כדי לבנות את הרקמות מהונדסות הסופיות. (ג) פיגום, להציב לתוך צלחת זכוכית תחתית, היה זרע עם או עםכוחות מגנטיים החוצה. ביום 4, כתמים של תאי גזע דחוסים נצפו הגרדום המגנטי הזרע, בעוד התאים הופיעו מפוזרים באופן אחיד על הפיגום הזורע ללא מגנט. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. הבשלה דינמית של פיגומי cellularized. (א) לאחר זריעת מגנטי או פסיבית, פיגומים cellularized הועברו לכלובים כדי למנוע הפרעה. כלובי (B), הקבוע באמצעות המחטים של הכובע, הונח לתוך הכלי של bioreactor מלא בינוני chondrogenic. Bioreactor להחיל סיבוב biaxial עם מהירות מבוקרת באופן עצמאי (1-12 סל"ד ו 1-35 סל"ד עבור הזרוע ובית הנבחרים, בהתאמה). משאבה peristaltic יינתן כסדרו Mediאממ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
ביטוי איור 4. של גנים ספציפיים chondrogenic ביום 25. (א) היתוך המושרה המגנטי של spheroids MSC הראה עלייה משמעותית קולגן השנייה לעומת הגלולה נוצרה על ידי צנטריפוגה. * מציין הבדל סטטיסטי באמצעות מבחן t (p-value <0.05). (ב) בעת aggrecan וקולגן השנייה הוגדלו בבירור פיגומי בדיל עם שילוב של זריעת מגנטי והתבגרות דינמית בתוך bioreactor. התבטאות גנים הייתה מנורמלת RPLP0 mRNA ומתבטאת ביחס יחידות שרירותיות לשלוט (~ 1 ± SEM). תוצאות מוצגות כאמצעי ± SEM של שניים עד ארבעה ניסויים עצמאיים. * denoTES הבדל סטטיסטי באמצעות מבחן Kruskal-Wallis (מבחן פרמטרית חד סטרי ANOVA) (p-value <0.05). (-): זריעה ללא מגנט; (+): זריעה עם כוחות מגנטיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5. מכתים היסטולוגית של glycosaminoglycans ביום 25. גליקוז (GAG) פיקדונות הם שמעידים צבע כחול-סגול. (א) כתם כחול toluidine החיובית נצפה cryosections 8-מיקרומטר של מבנה הסחוס הסופי המתקבל ההיתוך הרציף של 16 אגרגטים. Cryosections 12 מיקרומטר של פיגומים הזורעים מגנטי לאחר סטטי (B) או דינמיים (ג) תנאים הראה בבירורכי תוכן GAG היה גבוה ב פיגומי בדיל בתוך bioreactor. החצים מצביעים אגרגטים של תאים מובחנים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ראשית, בגלל הטכניקות שהוצגו כאן מסתמכים על ההפנמה של חלקיקים מגנטיים, נושא חשוב אחד הוא תוצאה של חלקיקים ברגע שהם למקם בתוך התאים. נכון חלקיקי ברזל עלולים לגרום לרעילויות פוטנציאל או יכולת בידול לקויה תלוי בגודל, הציפוי שלהם, וזמן חשיפה 19, 22. עם זאת, מספר מחקרים הראו שום השפעה על פיזיולוגיה הסלולר כאשר חלקיקי ברזל כמוסים שמשו 23 בצורת magnetoferritin, ננו-חלקיק מגנטי ביולוגי 24, או שמשו עם ציפוי ציטראט פשוט ריכוזי נאות 18. בנוסף, כאשר חלקיקי תחמוצת ברזל שימשו בתנאים דומים לאלו שתוארו במאמר זה (עם MSC ועבור chondrogenesis), הראינו לאחרונה כי הידרדרות מהירה וכמעט מוחלטת של nanopartiCles מתרחשת בתוך endosomes ב כ 10 ימים על התאגדות הסלולר היווצרות אליפטית MSC. מעניין, שפלה מסיבית זו נקשרה עם האחסון היעיל של הברזל החופשי בתוך החלבון פריטין וביאת השפעה מוגבלת מאוד על המטבוליזם ברזל הסלולר, ומבשרת גם עבור יישומים קליניים בעתיד 25.
עוד נקודה קריטית היא הדרישה של דחיסת תא ליזום chondrogenesis. בדרך כלל, התעבות של תאים מושגת באמצעות צנטריפוגה; שיטה זאת, זו מוגבלת על ידי מספר קטן של תאים (לא יותר מ 2.5 × 10 5 תאים). העבר את המספר הזה, החומרים המזינים והגז לא יכולים לפזר למרכז של אגרגטים, מפעילה נימקת בתא. הנה, העיבוי המגנטי של תאי גזע שכותרתו לתוך אגרגטים מופיע כשיטה משמעותית ליצירת 3D בונה לשחזור רקמות סחוס. הליך כזה מגנטי נוצל בעבר על ידי מחברים אחרים כדילבנות spheroids 3D: על ידי ריחוף מגנטי עם מגנט להציב על גבי הצלחת לאחר הניתוק של תאים 23 או עם סיכות ברזל למקם את השדה המגנטי 26. עם זאת, ריחוף מגנטי אינו נראה מתאים שלבים נוספים של היתוך המצרפי. לעומת זאת, עם השיטה המגנטית מוצעת כאן, אנו יכולים לשלוט בכל צעדי ההיתוך להשיג בניית רקמות צעד-אחרת-צעד סחוס. בקיצור, תהליך רב שלבי זה מתחיל עם הכליאה של תאי גזע לתוך אבני הבניין המצרפי והוא ואחריו היתוך של בלוקים אלה לתוך מבנה גדול. השלבים הקריטיים של הליך צבירת תאי גזע פיגום ללא זה הם כדלקמן: ראשית, יש ליצור אחד המצרפי עם קטן בנפח של תאים ככל האפשר שני, אחד חייב לשלוט צעדי היתוך, כדי למנוע ההיווצרות של יחיד, גדול לְקַבֵּץ. הרקמה שהושגה כאן הייתה עשירה קולגן השני aggrecan. כמו כן הציג את advantages שיש גיאומטריה גמישה בגודל של להיות נטול גרדום.
הגישה המגנטית שמשה גם להנחות תאי גזע בתוך פיגומים עבים וגדולים; חלופה נוספת עבור העיצוב של צורות וגדלים שונים. השלב הקריטי כאן הוא זרע את הפיגומים עם נפח מתאים של תאי: לא מעט מדי כדי להיות חלוקת הומוגנית כוללת של תאים, ולא יותר מדי כדי למנוע אובדן תא. כוחות מגנטיים שמשו בעבר למשוך ולשמר תאים בתוך פיגומים וכדי לשפר תא זריעה 27, 28. הנה, התעבות התא מספיק בתוך הנקבוביות של הפיגומים פוליסכריד הוביל chondrogenesis מוצלח. ייצור תאי מטריקס השתפר במידה ניכרת כאשר פיגומי cellularized המגנטית נחשפו לגירויי מתח התמרה / גזירה שמספקים הודות bioreactor כדי הסיבוב שלה דו-צירי. הוכח במחקרים אחרים כי מולTI-צירי תנאי העמסה שפרו את איכות הרקמות נוצרו chondrocytes 29. קונספט bioreactor רומן מציג רווח אמיתי בהשוואה לטכניקות הקיימות, שבו רק כוחות דחיסה מוחלים 30, 31, 32.
לסיכום, לבידול chondrogenic, השימוש כליאה מגנטית של תאי גזע שכותרתו להקים ולתפעל אגרגטים וכן זרע פיגומים מותר ליצירת מבנים הסלולר סחוס בגודל מילימטר. בנוסף, שילוב זריעת תאים מגנטי עם בידול דינמי מספק כלי חדש בעל ערך עבור יישומים ברפואה רגנרטיבית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות QuinXell טכנולוגיות CellD, במיוחד לותר Grannemann ודומיניק Ghozlan עזרתם עם bioreactor. אנו מודים קתרין Le Visage, אשר סיפק לנו את הפיגומים פוליסכריד pullulan / dextran. עבודה זו נתמכה על ידי האיחוד האירופי (ERC-2014-Cog פרויקט מאטיס 648,779) ועל ידי AgenceNationalede la משוכלל ונדיר (ANR), צרפת (פרויקט MagStem ANR-11 SVSE5).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Iron oxide (maghemite) nanoparticules (γ-Fe2O3) | PHENIX - University Paris 6 | Made and given by C. Ménager | Mean diameter of 8.1 nm and negative surface charge |
| Polysaccharide Pullulan/Dextran scaffolds | LIOAD - University Nantes | Made and given by C. Le Visage | Prepared from a 75:25 mixture of pullulan/dextran in alkaline conditions (10 M NaOH). Porosity: 185-205 µm; Thickness: 7 mm; Surface area: 1.8 cm2. |
| TisXell Regeneration System | QuinXell Technologies | QX900-002 | Biaxial bioreactor with 500 mL culture chamber |
| Cage for scaffolds: Histosette II M492 | VWR | 720-0909 | |
| Mesenchymal Stem Cell (MSC) | Lonza | PT-2501 | Three independant batches have been used |
| MSCGM BulletKit medium | Lonza | PT-3001 | For the complete medium, add the provided BulletKit (containing serum, glutamine and antibiotics) to the MSCGM medium |
| DMEM with Glutamax I | Life Technologies | 31966-021 | No sodium pyruvate, no HEPES |
| RPMI medium 1640, no Glutamine | Life Technologies | 31870-025 | No sodium pyruvate, no HEPES |
| PBS w/o CaCl2 w/o MgCl2 | Life Technologies | 14190-094 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25300-054 | |
| Penicillin (10,000 U/mL) / Streptomycin (10,000 µg/mL) | Life Technologies | 15140-122 | |
| ITS Premix Universal Culture Supplement (20x) | Corning | 354352 | |
| Sodium pyruvate solution 100 mM | Sigma | S8636 | |
| L-Ascorbic Acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | Prepare the concentrated solution (25 mM) in distilled water extemporaneously |
| L-Proline | Sigma | P5607 | Prepare the 175 mM stock solution diluted in distilled water and store at 4 °C |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | Prepare the 1 mM stock solution diluted in Ethanol 100% and store at -20 °C |
| TGF-beta 3 protein 10 µg | Interchim | 30R-AT028 | |
| Tri-sodium citrate | VWR | 33615.268 | Prepare the 1 M stock solution diluted in distilled water and store at 4 °C |
| Pullulanase from Bacillus acidopullulyticus | Sigma | P2986 | |
| Dextranase from Chaetomium erraticum | Sigma | D0443 | |
| NucleoSpin RNA Extraction Kit | Macherey-Nagel | 740955.5 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Life Technologies | 18064-014 | |
| Random Primer - Hexamer | Promega | C1181 | 500 µg/mL: Use diluted 1/2 and put 1 µL per sample |
| Recombinant RNAs in ribonuclease inhibitor | Promega | N2511 | 40 U/µL: put 1 µL per sample |
| PCR nucleotide dNTP mix (10 mM each) | Roche | 10842321 | |
| SyBr Green PCR Master Mix | Life Technologies | 4368708 | |
| Step One Plus Real-Time PCR System | Life Technologies | 4381792 | |
| Formalin solution 10% neutral buffered | Sigma | HT5012 | |
| OCT solution | VWR | 361603E | |
| Isopentane | Sigma | M32631 | |
| Toluidine blue O | VWR | 1.15930.0025 | |
| Ethanol absolute | VWR | 20821.310 | |
| Toluene | VWR | 1.08323.1000 | |
| Mounting medium Pertex | Histolab | 840 | |
| RPLP0 Primer for qPCR | Eurogentec | 5'-TGCATCAGTAC CCCATTCTATCAT-3'; 5'-AAGGTGTAATC CGTCTCCACAGA-3' |
|
| Aggrecan Primer for qPCR | Eurogentec | 5'-TCTACCGCTGCGAGGTGAT-3'; 3'-TGTAATGGAACACGATGCCTTT-5' | |
| Collagen II Primer for qPCR | Eurogentec | 5'-ACTGGATTGACCCCAACCAA-3'; 3'-TCCATGTTGCAGAAAACCTTCA-5' |
References
- Naumova, A. V., Modo, M., Moore, A., Murry, C. E., Frank, J. A.
- Edmundson, M., Thanh, N. T., Song, B. Nanoparticles based stem cell tracking in regenerative medicine. Theranostics. 3 (8), 573-582 (2013).
- Di Corato, R., et al. High-resolution cellular MRI: gadolinium and iron oxide nanoparticles for in-depth dual-cell imaging of engineered tissue constructs. ACS Nano. 7 (9), 7500-7512 (2013).
- Xu, F., et al. Three-dimensional magnetic assembly of microscale hydrogels. Adv Mater. 23 (37), 4254-4260 (2011).
- Kito, T., et al. iPS cell sheets created by a novel magnetite tissue engineering method for reparative angiogenesis. Sci Rep. 3, 1418 (2013).
- Mironov, V., Kasyanov, V., Markwald, R. R. Nanotechnology in vascular tissue engineering: from nanoscaffolding towards rapid vessel biofabrication. Trends Biotechnol. 26 (6), 338-344 (2008).
- Mattix, B. M., et al. Janus magnetic cellular spheroids for vascular tissue engineering. Biomaterials. 35 (3), 949-960 (2014).
- Henstock, J., El Haj, A. Controlled mechanotransduction in therapeutic MSCs: can remotely controlled magnetic nanoparticles regenerate bones? Regen Med. 10 (4), 377-380 (2015).
- Fayol, D., et al. Use of magnetic forces to promote stem cell aggregation during differentiation, and cartilage tissue modeling. Adv Mater. 25 (18), 2611-2616 (2013).
- Bartlett, W., et al. Autologous chondrocyte implantation versus matrix-induced autologous chondrocyte implantation for osteochondral defects of the knee: a prospective, randomised study. J Bone Joint Surg Br. 87 (5), 640-645 (2005).
- Batty, L., Dance, S., Bajaj, S., Cole, B. J. Autologous chondrocyte implantation: an overview of technique and outcomes. ANZ J Surg. 81, 18-25 (2011).
- Song, L., Baksh, D., Tuan, R. S. Mesenchymal stem cell-based cartilage tissue engineering: cells, scaffold and biology. Cytotherapy. 6 (6), 596-601 (2004).
- Boeuf, S., Richter, W. Chondrogenesis of mesenchymal stem cells: role of tissue source and inducing factors. Stem Cell Res Ther. 1 (4), 31 (2010).
- Kock, L., van Donkelaar, C. C., Ito, K. Tissue engineering of functional articular cartilage: the current status. Cell Tissue Res. 347 (3), 613-627 (2012).
- Schon, B. S., et al. Validation of a high-throughput microtissue fabrication process for 3D assembly of tissue engineered cartilage constructs. Cell Tissue Res. , (2012).
- Robert, D., et al. Magnetic micro-manipulations to probe the local physical properties of porous scaffolds and to confine stem cells. Biomaterials. 31 (7), 1586-1595 (2010).
- Luciani, N., et al. Successful chondrogenesis within scaffolds, using magnetic stem cell confinement and bioreactor maturation. Acta Biomaterialia. 37, 101-110 (2016).
- Wilhelm, C., Gazeau, F. Universal cell labelling with anionic magnetic nanoparticles. Biomaterials. 29 (22), 3161-3174 (2008).
- Fayol, D., Luciani, N., Lartigue, L., Gazeau, F., Wilhelm, C. Managing magnetic nanoparticle aggregation and cellular uptake: a precondition for efficient stem-cell differentiation and MRI tracking. Adv Healthc Mater. 2 (2), 313-325 (2013).
- Wilhelm, C., Gazeau, F., Bacri, J. C. Magnetophoresis and ferromagnetic resonance of magnetically labeled cells. Eur Biophys J. 31 (2), 118-125 (2002).
- Autissier, A., Le Visage, C., Pouzet, C., Chaubet, F., Letourneur, D. Fabrication of porous polysaccharide-based scaffolds using a combined freeze-drying/cross-linking process. Acta Biomater. 6 (9), 3640-3648 (2010).
- Singh, N., Jenkins, G. J. S., Asadi, R., Doak, S. H. Potential toxicity of superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPION). Nano Reviews. 1, (2010).
- Lee, J. H., Hur, W. Scaffold-free formation of a millimeter-scale multicellular spheroid with an internal cavity from magnetically levitated 3T3 cells that ingested iron oxide-containing microspheres. Biotechnol Bioeng. 111 (5), 1038-1047 (2014).
- Mattix, B., et al. Biological magnetic cellular spheroids as building blocks for tissue engineering. Acta Biomaterialia. 10 (2), 623-629 (2014).
- Mazuel, F., et al. Massive Intracellular Biodegradation of Iron Oxide Nanoparticles Evidenced Magnetically at Single-Endosome and Tissue Levels. ACS Nano. 10 (8), 7627-7638 (2016).
- Kim, J. A., et al. High-throughput generation of spheroids using magnetic nanoparticles for three-dimensional cell culture. Biomaterials. 34 (34), 8555-8563 (2013).
- Shimizu, K., Ito, A., Honda, H. Enhanced cell-seeding into 3D porous scaffolds by use of magnetite nanoparticles. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 77 (2), 265-272 (2006).
- Sensenig, R., Sapir, Y., MacDonald, C., Cohen, S., Polyak, B. Magnetic nanoparticle-based approaches to locally target therapy and enhance tissue regeneration in vivo. Nanomedicine (Lond). 7 (9), 1425-1442 (2012).
- Waldman, S. D., Couto, D. C., Grynpas, M. D., Pilliar, R. M., Kandel, R. A. Multi-axial mechanical stimulation of tissue engineered cartilage: review. Eur Cell Mater. 13, 66-74 (2007).
- Takahashi, I., et al. Compressive force promotes sox9, type II collagen and aggrecan and inhibits IL-1beta expression resulting in chondrogenesis in mouse embryonic limb bud mesenchymal cells. J Cell Sci. 111 (14), 2067-2076 (1998).
- Campbell, J. J., Lee, D. A., Bader, D. L. Dynamic compressive strain influences chondrogenic gene expression in human mesenchymal stem cells. Biorheology. 43, 455-470 (2006).
- Vunjak-Novakovic, G., et al. Bioreactor cultivation conditions modulate the composition and mechanical properties of tissue-engineered cartilage. J Orthop Res. 17 (1), 130-138 (1999).
