MALDI इमेजिंग मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए चूहा मस्तिष्क के ऊतकों में जांच और gangliosides के दृश्य के लिए दान मैट्रिक्स की उच्च बनाने की क्रिया
Summary
A protocol for the sublimation of DAN matrix onto rat brain tissue for the detection of gangliosides using MALDI Imaging Mass Spectrometry is presented.
Abstract
नमूना तैयार इष्टतम का पता लगाने और मैट्रिक्स की मदद से desorption लेजर / आयनीकरण (MALDI) इमेजिंग मास स्पेक्ट्रोमेट्री (आईएमएस) प्रयोगों में analytes के दृश्य के लिए महत्वपूर्ण है। उचित प्रोटोकॉल का निर्धारण नमूना तैयार करने की प्रक्रिया के दौरान पालन करने के लिए मुश्किल हो सकता है के रूप में हर कदम ब्याज की analytes की अद्वितीय विशेषताओं के साथ पालन करने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए। यह प्रक्रिया केवल एक संगत मैट्रिक्स है कि desorb और कुशलता से ब्याज के अणुओं योण सकते हैं खोजने नहीं शामिल है, लेकिन यह भी उचित मैट्रिक्स बयान तकनीक का चयन। उदाहरण के लिए, एक गीला मैट्रिक्स बयान तकनीक है, जो विलायक में एक मैट्रिक्स भंग जरूरत पर जोर देता है, सबसे अधिक प्रोटीन और पेप्टाइड्स के desorption के लिए बेहतर है, जबकि सूखी मैट्रिक्स बयान तकनीक लिपिड के आयनीकरण लिए विशेष रूप से प्रभावी हैं। उच्च बनाने की क्रिया homogenei के कारण MALDI आईएमएस द्वारा ऊतकों में लिपिड का पता लगाने के लिए सूखी मैट्रिक्स बयान के एक अत्यंत कुशल पद्धति के रूप में सूचित किया गया हैमैट्रिक्स क्रिस्टल बयान और कम से कम analyte delocalization की Ty कई गीला बयान तरीकों 1, 2 की तुलना में। मोटे तौर पर, यह नमूने एक ठंडी सतह के खिलाफ दबाया के साथ एक निर्वात सील कक्ष में एक नमूना और पाउडर मैट्रिक्स रखने शामिल है। तंत्र तो, एक गर्म स्नान (रेत या तेल) में उतारा कूल्ड ऊतक का नमूना की सतह पर पाउडर मैट्रिक्स के उच्च बनाने की क्रिया में जिसके परिणामस्वरूप है। यहाँ हम पता लगाने और MALDI आईएमएस का उपयोग कर चूहे के मस्तिष्क में gangliosides के दृश्य के लिए 1,5-diaminonaphthalene (दान) मैट्रिक्स का उपयोग कर एक उच्च बनाने की क्रिया प्रोटोकॉल का वर्णन।
Introduction
मैट्रिक्स की मदद से desorption लेजर / आयनीकरण (MALDI) इमेजिंग मास स्पेक्ट्रोमेट्री (आईएमएस) बनता जा रहा है एक अत्यधिक मांग के पार बरकरार नमूना सतहों लिपिड, पेप्टाइड्स और प्रोटीन के स्थानिक वितरण के दृश्य के लिए तकनीक के बाद। MALDI आईएमएस पहले पूर्व शुद्ध analytes के लिए एक विश्लेषणात्मक तकनीक के रूप में जाना जाता था, लेकिन हाल के वर्षों में, यह क्योंकि बिना उच्च संकल्प दृश्य / शारीरिक संदर्भ अंक के साथ मास स्पेक्ट्रोमेट्री की सटीकता गठबंधन करने की क्षमता के कई अन्य विषयों में ध्यान आकर्षित किया गया है किसी भी बाहरी लेबलिंग के लिए की जरूरत है। इस तकनीक के उपयोग के शोधकर्ताओं के वैज्ञानिक पूल विकसित करने के लिए जारी है, वहां विकास और आईएमएस प्रयोगों के अनुकूलन में सहायता करने के लिए मानकीकृत, आसान करने के लिए अनुवर्ती प्रोटोकॉल के लिए की जरूरत बढ़ जाती है। Gangliosides, झिल्ली लिपिड केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में अत्यधिक प्रचुर मात्रा का एक समूह है, उनके स्थान, झिल्ली के भीतर एम्बेडेड के रूप में MALDI आईएमएस प्रयोगों के लिए आदर्श होते हैं, कुछ विशिष्ट बनाता हैपारंपरिक इम्यूनो-लेबलिंग का उपयोग कर पता लगाने के लिए असंभव तों। इसके अतिरिक्त, हम पता चला है, MALDI आईएमएस का उपयोग कर, कि इन लिपिड, जो सेल संकेत के रूप में कार्य modulators, अन्य बातों के अलावा, स्वस्थ मस्तिष्क कृंतक कि मस्तिष्क की चोट के 3, 4, 5 के बाद बदल रहे हैं आप में अनूठा शारीरिक वितरण पैटर्न है। Gangliosides सबसे लिपिड प्रजातियों की तुलना में एक उच्च बड़े पैमाने पर सीमा पर स्थित है, और इस प्रकार MALDI इमेजिंग मंच करने के लिए सबसे उपयुक्त हैं।
चित्रा 1: MALDI आईएमएस प्रयोग की कार्यप्रवाह। उच्च बनाने की क्रिया का उपयोग कर एक MALDI आईएमएस प्रयोग के सामान्य कार्यप्रवाह का आरेख। -80 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए ऊतक एक cryostat में sectioned है और 10 माइक्रोन वर्गों पिघलना प्रवाहकीय आईटीओ स्लाइड पर मुहिम शुरू कर रहे हैं। स्लाइड तो उच्च बनाने की क्रिया जब तक Desiccator में रखा गया है। SLIdes बनाने की क्रिया तंत्र में डाला जाता है और एक भी मैट्रिक्स की परत ऊतक का नमूना की सतह के लिए लागू किया जाता है। नमूने एक -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर तो 10 मिनट के लिए एक desiccator में रखा में रात भर जमे हुए हैं। एक बार मानकों लागू किया गया है, नमूने जहां एक लेजर ऊतक मैट्रिक्स योण बनाना में desorbed अणुओं के कारण भर में निर्देश दिया है MALDI साधन में डाला जाता है। आयनों एक उड़ान ट्यूब और अलग उनके द्रव्यमान (समय की उड़ान / TOF) के आधार पर जब तक वे डिटेक्टर तक पहुँचने के नीचे यात्रा करते हैं। एक पूर्व निर्धारित बड़े पैमाने पर करने के लिए प्रभारी (मी / z) सीमा के भीतर analytes की आयनिक बहुतायत के बारे में जानकारी दोनों एक आणविक छवि और जन स्पेक्ट्रम के रूप में प्रदर्शित किया जाता है। इस डेटा दोनों कल्पना और imaged ऊतक के भीतर ब्याज की analyte की आयनिक बहुतायत मात्रा ठहराना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
नमूना तैयार करनाMALDI आईएमएस के लिए अत्यधिक चर के रूप में प्रक्रिया के प्रत्येक चरण ब्याज की analytes करने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए। MALDI आधारित प्रयोगों के निर्णायक सुविधा एक मैट्रिक्स कोटिंग नमूना की सतह विश्लेषण करने से पहले पर जमा का उपयोग है। अवशोषित और पृथक प्रक्रिया के दौरान लेजर से विकिरण ऊर्जा के हस्तांतरण की भूमिका के अलावा, मैट्रिक्स भी नमूने से विभिन्न analytes को अलग-थलग करने की है, जिससे ब्याज 6, 7 के यौगिकों के विश्लेषण की सुविधा में कार्य करता है। नमूना की सतह के लिए मैट्रिक्स के समरूप आवेदन नमूना तैयार करने की प्रक्रिया में सबसे महत्वपूर्ण कदम है। अनुचित मैट्रिक्स बयान बड़ी विषम मैट्रिक्स क्रिस्टल संरचनाओं और कलाकृतियों के विकास, कम आयन संकेत है, और गरीब reproducibility 7 के लिए नेतृत्व कर सकते हैं।
कर सकते हैं कारण कुछ matrices की आत्मीयता विशिष्ट analytes को अलग करने के लिए, मैट्रिक्स के प्रकार के एक प्रयोग के लिए चुनाकाफी परिणाम बदल। प्रोटीन और पेप्टाइड्स की इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया matrices अक्सर इमेजिंग लिपिड के लिए इस्तेमाल किया उन लोगों से अलग है और इस प्रक्रिया आगे इस तरह के आदेश को सफलतापूर्वक ऊतक से संकेतों का पता लगाने के लिए कपड़े धोने और पुनर्जलीकरण कदम के रूप में अतिरिक्त प्रक्रियाओं के लिए जरूरत से जटिल है। हालांकि धोने कदम लिपिड संकेतों 8 को बढ़ाने के लिए मौजूद हैं, वे सबसे लिपिड प्रजातियों का पता लगाने के लिए एक शर्त नहीं हैं। जब एक लिपिड इमेजिंग प्रयोग के लिए एक मैट्रिक्स का चयन, यह इस रूप में ब्याज की लिपिड के polarity विचार करने के लिए उपयुक्त matrices की सीमा संकीर्ण जाएगा महत्वपूर्ण है। उदाहरण के लिए, gangliosides सियालिक एसिड के अवशेष है जो उन्हें एक समग्र नकारात्मक polarity देने होते हैं। प्रभावी ढंग से desorb और ऊतकों से gangliosides योण सकते हैं कि matrices के एक नंबर रहे हैं; हालांकि, इस तरह के स्पेक्ट्रम और वैक्यूम के अंतर्गत मैट्रिक्स की स्थिरता में मैट्रिक्स व्युत्पन्न चोटियों के रूप में कारकों को ध्यान में रखा जाना चाहिए। 1,5-diaminonapthalene (डीएक) मैट्रिक्स इमेजिंग अनुप्रयोगों के बहुमत के लिए साधन निर्वात की स्थिति के तहत पर्याप्त रूप से स्थिर है और लिपिड desorption के लिए संवेदनशीलता के एक उच्च डिग्री का प्रदर्शन किया है और दोनों सकारात्मक और नकारात्मक आयन मोड 2 में लिपिड के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। दान मैट्रिक्स, जब इस तरह के dihydroxybenzoic एसिड (DHB), 9-aminoacridine (9-एए), और 5-क्लोरो-2-mercaptobenzothiazole (CMBT) के रूप में अन्य नकारात्मक लिपिड आत्मीयता के matrices की तुलना में सबसे अधिक कुशलता से चूहे के मस्तिष्क से gangliosides desorb करने में सक्षम था नकारात्मक आयन मोड (तैयारी में पांडुलिपि) में ऊतक।
मैट्रिक्स बयान की उचित विधि का चयन बराबर महत्व के मैट्रिक्स में ही चयन करने के लिए है। गीले मैट्रिक्स बयान तरीकों जिसमें ठोस मैट्रिक्स एक कार्बनिक विलायक में भंग कर रहा है, और साँस द्वारा जमा या स्वचालित स्प्रेयर या स्पॉटर, प्रोटीन और पेप्टाइड्स के desorption के लिए विशेष रूप से प्रभावी रूप में तरल नमूना अतिरिक्त के लिए अनुमति देने के लिए व्याप्त हैंयौगिकों और मैट्रिक्स के साथ सह-क्रिस्टलीकरण की ction। इन तकनीकों में भी लिपिड अनुप्रयोगों, analyte delocalization और असमान मैट्रिक्स क्रिस्टल संरचनाओं के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, हालांकि सॉल्वैंट्स में उच्च बहुतायत और लिपिड की घुलनशीलता के कारण आम घटनाओं, विशेष रूप से ऊतक 2, 9 में हैं। क्योंकि लिपिड आसानी से ऊतक से आयनित कर रहे हैं, इस तरह के उच्च बनाने की क्रिया के रूप में सूखी मैट्रिक्स बयान तकनीक, एक सरल, लागत प्रभावी विकल्प स्प्रेयर के लिए इन तकनीकों का दोष के कई circumventing जबकि पेशकश करते हैं। MALDI आईएमएस प्रयोगों में उच्च बनाने की क्रिया की सफलता गीला मैट्रिक्स तकनीक 1, 10 की तुलना में वृद्धि हुई reproducibility के लिए अग्रणी ऐसे माइक्रोक्रिस्टलाइन मैट्रिक्स आकृति विज्ञान जो बाध्यकारी मैट्रिक्स-analyte के लिए सतह क्षेत्र बढ़ जाती है, बढ़ मैट्रिक्स पवित्रता, और समरूप मैट्रिक्स बयान के रूप में सुविधाओं को जिम्मेदार ठहराया है।
उच्च बनाने की क्रिया invoएक ठंडा नमूना की सतह पाउडर मैट्रिक्स ऊतक का नमूना की सतह पर बयान के बाद की गैस चरण संक्रमण के लिए ठोस है, जिसके परिणामस्वरूप तुरंत नीचे वैक्यूम के अंतर्गत एक पाउडर मैट्रिक्स हीटिंग lves। उच्च बनाने की क्रिया के दौरान, मैट्रिक्स बयान ऐसे समय, तापमान और अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्रदान करने के दबाव के रूप में अलग-अलग कारकों से नियंत्रित किया जा सकता है। एक भी उच्च बनाने की क्रिया प्रयोग से चयनित मैट्रिक्स के प्रकार, कई बार फिर से इस्तेमाल किया जा सकता है, जो निपटान से पहले के आधार पर 5 से 20 मिनट के लिए कहीं भी ले जा सकते हैं। उपकरण स्वचालित स्प्रेयर की कीमत का एक अंश में व्यावसायिक रूप से खरीदा जा सकता है और आसानी से साफ सफाई और रखरखाव के लिए अलग से लिया जाता है। कम लागत और इस मैट्रिक्स बयान तकनीक के रिश्तेदार सादगी यह शुरुआत या MALDI आईएमएस में लिपिड इमेजिंग अनुप्रयोगों पर विस्तार शोधकर्ताओं के लिए आदर्श बनाते हैं। हालांकि आईएमएस के लिए ऊतकों की उच्च बनाने की क्रिया के लिए प्रोटोकॉल का ब्यौरा जानकारी 11 सूचित किया गया है, कुछ मानकीकृत प्रोटोकॉल डब्ल्यू मौजूदhich बुनियादी नकारात्मक आयन मोड में बड़े पैमाने पर उच्च लिपिड इमेजिंग के लिए एक उच्च बनाने की क्रिया प्रयोग से बाहर ले जाने, यह मुश्किल व्यापक परीक्षण और त्रुटि के बिना तकनीक स्थापित करने के लिए बनाने के साथ शामिल कार्यप्रवाह पर ध्यान केंद्रित। निम्नलिखित एक प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल उच्च संकल्प इमेजिंग और gangliosides का पता लगाने के लिए चूहे के मस्तिष्क वर्गों पर दान मैट्रिक्स के उच्च बनाने की क्रिया के लिए इस जगह को भरने के लिए लक्ष्य है।
चित्रा 2: बनाने की क्रिया उपकरण। फोटोग्राफ (ए) और उच्च बनाने की क्रिया तंत्र के योजनाबद्ध आरेख (बी)। वैक्यूम पंप एक ठंडा इथेनॉल के 300 एमएल के साथ भरा फंसाने के लिए रबर टयूबिंग से जुड़ा हुआ है। ठंड जाल तो उच्च बनाने की क्रिया तंत्र के लिए रबर टयूबिंग से जुड़ा हुआ है। तंत्र के बने पदार्थ के दो अलग-अलग टुकड़ों है कि एक धातु यू के साथ मिलकर संयुक्त सील कर रहे हैं से बना है। sublimator के शीर्ष आधाकंडेनसर जो बर्फ कीचड़ से भर जाता है शामिल हैं। नमूना प्लेट संघनित्र के तल पर टेप है, मोहरबंद ग्लास तंत्र के अंदर। उच्च बनाने की क्रिया तंत्र के नीचे आधा दान मैट्रिक्स, बाहर फैल समान रूप से नमूना थाली का सामना करना पड़ में शामिल है। उच्च बनाने की क्रिया के दौरान, कांच के उपकरण 140 डिग्री सेल्सियस तक गर्म एक रेत स्नान सीधे नीचे एक गर्म थाली द्वारा पर रखा गया है। तापमान जांच के लिए एक स्थिर प्रयोग के लिए पूर्व निर्धारित तापमान की तुलना में रेत स्नान तापमान की प्रतिक्रिया के माध्यम से उच्च बनाने की क्रिया प्रयोग के दौरान तापमान को बनाए रखने में मदद करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह काम एक मानकीकृत ऐसे gangliosides के रूप में नकारात्मक आरोप लगाया लिपिड, MALDI आईएमएस प्रयोगों में, का पता लगाने के लिए ऊतक पर मैट्रिक्स बनाने की क्रिया के प्रोटोकॉल का विवरण। MALDI आईएमएस के लिए नमूना तैयार अत्यधि?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to acknowledge the technical assistance of Kristina Jurcic in the University of Western Ontario MALDI MS facility, as well as the National Sciences and Engineering Council (NSERC) for funding this work. The authors would also like to acknowledge the Caprioli group (Vanderbilt University, TN) and Chaurand group (Université de Montreal, QC) for their advice in optimizing the sublimation technique presented in this manuscript.
Materials
| Sublimator | Chemglass Life Sciences | CG3038-01 | |
| 1,5- Diaminonapthalene (DAN) matrix | Sigma-Aldrich | D21200 | 100 G |
| Cryostat | Thermo-Fisher Scientific | CryoStar NX50 | |
| Hot plate with temperature feedback | Thermo-Fisher Scientific | HP88857290 | Isotemp ADVD 7×7 HP 100-120v |
| Stainless Steel Jack | Thermo-Fisher Scientific | 2216479 | 10×10 |
| Cold Trap | Custom built on site | ||
| Vacuum Pump | Franklin Electric | 1102180403 | Savant VP100 Two Stage |
| Indium-tin-oxide (ITO) Slides | Hudson Surface Technology | PSI 1111000 | type II, 1.1mm/25 each |
| MALDI TOF/TOF 5800 Instrument | AB Sciex | ||
| Desiccator | Sigma-Aldrich | D2797 | tabletop desiccator |
References
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