Mikrofluidapparat Flow Afdeling Model for trombocytinfusion og Hæmostase Måler blodpladeaflejring og fibrindannelse i realtid

Summary

Dette papir beskriver en eksperimentel model for hæmostase, der samtidig måler trombocytfunktionen og koagulering. Blodplade- og fibrin fluorescens måles i realtid, og blodpladeadhæsion sats, koagulation sats, og indtræden af ​​koagulering bestemmes. Modellen anvendes til at bestemme blodplade prokoagulerende egenskaber under strømning i koncentrater til transfusion.

Abstract

Mikrofluide modeller af hæmostase vurdere blodpladefunktion under betingelser med hydrodynamisk forskydning, men i nærvær af antikoagulantia, er denne analyse begrænset til kun blodpladeaflejring. Den indviklede forhold mellem Ca2 ⁺ -afhængig koagulation og trombocytfunktionen kræver omhyggelig og kontrolleret rekalcifikationstid af blod før analyse. Vores setup anvender en Y-formet blanding kanal, der leverer koncentreret Ca2 ⁺ / Mg2 ⁺ buffer til strømmende blod lige før perfusion, hvilket muliggør hurtig rekalcifikationstid uden prøve stasis. En ti-fold forskel i strømningshastighed mellem begge reservoirer minimerer fortynding. Den genforkalket blod derpå perfunderes i en collagen-coatede analyse kammer, og differentieret mærkning tillader real-time imaging af både blodplade- og fibrinaflejring anvendelse af fluorescens video mikroskopi. Systemet bruger kun kommercielt tilgængelige værktøjer, øger chancerne for standardisering. Rekonstituering af thrombocytopenic blod med blodplader fra krænges koncentrerer desuden modeller trombocytinfusion, beviser dens anvendelse i denne forskning domæne. Eksempler data viste, at koagulation indtræden og fibrinaflejring var lineært afhængig af blodplade koncentration, hvilket bekræfter forholdet mellem primær og sekundær hæmostase i vores model. I en tidsramme på 16 perfusion min, havde kontakt aktivering ikke finde sted, på trods rekalcifikationstid til normal Ca ²⁺ og Mg ²⁺ niveauer. Når koagulationsfaktor XIIa blev inhiberet af majs trypsininhibitor, denne tidsramme var endnu længere, hvilket indikerer en betydelig dynamikområde i kan vurderes ændringerne i prokoagulant karakter blodpladerne. Co-immobilisering af vævsfaktor med kollagen væsentligt reduceret tid til indtræden af ​​koagulation, men ikke dens sats. Muligheden for at undersøge vævsfaktor og / eller kontakten pathway øger alsidighed og anvendelighed af assayet.

Introduction

Primær og sekundær hæmostase var oprindeligt conceptualized som to relativt adskillelige biokemiske processer. Primær hæmostase blev betragtet som en vigtig bidragyder i arterielt strømningsforhold, med en central rolle for blodplader, mens sekundær hæmostase blev set at dominere koagulation under venøs blodgennemstrømning, hvilket tillader protease kaskade til dannelse uopløseligt fibrin. De seneste årtier har omformet denne traditionelle opfattelse væsentligt, anerkender, at blodpladeaktivering og koagulation er indbyrdes afhængige og er lige vigtige processer under fysiologiske og patologiske hæmostase i alle (ikke-ekstreme) hydrodynamiske miljøer. Dette synspunkt er blevet oversat til klinikken, hvor analyser udtænkt til omfattende målinger hel-blod koagulation anvendes i stigende grad, om end med mange tilbageværende spørgsmål om relevans, anvendelighed og nytte ^en.

Vi har for nylig udgivet en funktionel analyse af blodpladerkoncentrater hjælp mikrofluide strømningskamre overtrukket med fibrillært collagen i en in vitro model af transfusion ^2, med prøver indeholdende normale mængder af røde blodlegemer, plasma og blodplader. Denne metode anvender heparin eller hirudin antikoaguleret blod, hvilket indebærer ingen eller begrænset inddragelse af sekundær hæmostase, som er afhængig af thrombindannelse og ioniseret calcium (Ca2 ^+). For at understøtte thrombin dannelse og dermed til at omfatte alle aspekter af hæmostase under mikrofluid flow, vi udviklet en supplerende metode på samme tekniske platform, nu herunder gratis Ca ^2+. På denne måde kan blodpladeaflejring og fibrindannelse studeres, igen i en model for blodpladetransfusion, at vurdere blodpladekoncentrat kvalitet.

Ved denne fremgangsmåde er de blodplader og fibrinogen mærket med fluoroforer, der har fuldt adskilt emissionsspektre. Dual farve, real-time video mikroskopi tillader derefter en analyse afprimære blodpladeadhæsion, samt koagulation initiering og fibrin deposition. En vigtig variabel i denne type assay er rekalcifikationstid, fordi tilsætning af Ca2 ⁺ til statisk blod, før perfusion, vil uundgåeligt forårsage kontakt-initieret koagulering i beholderen. Denne indvielse vil bias udlæsning grundet tilstopning af slanger og biochip indløb før perfusion. Derfor, i vores metode, citrat antikoaguleret blod og en Ca2 ⁺ holdig puffer pumpes særskilt gennem de øvre dele af en Y-formet indløbskammer. Komponenterne blandes under perfusion inden de kommer ind en analyse kammer overtrukket med collagen alene eller i kombination med rekombinant human vævsfaktor (rhTF). Ved at tilpasse de strømningshastigheder af de separate pumper og koncentrationen af Ca2 ⁺ i bufferen, en 10% fortynding af den endelige blodprøve finder sted.

Ved hjælp af denne forlængede protokol, demonstrerer vi bidrag coagulation faktor XII (FXII) og blodplader koncentration at kontakte pathway koagulation initiering under flow. Vore data viser også, at ved at overtrække rhTF sammen kollagen, kan den vævsfaktor pathway måles samtidigt.

Protocol

Denne protokol følger de institutionelle etiske retningslinjer for forskning i humane prøver, og informeret samtykke blev opnået fra alle donorer, der er involveret. Godkendelse til eksperimenterne beskrevet her blev opnået fra den institutionelle gennemgang bestyrelsen for Antwerpen Universitetshospital (autorisationsnummer 16/10/120). BEMÆRK: Temperatur indikationer er altid stuetemperatur, medmindre andet er angivet. 1. Microfluidics Setup Forbered mikrofluide flow kammer kanaler, slanger og tilledninger Resuspender kollagen bestanden hætteglasset ved hvirvelblanding, og derefter fortyndes i isotonisk glucoseopløsning leveret af producenten til en slutkoncentration på 50 ug / ml. BEMÆRK: Brug heste sene kollagen, hovedsageligt består af type I fibriller. Heste collagen type I omtales ofte som "Horm" collagen og er den gyldne standard for denne type analyse, for både historiske ogbiologiske årsager. Humane type III collagen kan også anvendes, men disse fibriller pels mindre godt, og trombocytrespons er ikke så stærk. Andre coating overflader kan også anvendes, såsom von Willebrand-faktor, fibrinogen, fibronectin, laminin, vitronectin, thrombospondin-1, eller kombinationer af disse 3. Læs nye engangsbeholdere mikrofluid biochip med otte lige, parallelle kanaler og dimensioner i mm, 0,4 W x 0,1 H x 20 L. Pipetter 0,8 pi af kollagen ind i kanalen (e) af biochip i den ene ende og mærke dette som udløbet. Fyld kun 5/6 af kanalen længde, således at kollagenfibrillerne ikke behandles i kanal indløb, da dette kan forårsage tilstopning, som lukker en effektiv perfusion. Inkuber biochip ved 4 ° C i mindst 4 timer i en befugtet og forseglede beholdere. At studere vævsfaktor (extrinsic) -medieret koagulation i kombination med kontakten pathway (iboende), overtrække kanaler med collagen og rekombinant human vævsfaktor (rhTF). Fortynd rhTF i 10 mM 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsyre (HEPES) -buffered saltvand (HBS; 0,9% (w / v) NaCl, pH 7,4, 1: 3,000, stock koncentration: 4,5 nM). Fjern collagen-overtræksopløsningen via udløbet. Pipetter 0,8 pi rhTF i HBS (fortynding 1/500 af koncentration af stamopløsning, slutkoncentration: 9 pm) ind i udløbet af kanalen, påfyldning 5/6 af kanalen længde, svarende til collagen-coating strategi. Inkubér biochip i yderligere 30 minutter i en befugtet og forseglede beholdere. Fyld de coatede kanaler med blokerende buffer (1,0% (vægt / volumen) bovint serumalbumin og 0,1% (w / v) glucose i HBS), startende fra den anden ende (mærket som indløbet). Fyld et lige antal Y-formede kanaler med samme blokerende buffer i en blanding biochip. Sørg for at alle kanaler og kanal arme er helt fyldt med blokerende buffer. Inkuber både biochips i mindst 1 time i en befugtet og forseglede beholdere. For hver kanal i brug, forberede to rør på 8 cm lange, en 2 cm lange, og en 46 cm lang. Sæt en nål i den ene ende af tre mindre slanger og i begge ender af den længste slanger. Forbered skylle pumpe Skyl alle pumpe fluidics og den tilsluttede slange med destilleret vand. Affedt biochip er casting med en præcision støvfri tørre og denatureret alkohol til at fjerne udskrifter og støv. Fyld alle slanger med blokerende buffer inden du tilslutter dem til biochips. Fastgør coatede biochip på automatiserede mikroskop scenen. Fastgør blanding biochip i samme højde som mikroskopbordet anvendelse af en laboratorie saksedonkraft. Forbind den coatede biochip med blanding biochip hjælp den længste slanger, 46 cm lang. Sørg for at begge biochips er i en afstand således at slangen danner en fleksibel, men lige linje. </li> Sæt en sprøjte stik stift i Luer-kompatible slange af skylning pumpen. Tilslut den til den frie ende af den 2-cm rør og fastgør den anden ende til udløbet af det overtrukne biochip. Fastgør de to 8-cm slange til blandingsforholdet biochip indløb ved hjælp af sine ben. Sæt den frie ende af hver slange i et hætteglas med HBS. Skyl alle slanger og alle kanaler med 1 ml HBS. BEMÆRK: HBS strømmer fra hætteglasset gennem 8-cm slange til blandekammeret chip og gennem 46-cm rør til den coatede chip (der flyder fra den uovertrukne til den coatede del) på grund af trækkraften fra Skyllepumpe. Dette trin fjerner blokerende buffer og dårligt adhæreret collagen (eller rhTF i dobbelt-belagt biochips). Forbered perfusion pumper Åbn driver software af perfusionen pumper. Initialiser pumperne ved at dobbeltklikke på ikonet sprøjter i softwaren. Vælg den type sprøjte, der vil blive anvendt: 1 ml sprøjter for koagulation Buffer og 2 ml sprøjter til den rekonstituerede blod. Slut sprøjterne til biochip konstruktion Afbryd Skyllepumpe og alle rør, bortset fra den ene forbinder de to biochips. Den frakoblede slanger genbruges i de følgende trin. Tilslut 2 cm slange med sin sprøjte konnektorstift til Luer lock af et tykvægget rør affald. Fyld tykvægget rør med standard pepsin med en sprøjte. BEMÆRK: Tilsætning af pepsin til affalds- slange inhiberer og lyserer post-perfusion størkning og forhindrer derfor tilstopning af systemet ved bagenden. Fastgør åbne ende af tykvæggede rør, med en Kocher-klemme. Placer en egnet affaldsbeholder med blegemiddel nedenunder til opsamling gennemløbet. Fastgør slangen med sin pin til udløb den coatede biochip. 2. Forberedelse af blodprøver Indsaml blod fra en rask frivillig og adskille dets komponenter 4 Indsamle blod i en evakueret ethylendiamin-tetraeddikesyre (EDTA) beholder. Brug denne prøve kun til at udføre en komplet blodtælling (CBC) ved hjælp af en automatiseret hæmatologianalysator. Indsamle blod i lufttomme natriumcitrat beholdere. 5 ml blod er påkrævet per kanal. Anbring prøven (e) på en vandret rotator verserende blod rekonstituering. BEMÆRK: Analysen skal være afsluttet inden for 3 timer efter tapning. Trombocytkoncentrat og hel-blodprøver er ABO / RhD blodtype matchede. Centrifuger i 13 minutter ved 250 xg til fremstilling blodpladerigt plasma (PRP). Brug ikke centrifugen bremsen for at forhindre forstyrrelse af den løst pakket pellet. Overfør PRP til et frisk konisk centrifugerør. Centrifugeres i 10 minutter ved 4.500 xg (med bremse) til pelletering af blodpladerne og forberede blodpladefattigt plasma (PPP). Kassér platelet pellet. Inkubér PPP i et vandbad ved 37 ° C. Overfør pakkede røde blodceller til et frisk konisk rør ved at perforere bunden af ​​den oprindelige med en 21 G nål. BEMÆRK: resterende antal blodplader i den pakkede røde blodlegemer fraktion er 11 ± 4 x 10 3 pr pi (gennemsnit ± SD, n = 10). Rekonstituer blod Bestem hæmatokritværdien af ​​de pakkede røde blodceller fremstillet i trin 2.1.6 anvendelse af en automatiseret hæmatologianalysator. Bestem blodplade koncentration af blodpladekoncentrat, der vil blive anvendt til analyse under anvendelse af en automatiseret hæmatologianalysator. Beregn mængden af pakkede røde blodceller, blodpladekoncentrat og PPP, der vil give en 40% hæmatokrit og 250 x 10 3 blodplader / ul i en 2,5 mL slutvolumen. Bland disse til fremstilling rekonstitueret blod og udføre en CBC. BEMÆRK: Andre target titre af celler kan anvendes, afhængigt af the forskningsspørgsmål. Der fremstilles en "blank" kontrolprøve, hvor volumenet af blodpladekoncentrat erstattes af samme volumen saltvand til bestemmelse af koncentrationen af "endogene" blodplader (dvs. ikke-blodbank blodplader). Mærk den rekonstituerede blod for blodplader og fibrinogen Pipette 13 pi af en 10,7 mg / ml opløsning af Alexa Fluor 405-mærket fibrinogen (70 mg / ml slutkoncentration) i et reagensglas, og der tilsættes 1 ml rekonstitueret blod. BEMÆRK: Fibrinogen blev mærket ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt kit ifølge producentens manual. Bland yderligere 1 ml rekonstitueret blod i et reagensglas indeholdende 2 pi 1 mM DiOC 6 (1 uM slutkoncentration) eller indeholdende 2 pi 5 mM Calcein AM (5 uM slutkoncentration). Tilføje dette til rør indeholdende blod med fibrinogen, hvilket giver et slutvolumen på 2 ml platelet- og fibrinogen-sindeholdt blod. BEMÆRK: Valget af farvestof kan stole på den forskning, spørgsmål eller præference for forskeren fem. Vær opmærksom på at excitation af enhver farvestof kan forårsage fotokemiske artefakter. Bland forsigtigt ved at vende. Prøven inkuberes i 10 minutter ved 37 ° C. Forbered koagulation buffer Forbered koagulation puffer indeholdende 10 mM CaCl2 og 3,75 mM MgCl2 i HBS. Forbered 1 ml koagulation buffer for en kanal. Filter-sterilisere koagulation buffer gennem et 0,2 um filter. Pre-varm denne til 37 ° C. 3. Perfusion Assay Fokusere mikroskop optik til collagenfibrene klæbet til bunden af ​​kanalen. Brug fasekontrast eller differentiel interferens kontrast (DIC). Vælg "Sæt strøm Z for udvalgte flise regioner" i eksperimentet software til digitalt fastsætte den valgte fokus. Definer et område af interesse (ROI) i den valgte kanal ved hjælp købet software af mikroskopet. BEMÆRK: ROI kan være enhver overflade arbitrært vælges inden en perfusionskanal. Det anbefales ikke at analysere thrombedannelse og fibrin generation tæt på indløbet og udløbet for at undgå at erhverve billeder af ujævnt fordelt tromber. ROI overfladeareal bør indeholde et betydeligt antal tromber at muliggøre udligning af signalvariabilitet enkelte blodplader. Placeringen af ​​ROI i xy-planet af kanalen er altid fast og bestemmes før perfusion. Hvis det er nødvendigt, kan den ikke-coatede del af kanalen indgå i analysen for at bestemme, om blodplader binder ikke-specifikt til biochip plast. Fremstille prøver til perfusion Montere en 1 ml sprøjte indeholdende 1 ml forvarmet koagulation buffer i perfusion pumpe. Bland det foropvarmede rekonstitueret blod ved forsigtigt at vende og belastning 2 mL i en 2 ml sprøjte. Sørg al luft er fjernet fra begge sprøjter og forbinde hver til en 8-cm rør ved hjælp af en sprøjte konnektorben. Prime stik og slanger af både sprøjter ved høj hastighed (400 uL / ​​min), og stoppe, når alt er fyldt med koagulation buffer eller blod. BEMÆRK: Ved priming slangen, vil koaguleringen puffer og rekonstitueret blod blandes umiddelbart i Y-formede kanal af blandingszonen biochip ved start eksperimentet, undgå indførelsen af ​​luft til perfusionskamrene. Brug af stifter, fastsætte den anden ende af både rør til de spaltede ben af ​​Y-formede kanal i blandezonen biochip. Den nederste ben anvendes til perfusion af koagulation buffer og det øvre ben for rekonstitueret blod. Starte eksperimentet ved at initiere perfusion på 4,4 pl / min for koagulation puffer og 44 pi / min for rekonstitueret blod. Fjern Kocher klemme ved udløbet af affaldet slange for at tillade perfunen. BEMÆRK: Flow rate kan ændres afhængig af problemstilling. Start et stopur til at bestemme tiden mellem påbegyndelsen af ​​eksperimentet og starten på tidstro billedregistrering. Optage billeder hver 10 s til 30 min i realtid ved hjælp erhvervelse og eksperiment software af mikroskopet. Start optagelsen, når den blanding af rekonstitueret blod og koagulation buffer ind i belagte biochip monteret på mikroskopet scenen. BEMÆRK: Andre tidsserie kan anvendes afhængigt af forsøgsopstillingen. Brug en 100X forstørrelse (10X objektiv og 10X objektiver). 4. afslutningsmodstand Experiment Afslut pumperne og billedoptagelse efter 30 min eller tidligere, hvis signalet er mættet. Tag alle slanger og sprøjter og kassere dem som biologisk farligt affald. 5. Data Analysis Bestem trombe vækst (grøn fluorescens) og fibrindannelse (violet fluorescence) kinetik med billedanalysesoftware. Følgende kommandoer er specifikke for den anvendte software her: Åbn plugin Behandler: syning at sy side-by-side billeder pr tidspunkt. Åbne pluginnet billedanalyse til bestemmelse af overfladedækning af blodpladerne. Åbn plugin Measure. Definer ROI ved at trække et rektangel regionen, herunder alle tromber og fibrin fibre; i denne protokol, investeringsafkastet er et rektangel på 637 mm 2. Vælg fanen Alle Views til at omfatte alle optagede tidspunkter. Brug oprette tabeller til automatisk at generere et regneark, der indeholder den gennemsnitlige fluorescensintensitet værdi for den valgte rektangel region hvert tidspunkt. Gem regneark i XML-format. Åbn et regneark i et regnearksprogram for yderligere beregninger. Træk den indledende (background) værdien af ​​alle oplysninger. Plot fluorescerende signal som funktion af den perfusion tid for både den grønne (blodplader) og violet (fibrin) farvestoffer. BEMÆRK: Tag højde for den tid mellem pumpen initialisering og selve udgangspunktet for erhvervelse billede. Thrombedannelse er generelt en to-trins proces i denne model: (1) "langsom" blodpladeadhæsion (dvs. adhæsion) til immobiliseret collagen efterfulgt af (2) koagulation-drevet trombe vækst med en "hurtig" stigning i både blodplade-binding ( dvs. akkumulering) og fibrinaflejring (dvs. koagulation) (figur 1). Beregn hældningen af ​​blodpladeadhæsion og akkumulering ved lineær regression; denne hældning giver blodplade blodprop vækst kinetik i hver fase af dens dannelse. Beregn hældningen af ​​fibrin koagulation og ekstrapolere denne linje til at opfange X-aksen, bestemme tidspunktet for debut.

Representative Results

Analysen af tidstro rådata er beskrevet i figur 1. Første, blodplader klæber til den reaktive overflade, hvilket resulterer i en stadig stigning i optaget grøn fluorescens (figur 1A, i), kaldet adhæsion. I denne fase, er der lidt violet fluorescens, hvilket indikerer, at fibrin er ikke eller kun marginalt dannet (figur 1B). Ved initiering af koagulering, violet-fluorescerende fibrin indskud hurtigt (iii), og i den tid, blodplade grøn fluorescens stiger på omtrent samme hastighed, der er udpeget her som blodpladeakkumulering (ii). Et enkelt eksperiment returnerer således tre satser fluorescens stigning (i, ii og iii) som en surrogatmarkør for hastigheden, hvormed blodplader og fibrin afsætningen finder sted i denne model. Desuden er et øjeblik af koagulation debut (øjeblik-of-debut (iv)) ekstrapoleres, som er en afgørende faktor for blodpladerprokoagulant potentiale. I fravær af TF, koagulation initiering er langsom og primært løber gennem kontakt pathway hvor den iboende tenasekompleks aktiverer FX via direkte aktivering af FIX 6 ved FXI og / eller FXII. For at demonstrere FXII afhængighed, 4 pM af majs trypsininhibitor (CTI) blev tilsat for at inhibere aktiveret FXII (FXIIa) 7. Denne hæmning påvirkede ikke trombocytadhæsion (figur 2A), men koagulation startede ikke for arbitrært definerede samlede varighed af perfusion forsøget (figur 2B og Supplerende Video 1). In vitro, kan kontakten pathway initieres af fremmede materialer som glas, eller i kliniske assays under anvendelse af en mineralsk materiale som kaolin. In vivo aktiverede blodplader giver den negative ladning 8 </ sup> gennem membranen eksponering af sure phospholipider 9, ligesom phosphatidylserin, og / eller ved frigivelse af polyphosphater (Polyp) 10, 11. Vores mikrofluide realtid assay efterligner sidstnævnte, fordi, i et område på blodplade koncentrationer, den hæmostatiske reaktion afhang af blodpladetal (figur 3). Ved at forøge antallet af blodplader i det rekonstituerede prøve, hastigheden af adhæsion (figur 3A), akkumulering (figur 3B, grøn), og koagulation (figur 3B, violet) steg lineært. Det øjeblik-of-debut signifikant forkortet (figur 3C) ved forøgelse blodpladekoncentration, hvilket antyder, at en tærskel antal (aktiveret) deponeret blodplader er nødvendig for at udløse koagulation. Ved vævsskade in vivo dog TF-bærende celler vil jegnitiate blodets størkning via FVIIa-TF extrinsiske tenasekompleks i nærvær af Ca2 +. Dette efterlignes i vores forsøgsopstilling med post-belægning kollagen-holdige perfusion kamre med lipideret rhTF. I en parret analyse af kanaler overtrukket med kun eller i kombination med rhTF collagen, koagulation indtræden var væsentligt hurtigere (figur 4A). Hastigheden af ​​blodpladeadhæsion var ikke lineær, så ingen lineær regression kunne udføres (data ikke vist). Både antallet af koagulation og blodpladeakkumulering var ikke forskellig mellem betingelser (figur 4B-4C, Supplerende Video 2). Figur 1: Regressionsanalyse af blodpladeadhæsion og koagulation i mikrofluide perfusionskamre. Dette tal præciserer de parametre, der er afledt af real-time fluorescens rådata erhvervet under genforkalket blodgennemstrømning over en reaktiv overflade. (A) Mean intensiteten af grøn fluorescens viser blodpladeaflejring i funktion af perfusion tid. Kurven beskriver en bimodal proces begynder med (i) langsomt stigende lineær blodpladeadhæsion, efterfulgt af (ii) hurtigt voksende lineær akkumulering. Både lineære dele af kurven er regression og hældningen af ​​disse beskriver de to satser trombedannelse ved blodplade fluorescens; (I) adhæsion og (ii) akkumulering. (B) Mean intensiteten af violet fluorescens viser aflejring af fibrin i funktion af tiden. Under blodpladeadhæsion, violet fluorescens i det væsentlige fraværende, mens det hurtigt udvikler Efter igangsættelse af koagulation. Den (iv) moment-of-debut er defineret som skæringspunktet med x-aksen af den ekstrapolerede lineær regression af (iii) den anden fase af trombedannelse ved fibrin fluorescens betegnet her som koagulation.ef = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55351/55351fig1large.jpg" target = "_ blank"> Klik her for at se en større version af dette tal. Figur 2: I fravær af TF, koagulation i collagenovertrukne perfusion strømningskamre afhænger FXIIa. Mikrofluidapparat perfusion af rekonstitueret blod indeholdende CTI eller kontrol puffer (kontrol) blev udført ved en forskydningshastighed på 1.000 s-1 i i alt 30 minutter. (A) Satsen for blodpladeadhæsion (s -1) var ikke afhængig af CTI. (B) I det øjeblik-of-debut for CTI-behandlede prøver var udover den 30 min grænse af forsøget (vist som en stiplet linje), hvilket viser afhængigheden af FXIIa af denne parameter. Barer og prikker er middelværdier, whiskers er standardafvigelse. Statistisk analyse var med parret t-test. (NS = ikke signifikant, n ≥3). Klik her for at se en større version af dette tal. Figur 3: Koagulation under strømning afhænger af blodpladeantal. Mikrofluide perfusion blev udført i collagenovertrukne kamre med rekonstitueret blod i nærvær af Ca2 + og varierende blodplade koncentrationer (n ≥3). (A) Sats for blodpladeadhæsion (B) på blodpladeakkumulering (grøn) og koagulation (violet), og (C) øjeblik-of-debut er vist som funktioner af blodplader koncentrationer i rekonstitueret blod. Dots er middelværdier, whiskers er standardafvigelser. Klik her for at se et større versipå denne figur. Figur 4: Aktivering af både TF og kontakt pathway koagulation forkorter væsentligt det øjeblik-of-debut af koagulation. Rekonstitueret blod, i nærværelse af Ca2 +, blev perfunderet gennem kamre overtrukket med collagen alene eller med kollagen og rhTF at studere kontakt pathway alene eller en kombination af kontaktpunkterne og TF veje. (A) I det øjeblik-of-indtræden af koagulation forkortes betydeligt i TF-holdige strømningskamre. (B) Satsen for ophobning af blodplader under koagulation og (C) satsen for koagulation er ikke signifikant forskellig mellem kollagen kun eller kollagen og rhTF-belagt flow kamre. Barer og prikker er middelværdier; whiskers er standardafvigelser. Statistisk analyse var med parret t-test. (NS = ikke signifikant, * P < 0,05, n ≥3). Klik her for at se en større version af dette tal. Supplerende Video 1: I fravær af TF, koagulation i collagenovertrukne perfusion strømningskamre afhænger FXIIa. Rolle kontakt pathway bestemmes i collagenovertrukne perfusion strømningskamre. (A) Overlaid fluorescens billedsekvens af blodplade (grøn) og fibrin (ogen) (violet) aflejring i fravær af CTI. (B) samme sekvens som panel A, men med den grønne kanal slukket. (C) Overlaid fluorescens billedsekvens af blodplade (grøn) og fibrin (ogen) (violet) aflejring i nærvær af CTI. (D) samme sekvens som felt C, men med den grønne kanal slukket.ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55351/Supplementary_video_1.avi "target =" _ blank "> Klik her for at downloade denne video. Supplerende Video 2: Aktivering af både TF og kontakten vej forkorter signifikant koagulering øjeblik-of-debut. For at undersøge rollen af ​​TF blev strømningskamre overtrukket med collagen alene eller med kollagen og rhTF anvendes. (A) Overlaid fluorescens billedsekvens af blodplade (grøn) og fibrin (ogen) (violet) aflejring i strømningskamre overtrukket kun med collagen. (B) samme sekvens som panel A, men med den grønne kanal slukket. (C) Overlaid fluorescens billedsekvens af blodplade (grøn) og fibrin (ogen) (violet) aflejring i strømningskamre overtrukket med både kollagen og rhTF. (D) samme sekvens som felt C, men med den grønne kanal switched off. Klik her for at downloade denne video.

Discussion

Den transfusion af blodplader koncentrater er ordineret til trombocytopenisk patient for at forhindre eller stoppe blødninger. Dens kliniske effekt blev for nylig fremhævet i en historisk gennemgang af akut leukæmi ^12, minder om, at øget overlevelse af pædiatriske patienter i tresserne og halvfjerdserne var stort set tilskrives forbedringer i (blodplader) transfusion medicin. Blodpladekoncentrater bruges også til at dæmme blødning i akut trauma eller under kirurgi. Under disse omstændigheder er blodplader med fremragende prokoagulerende egenskaber, der hurtigt indlede hæmostase foretrækkes, men blodplade koncentrater fremstillet af donationer af frivillige donorer og i modsætning farmakologisk medicin, er standardiseret af forberedelse alene, ikke ved (kemisk) sammensætning. Derfor flere spørgsmål inden for blod bank er ubesvarede, herunder dem på optimale donation modaliteter, opbevaringsforhold og transfusion praksis. På området platelet (transfusion) biologi, mange spørgsmål om celle clearance fra cirkulation, bidrag transfunderede blodplader til hæmostase, eller deres immunologi også forbliver ubesvarede.

Talrige laboratoriemetoder til trombocytfunktionen analyse er til rådighed, men disse oftest løse en enestående aspekt af trombocytfunktionen, ligesom sammenlægning eller degranulering ^13. At bredt vurdere blodplader og blodplader koncentrater, omfattende modeller af hæmostase er uundværlige, og disse skal indeholde hydrodynamik. Blod rheologi er afgørende at fortolke blodplade adfærd korrekt under hæmostase ^{14, 15} eller thrombose ^16, selv om antikoagulation forhindrer Ca2 ⁺ og / eller thrombin til at deltage i nærværelse af citrat eller heparin, henholdsvis ^2. For at undersøge samspillet mellem koagulation og trombocytfunktionen under flow ¹⁷, ^18, normal thrombindannelse er påkrævet, og derfor frit Ca2 ⁺ samt. Forsøgsopstillingen til undersøgelse hæmostase under disse betingelser er kompleks, fordi foranstaltninger til at forhindre "artefakt" eller ukontrolleret aktivering af koagulation bør tages så meget som muligt. Desuden er mange specialiserede forskergrupper bruger skræddersyet hardware ^{19, 20,} som forårsager betydelig mellem laboratorier variabilitet ^fem. Typiske begrænsninger af denne fremgangsmåde er anvendelsen af rektangulære beholdere, ikke-pulserende flow profiler, og ikke-humane overfladebelægninger ^5. Analysen beskriver vi her bruger kommercielt tilgængelige værktøjer og kan derfor være egnet til standardisering.

Fordi koagulationskaskaden reaktionen let aktiveres, når blodet ikke er indeholdt i det menneskelige legeme, kontrolleret rekalcifikationstid er et afgørende skridt. To opnå dette, tilsætning af Ca ²⁺ skal udskydes til lige før perfusion over den reaktive kollagen overflade, for når Ca2 ⁺ buffer leveres i løs vægt til statisk blod, koagulation uundgåeligt finder sted, efterhånden tilstoppe slangen og forspænding af data fortolkning (data ikke vist). Løsningen på dette problem er at pumpe pufferen Ca2 ⁺ og blodet separat, giver mulighed for blanding af konvektive og diffusive kræfter under perfusion på vej til analysekammeret. Fuldstændig blanding er opnået i et 46-cm segment af slangen mellem blandings- og analyse kamre. Denne længde blev beregnet for den optimale opholdstid af reagenser til at blande baseret på fundamentale love masse og konvektiv transport ²¹ under perfusion ved strømningshastigheden brugt (1.000 s ^-1). Denne fremgangsmåde viste sig styrbar og reproducerbar.

Kontakt aktivering af koagulation er undertiden betragtes som en artefakt af simpelblodprøvetagning og skal undgås ved fortolkningen størkningstider. Viste vi derfor, at i mangel af inhibitorer, kontakt-induceret koagulation starter ved 16,7 min (± 3,7 min) af perfusion. I nærvær af CTI at inhibere FXIIa-medieret kontakt aktivering, er koagulation ikke indledt i defineres arbitrært løbet af forsøget (30 min). Dette vindue af eksperimenter er tilstrækkelig lang til at skelne prøver, der er pro- eller antitrombotisk. Selvom koagulation ved kontakt aktivering kan være en uønsket konsekvens af blod kontakt kunstige overflader, vores data viser en klar biologisk dosis effekt af blodplader. Dette kan være vigtigt for transfusion medicin, fordi de seneste resultater på FXII, blodplader polyphosphater ^10, phosphatidylserin fordeling ^22, og blodplademikropartiklerne ²³ har faktisk opskrevet kontakt pathway koagulation som en vigtig bidragyder til hæmostase, especielt i forbindelse med trombose ^24. For eksempel kan den variable udbyttet af blodpladetransfusioner hos patienter eller den variable phosphatidylserin ekspression af indsamlede blodplader således fremkalde variation i terapeutisk effektivitet hvis det lykkes koagulation er vist at afhænge af disse faktorer.

Ved co-immobilisering lipideret rhTF med collagen, den ydre koagulation rute eller TF pathway, aktiveres under blodpladeaflejring på collagen. Dette udvider assayet til sin mest omfattende tilstand, som en model for skader, der bringer blod i kontakt med TF-bærende celler og væv. Vore data viser, at co-immobilisering af collagen og TF nedsætter øjeblik af koagulation indsætning, men ændrer ikke hastigheden for koagulation. Af note, mængden af rhTF immobiliseret til overfladen er en vigtig variabel i denne model ^{25, 26} og bør standardiseres inden for en given undersøgelse. I Presence af CTI, kan TF pathway studeres udelukkende (ikke vist), fordi kontakt aktivering forhindres.

Afslutningsvis vores eksperimentelle opsætning kombinerer en model af transfusion ved rekonstituering af trombocytopenisk blod med opsparede blodplader og en model af hæmostase ved calcium-afhængig blodpladeaflejring og fibrindannelse under hydrodynamisk strømning. Dette assay vil blive brugt til at besvare spørgsmål om prokoagulant arten af ​​indsamlede blodplader og virkningerne blodpladekoncentrat fremstillingsteknikker har på dette.

Materials

1 mL Syringe	BD	A00434
10 mL Syringe	BD	309604
2 mL Syringe	BD	307727
Alexa Fluor 405	Life Technologies	A30100	The manufacturer's manual was followed for labeling of fibrinogen
BD vacutainer Eclipse	Becton, Dickinson and Company	368650	Blood collection needle with preattached holder
BD vacutainer tube with EDTA	Becton, Dickinson and Company	368856
BD vacutainer tube with Sodium Citrate	Becton, Dickinson and Company	366575
Blocking buffer	in house preparation	in house preparation	1.0% (w/v) bovine serum albumin and 0.1% (w/v) glucose in HBS
Calcein AM	Molecular probes	C1430
Coagulation buffer	in house preparation	in house preparation	10mM CaCl2 and 3.75 mM MgCl2 in HBS
Conical tube 15mL	Greiner bio-one	1888271
Conical tube 50mL	Greiner bio-one	227261
Corn trypsin inhibitor (CTI)	Enzyme Research Laboratories	CTI
Denaturated alcohol	Fiers	T0011.5
DiOC6	Sigma-Aldrich	318426	3,3′-Dihexyloxacarbocyanine iodide – 1mM solution in DMSO
Exigo microfluidic pump	Cellix	EXIGO-PC-FS7.0-MF
Fibrinogen	Sigma-Aldrich	F3879	Labelled in house with AF 405 – stock concentration 10.7 mg/mL
Hematology analyzer	Sysmex	pocH-100i
HEPES buffered saline (HBS)	in house preparation	in house preparation	10mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) buffered saline (0.9% (w/v) NaCl, pH 7.4
Horm Collagen	Takeda/Nycomed	1130630	Native equine tendon collagen (type I) Isotonic glucose solution to dilute collagen is supplemented
Humidified box	Cellix	HUMID-BOX
Incubation water bath	GFL	1013
Microscope	Zeiss	Axio Observer Z1	equipped with a colibri-LED and high resolution CCD camera
Mirus Evo Nanopump	Cellix	188-MIRUS-PUMP-EVO	with Multiflow8
Pipette	Brand	A03429
Pipette tips 100-1000	Greiner bio-one	740290
Pipette tips 1-10	Eppendorf	A08928
Pipette tips 2-200	Greiner bio-one	739280
Platelet concentrate orbital shaker	Helmer	PF-48i
Precision wipes	Kimtech	5511
Pepsin solution	Hanna instrument	HI7073L	2g pepsin per 75 ml solution, Protein cleaning solution with pepsin
Recombinant Human Tissue Factor Innovin	Dade Berhing	B4212-40	rhTF with synthetic phospholipids
Software microscope	Zeiss	N/A	ZEN 2012
Sterile docking device	Terumo BCT	TSCD
Table Top Centrifuge	Eppendorf	521-0095
Tube Roller	Ratek	BTR5-12V
Tubing Sealer	Terumo BCT	AC-155
Vena8 syringe connector pin	Cellix	CONNECTORS-B1IC-PACK100
Vena8 Fluoro+ Biochips	Cellix	188V8CF-400-100-02P10	Coated biochip
Vena8 Needles	Cellix	SS-P-B1IC-B1OC-PACK200
Vena8 Tubing	Cellix	TUBING-TYGON-B1IC-B1OC-ROLL 100F
VenaDelta Y1 Biochips	Cellix	VDY1-400-100-01-02	Mixing biochip
Vortex mixer	VWR	58816-121
ZEN2012 software	Zeiss