Эта статья описывает экспериментальную модель гемостаза, которая одновременно измеряет функцию тромбоцитов и коагуляции. Тромбоцитами и фибрином измеряют флуоресценцию в режиме реального времени, и скорость адгезии тромбоцитов, скорость коагуляции, а начало коагуляции определяются. Модель используется для определения свойств тромбоцитов прокоагулянтную при потоке в концентратах для переливания.
Микрожидком модели гемостаза оценки функции тромбоцитов в условиях гидродинамического сдвига, но в присутствии антикоагулянтов, этот анализ ограничивается только тромбоцитами осаждения. Сложные отношения между Ca 2+ -зависимые коагуляции и тромбоцитов функции требует тщательного и контролируемого рекальцификации крови перед анализом. Наша установка использует Y-образное смесительный канал, который поставляет концентрированный Ca 2+ / Mg 2+ буфер протекающей крови непосредственно перед перфузией, что позволяет быстро рекальцификацию без образца стазу. разница Десятикратное в скорости потока между двумя резервуарами минимизирует разбавление. Рекальцифицированной кровь затем перфузию в камере анализа коллагена покрытием, и дифференциальная маркировка позволяет в режиме реального времени изображений как тромбоцитов и фибрина осаждения с помощью флуоресцентной микроскопии видео. Система использует коммерчески доступные только инструменты, увеличивая шансы стандартизации. Воссоздание Thrombocytopenic крови с тромбоцитами из накренился концентратов, кроме того моделям переливание тромбоцитов, доказывая его использование в данном исследовании области. Примерные данные показали, что начало коагуляции и осаждения фибрин были линейно зависит от концентрации тромбоцитов, подтверждая связь между первичной и вторичной гемостаза в нашей модели. В сроки от 16 перфузионной мин, активация контакта не произошло, несмотря на рекальцификации к нормальному Са 2+ и Mg 2+ уровней. Когда фактор свертывания крови XIIa подавлялась ингибитором трипсина кукурузы, на этот раз кадр был даже больше, что указывает на значительный динамический диапазон, в котором можно оценить изменения в прокоагулянтной характере тромбоцитов. Co-иммобилизация тканевого фактора с коллагена значительно снижается время начала коагуляции, но не его скорость. Опция для изучения тканевого фактора и / или контактный путь повышает универсальность и полезность анализа.
Первичный и вторичный гемостаз были первоначально задумана как два относительно выделяемой биохимических процессов. Первичный гемостаз рассматривается как важный вклад в условиях артериального кровотока, с ключевой ролью тромбоцитов, в то время как вторичный гемостаз был замечен доминировать коагуляции при венозного кровотока, что позволяет каскадом протеазы с образованием нерастворимого фибрина. За последние несколько десятилетий изменили эту традиционную точку зрения, по существу, признав, что активация тромбоцитов и свертывания взаимосвязаны и являются одинаково важными процессами во время физиологического и патологического гемостаза у всех (не экстремальных) гидродинамических кругах. Эта точка зрения была переведена в клинику, где все чаще используются анализы , разработанные для комплексного измерения коагуляции цельной крови, хотя и с большим количеством оставшихся вопросов , касающихся актуальности, применимости и полезности 1.
Недавно мы опубликовали функциональный анализ тромбоцитовКонцентраты с использованием микрожидкостных проточных камер , покрытых фибриллярного коллагена в модели ин витро переливании 2, с образцами , содержащими нормальное количество эритроцитов, плазмы и тромбоцитов. Этот метод использует гепарин или гирудин не кровь с антикоагулянтом, что подразумевает отсутствие или ограниченное участие вторичного гемостаза, который зависит от образования тромбина и ионизированного кальция (Ca 2+). Для того, чтобы поддержать образование тромбина и , таким образом , чтобы охватить все аспекты гемостаза при микрожидком потока, мы разработали дополнительный метод на той же технической платформе, в настоящее время , включая бесплатный Ca 2+. Таким образом, осаждение тромбоцитов и образование фибрина могут быть изучены, снова в модели трансфузии тромбоцитов, с целью оценки качества тромбоцитов концентрата.
В этом методе, тромбоциты и фибриноген помечены флуорофоров, которые полностью разделенных эмиссионных спектров. Двойной цвет, видео в реальном времени микроскопии затем позволяет анализироватьпервичной адгезии тромбоцитов, а также инициирование коагуляция и осаждение фибрина. Важной переменной в этом типе анализа является рекальцификации, поскольку добавление Ca 2+ в застывшей крови, перед перфузией, неизбежно вызовет контакт инициированное коагуляции в контейнере. Это будет начало смещения считывание из-за засорения труб и биочипов бухтах до перфузии. Таким образом, в нашем методе, цитрат антикоагулянтом крови и -содержащие буфер Ca 2+ закачивают отдельно через верхние ножки в Y-образной впускной камеры. Компоненты перемешивают в течение перфузией перед входом в камеру анализа, покрытый одним или в сочетании с рекомбинантным человеческим фактором ткани (rhTF) коллагена. Путем адаптации скорости потока отдельных насосов и концентрацию Ca 2+ в буфере, 10% разбавление конечного образца крови происходит.
Используя этот расширенный протокол, мы демонстрируем вклад Coagulaфициентом XII (FXII) и концентрация тромбоцитов в контакт инициации пути коагуляции в потоке. Наши данные также показывают, что путем покрытия rhTF наряду коллаген, фактор пути тканевого может быть измерено одновременно.
Переливание концентратов тромбоцитов назначают для тромбоцитопенической пациента, чтобы предотвратить или остановить кровотечение. Его клиническое воздействие было недавно выделен в историческом обзоре острого лейкоза 12, напомнив , что увеличение выживаемости педиатрических больных в шестидесятых и семидесятых годов были в основном связаны с улучшением (тромбоцитов) трансфузионной медицины. Тромбоцитов концентраты также используются, чтобы остановить кровотечение в острой травмы или во время операции. В этих условиях, тромбоциты с отличными прокоагулянтных свойствами, которые быстро инициируют гемостаз, являются предпочтительными, но тромбоциты концентраты получают из пожертвований добровольных доноров и, в отличие от фармакологического препарата, стандартизованы препарата только, а не (химического) состава. Таким образом, несколько вопросов в банковской сфере в крови являются без ответа, в том числе и на оптимальных условиях донорства, условий хранения и практики переливания крови. В области плatelet (переливание) биологии, много вопросов по оформлению клеток из обращения, вклад трансфузии тромбоцитов в гемостазе, или их иммунология также остаются без ответа.
Многочисленные лабораторные методы для анализа функции тромбоцитов доступны, но они в основном решить особую аспект функции тромбоцитов, как агрегирование или дегрануляции 13. Для того, чтобы оценить в целом тромбоциты и концентратов тромбоцитов, комплексные модели гемостаза необходимы, и они должны включать в себя гидродинамику. Кровь реологию имеет решающее значение для правильной интерпретации тромбоцитов поведение во время остановки кровотечения 14, 15 или 16 , тромбоз, даже если антикоагулянтная терапия предотвращает Са 2+ и / или тромбин , чтобы участвовать в присутствии цитрата или гепарина, соответственно 2. Для изучения взаимосвязи между свертывающей и функции тромбоцитов в потоке 17, 18, нормальное образование тромбина требуется, и , следовательно, свободный Са 2+ , а также. Экспериментальная установка для исследования гемостаза при этих условиях является сложной, так как меры, чтобы предотвратить "артефакт" или неконтролируемая активация коагуляции следует принимать как можно больше. Кроме того, многие специализированные исследовательские группы используют заказные аппаратные средства 19, 20, что приводит к существенной межлабораторный изменчивости 5. Типичные ограничения этого подхода являются использование прямоугольных сосудов, профилей без пульсирующих потоков и поверхностных покрытий нечеловеческих 5. Анализ мы описываем здесь используются коммерчески доступные инструменты и, следовательно, могут быть пригодны для стандартизации.
Поскольку реакции коагуляции каскад легко активируется, как только кровь не содержится в человеческом теле, контролируемое рекальцификации является ключевым шагом. TO добиться этого, добавление Ca 2+ должно быть отложено до непосредственно перед перфузией над реактивным коллагеном поверхности, потому что , когда 2+ буфер Ca поставляется навалом застывшей крови, коагуляция неизбежно происходит, в конце концов засорение трубки и смещения данных интерпретация (данные не показаны). Решение этой проблемы заключается в прокачивать буфер Ca 2+ и кровь по отдельности, что позволяет для смешивания с помощью конвективных и диффузионных сил во время перфузии на своем пути к анализу камеры. Полное смешение достигается в 46-сантиметровом участке трубы между смешивания и анализа камер с. Эта длина была рассчитана для оптимального времени пребывания реагентов в смесь на основе фундаментальных законов массы и конвективного переноса 21 во время перфузии при скорости потока , используемого (1000 с -1). Такой подход оказался управляемым и воспроизводимым.
Контактная активация коагуляции иногда рассматривается как артефакт простойотбор проб крови и следует избегать при интерпретации время свертывания. Таким образом, мы показали, что, при отсутствии ингибиторов, контактно-индуцированной коагуляции начинается при 16.7 мин (± 3,7 мин) перфузией. При наличии CTI ингибировать FXIIa-опосредованную активацию контакта, коагуляция не инициируется в течение определенного произвольно ходе эксперимента (30 мин). Это окно экспериментов достаточно долго, чтобы различать образцы, которые про- или антитромботической. Даже при том, свертывание путем активации контакта может быть нежелательным последствием контакта крови искусственных поверхностей, наши данные показывают четкую биологическую эффекта дозу тромбоцитов. Это может быть важно для трансфузионной медицины, потому что последние данные по FXII, тромбоцитов полифосфаты 10, распределение 22 фосфатидилсерин и тромбоцитов микрочастицы 23 фактически переоценены контактной коагуляции тропинка в качестве важного фактора для гемостаза, еособенно в контексте тромбоза 24. Например, переменная выход трансфузии тромбоцитов у пациентов или переменной экспрессии фосфатидилсерина из насыпным тромбоцитов может, таким образом, вызывать изменчивость в терапевтической эффективности в случае успеха коагуляции показано, что в зависимости от этих факторов.
К со-иммобилизации липидированного rhTF с коллагеном, внеш пути коагуляции, или пути TF, активируется во время осаждения тромбоцитов на коллагене. Это расширяет анализ ее наиболее полный режим, в качестве модели для ран, которые приносят кровь в контакт с клетками и ткани TF-подшипник. Наши данные показывают, что совместное иммобилизации коллагена и TF уменьшает момент начала коагуляции, но не изменяет скорость коагуляции. Следует отметить, что количество rhTF иммобилизованным на поверхности является важной переменной в данной модели 25, 26 и должен быть стандартизован в рамках данного исследования. В PresenCE ИТК, путь ТФ может изучаться исключительно (не показано), так как предотвращается активация контактная.
В заключение, наша экспериментальная установка сочетает в себе модель переливания путем воссоздания тромбоцитопенической крови с тромбоцитами и насыпным модели гемостаза путем кальций-зависимой отложение тромбоцитов и образованием фибрина при гидродинамическом потоке. Этот анализ будет использоваться для ответа на вопросы о прокоагулянтной природе насыпным тромбоцитов и методы подготовки концентрата тромбоцитов эффекты имеют по этому вопросу.
The authors have nothing to disclose.
Это исследование было поддержано Фондом исследований и разработок бельгийской службы Красного Креста Фландрии крови. Мы признаем финансовую поддержку, оказываемую "Bijzonder onderzoeksfond" (BOF – специальное исследование фонда) из Гентского университета, предоставленного проекта с номером контракта BOF30290744.
1 mL Syringe | BD | A00434 | |
10 mL Syringe | BD | 309604 | |
2 mL Syringe | BD | 307727 | |
Alexa Fluor 405 | Life Technologies | A30100 | The manufacturer's manual was followed for labeling of fibrinogen |
BD vacutainer Eclipse | Becton, Dickinson and Company | 368650 | Blood collection needle with preattached holder |
BD vacutainer tube with EDTA | Becton, Dickinson and Company | 368856 | |
BD vacutainer tube with Sodium Citrate | Becton, Dickinson and Company | 366575 | |
Blocking buffer | in house preparation | in house preparation | 1.0% (w/v) bovine serum albumin and 0.1% (w/v) glucose in HBS |
Calcein AM | Molecular probes | C1430 | |
Coagulation buffer | in house preparation | in house preparation | 10mM CaCl2 and 3.75 mM MgCl2 in HBS |
Conical tube 15mL | Greiner bio-one | 1888271 | |
Conical tube 50mL | Greiner bio-one | 227261 | |
Corn trypsin inhibitor (CTI) | Enzyme Research Laboratories | CTI | |
Denaturated alcohol | Fiers | T0011.5 | |
DiOC6 | Sigma-Aldrich | 318426 | 3,3′-Dihexyloxacarbocyanine iodide – 1mM solution in DMSO |
Exigo microfluidic pump | Cellix | EXIGO-PC-FS7.0-MF | |
Fibrinogen | Sigma-Aldrich | F3879 | Labelled in house with AF 405 – stock concentration 10.7 mg/mL |
Hematology analyzer | Sysmex | pocH-100i | |
HEPES buffered saline (HBS) | in house preparation | in house preparation | 10mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) buffered saline (0.9% (w/v) NaCl, pH 7.4 |
Horm Collagen | Takeda/Nycomed | 1130630 | Native equine tendon collagen (type I) Isotonic glucose solution to dilute collagen is supplemented |
Humidified box | Cellix | HUMID-BOX | |
Incubation water bath | GFL | 1013 | |
Microscope | Zeiss | Axio Observer Z1 | equipped with a colibri-LED and high resolution CCD camera |
Mirus Evo Nanopump | Cellix | 188-MIRUS-PUMP-EVO | with Multiflow8 |
Pipette | Brand | A03429 | |
Pipette tips 100-1000 | Greiner bio-one | 740290 | |
Pipette tips 1-10 | Eppendorf | A08928 | |
Pipette tips 2-200 | Greiner bio-one | 739280 | |
Platelet concentrate orbital shaker | Helmer | PF-48i | |
Precision wipes | Kimtech | 5511 | |
Pepsin solution | Hanna instrument | HI7073L | 2g pepsin per 75 ml solution, Protein cleaning solution with pepsin |
Recombinant Human Tissue Factor Innovin | Dade Berhing | B4212-40 | rhTF with synthetic phospholipids |
Software microscope | Zeiss | N/A | ZEN 2012 |
Sterile docking device | Terumo BCT | TSCD | |
Table Top Centrifuge | Eppendorf | 521-0095 | |
Tube Roller | Ratek | BTR5-12V | |
Tubing Sealer | Terumo BCT | AC-155 | |
Vena8 syringe connector pin | Cellix | CONNECTORS-B1IC-PACK100 | |
Vena8 Fluoro+ Biochips | Cellix | 188V8CF-400-100-02P10 | Coated biochip |
Vena8 Needles | Cellix | SS-P-B1IC-B1OC-PACK200 | |
Vena8 Tubing | Cellix | TUBING-TYGON-B1IC-B1OC-ROLL 100F | |
VenaDelta Y1 Biochips | Cellix | VDY1-400-100-01-02 | Mixing biochip |
Vortex mixer | VWR | 58816-121 | |
ZEN2012 software | Zeiss |