Summary
本稿では、同時に血小板機能および凝固を測定止血の実験モデルを説明します。血小板およびフィブリンの蛍光をリアルタイムで測定し、血小板付着率、凝固速度と凝固の開始が決定されます。モデルは、輸血用の濃縮物で流下血小板凝固促進特性を決定するために使用されます。
Abstract
止血のマイクロ流体モデルは、流体力学的剪断の条件下で血小板機能を評価するが、抗凝固剤の存在下では、この分析は、血小板沈着のみに制限されています。 Ca 2+依存性凝固および血小板機能との間の複雑な関係は、分析前に血液の慎重かつ制御再石灰が必要です。私たちのセットアップはサンプルうっ滞せずに迅速な再石灰を有効にする、直前灌流に血液を流れるに集中した Ca 2+ / Mgの2+バッファを供給するY字型の混合流路を、使用しています。両方のリザーバ間の流速における10倍の差が希釈を最小化します。カルシウム再血液はその後、コラーゲンコーティングされた分析チャンバで灌流され、差動標識は蛍光ビデオ顕微鏡を使用して両方の血小板およびフィブリン沈着のリアルタイムイメージングを可能にします。システムは、標準化の可能性を増加させる、唯一の市販のツールを使用しています。 throの再構成バンクからの血小板とmbocytopenic血液は、この研究領域での使用を証明し、さらにモデルの血小板輸血を集中します。代表的なデータは、凝固開始及びフィブリン沈着は、我々のモデルのプライマリおよびセカンダリ止血の間の関係を確認し、血小板濃度に直線的に依存していたことを実証しました。 16灌流分の時間枠では、接触活性化は、通常のCa 2+およびMg 2+レベルに再石灰にもかかわらず、場所をとりませんでした。凝固第XIIa因子は、トウモロコシトリプシン阻害剤によって阻害された場合には、この時間枠は、血小板の凝血促進性の変化を評価することができるかなりのダイナミックレンジを示しても長かったです。コラーゲンと組織因子の共固定化は著しく、その速度凝固開始までの時間を減少させたが、ありません。組織因子および/または接触経路を研究するためのオプションは、アッセイの汎用性と有用性を向上させます。
Introduction
一次および二次止血はもともと2つの比較的分離可能な生化学的プロセスとして概念化されました。二次止血がプロテアーゼカスケードは不溶性フィブリンを形成することを可能にする、静脈の血流の下で凝固を支配するように見られた一次止血は、血小板のための重要な役割で、動脈流条件の主要な貢献者として見られていました。過去数十年は、血小板活性化および凝集を認め、ほぼこの伝統的な見方を再形成している相互に依存していると、すべての（非極端な）流体力学的環境における生理学的および病理学的止血の際にも同様に重要なプロセスです。このビューには、妥当性、適用性とユーティリティ1上の多くの残りの質問はあるものの、総合的に全血液凝固を測定するために考案されたアッセイは、ますます使用されている診療所、に翻訳されています。
我々は最近、血小板の機能解析を公開しました赤血球、血漿、および血小板の正常な量を含有する試料と、輸血2のインビトロモデルにおける線維性コラーゲンでコーティングされたマイクロ流体フローチャンバーを使用して濃縮します。この方法は、トロンビン生成およびイオン化カルシウム（Ca 2+）に依存している二次止血のないか、または限られた関与を示唆していない、ヘパリンまたはヒルジン抗凝固処理した血液を使用しています。マイクロ流体の流れの下で止血のすべての側面を含むようにこのようにトロンビン形成をサポートし、するために、我々は今、遊離Ca 2+を含む、同じ技術プラットフォーム上の相補的方法を開発しました。この方法では、血小板沈着およびフィブリン形成、血小板濃縮物の質を評価するために、血小板輸血のモデルに再検討することができます。
この方法では、血小板及びフィブリノーゲンが完全に発光スペクトルを分離しているフルオロフォアで標識されています。デュアルカラー、リアルタイムビデオ顕微鏡は、その後の分析を可能にします一次血小板付着、ならびに凝固の開始とフィブリン沈着。静的な血液へのCa 2+の添加は、灌流の前に、必然的に容器内の接触が開始した凝固の原因となりますので、このタイプのアッセイにおける重要な変数は、再石灰です。この開始は原因灌流前にチューブとバイオチップの注入口の目詰まりにバイアス読み出しをでしょう。したがって、我々の方法では、クエン酸は、血液を抗凝固処理およびCa 2+含有バッファーは、Y字型の入口チャンバの上部の脚を通して別々にポンピングされます。成分は、コラーゲン単独または組換えヒト組織因子（rhTF）との組み合わせで用いてコーティングされた分析チャンバに入る前に、灌流中に混合されます。バッファに別々のポンプの流速およびCa 2+の濃度を適合させることにより、最終的な血液試料の10％希釈が起こります。
この拡張プロトコルを使用して、我々は凝塊の寄与を実証しますションXII因子（FXII）および血小板濃度は、流れの下で経路凝固開始を連絡します。我々のデータはまた、コラーゲンと一緒rhTFをコーティングすることにより、組織因子経路を同時に測定することができることを示しています。
Protocol
このプロトコルは、ヒト試料の研究のための制度倫理指針に従い、インフォームドコンセントは、関係するすべてのドナーから得ました。ここに記載された実験の承認は、アントワープ大学病院（承認番号16/10/120）の施設内倫理委員会から入手しました。
注：指定しない限り、温度表示は、常に室温です。
1.マイクロフルイディクスのセットアップ
- マイクロ流体フローチャンバーのチャンネル、チューブ、および連結ピンを準備
- ボルテックス混合によるコラーゲンストックバイアルを再懸濁し、次いで、50μg/ mlの最終濃度を、製造業者によって提供さ等張グルコース溶液で希釈します。
注：主にI型線維の構成された、ウマ腱コラーゲンを使用してください。ウマコラーゲンI型は、しばしば「HORM「コラーゲンと呼ばれ、歴史との両方のために、この型のアッセイのためのゴールドスタンダードです生物学的な理由。ヒトIII型コラーゲンを使用することもできるが、これらのフィブリルコートあまりよく、および血小板応答は、強くありません。他のコーティング表面はまた、フォン・ビルブラント因子、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、トロンボスポンジン-1、またはこれら3つの組み合わせとして、使用することができます。 - 一方の端部にバイオチップのチャネル（複数可）に0.4 W 0.1×Hコラーゲンの×20 L.ピペットで0.8μLの、ミリメートルで、8ストレート、並列チャネルおよび寸法で新しい、使い捨てのマイクロ流体バイオチップを取ると、このラベルを付けますアウトレット。コラーゲン線維は、チャネル入口でコーティングされていないように、これは効率的な灌流を妨害する、目詰まりの原因になりますので、ちょうど5/6チャネル長を入力します。
- 加湿密封容器中で少なくとも4時間、4℃でバイオチップをインキュベートします。
- コラ接触経路と組み合わせて、組織因子（外因性）媒介凝集を研究するための（真性）、コートチャネル世代および組換えヒト組織因子（rhTF）。
- 10mMので希釈rhTF 4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジンエタンスルホン酸（HEPES）は、生理食塩水（; 3000、ストック濃度：4.5 nMの0.9％（w / v）の塩化ナトリウム、pH7.4中、1 HBS）を-buffered。
- コンセントを介したコラーゲンコーティング溶液を除去します。コラーゲンコーティング戦略に似たチャネル長の5/6を、充填流路の出口へ、：HBSでrhTFのピペット0.8μL（午後9時ストック濃度、最終濃度の希釈1/500）。
- 加湿と密封容器にさらに30分間、バイオチップをインキュベートします。
- （注入口と表記）他端から出発し、（HBS中/ v）のグルコースW v）のウシ血清アルブミンおよび0.1％（W / 1.0％（）ブロッキング緩衝液で被覆されたチャネルを充填します。混合バイオチップ内の同じブロッキング緩衝液とのY字型チャンネルの数と同じ数を記入してください。
- すべてのチャネルとチャネルアームが完全にブロッキング緩衝液で満たされていることを確認します。両方のバイオチップをインキュベート加湿密封容器中で少なくとも1時間、S。
- 使用中のチャネルごとに、1長さ2cmの長さは8センチ、、と長い1 46センチメートルの2チューブを準備します。 3つの小さなチューブの一端に、最長チューブの両端にピンを配置します。
- ボルテックス混合によるコラーゲンストックバイアルを再懸濁し、次いで、50μg/ mlの最終濃度を、製造業者によって提供さ等張グルコース溶液で希釈します。
- すすぎポンプを準備
- すべてのポンプ流体工学、蒸留水で接続されたチューブを洗浄します。
- プリントやほこりを除去するために、精密なダストフリーワイプや変性アルコールとバイオチップのキャスティングを脱脂。
- バイオチップにそれらを接続する前に、ブロッキング緩衝液ですべてのチューブを埋めます。
- 自動化された顕微鏡ステージ上にコーティングされたバイオチップを修正しました。実験用シザージャッキを使用して、顕微鏡ステージと同じ高さに混合バイオチップを修正しました。
- 46センチメートル長い最長のチューブを使用して、混合バイオチップでコーティングされたバイオチップを接続します。チューブは柔軟性が、直線を形成するように、両方のバイオチップは、距離にあることを確認してください。 すすぎポンプのルアー互換チューブにシリンジコネクタピンを取り付けます。 2 cmのチューブの自由端に接続し、コーティングされたバイオチップのコンセントにもう一方の端を固定します。
- そのピンを使用して混合するバイオチップの入口に2つの8センチチューブを固定してください。 HBSのバイアルに各チューブの自由端を置きます。すべてのチューブと1mLのHBSとのすべてのチャンネルを洗い流します。
注：HBSが原因すすぎポンプの引っ張り力にコーティングされたチップ（被覆部分にコーティングされていないから流れる）に混合チップに8センチの管を通って、46 cmの管を通してバイアルから流れます。このステップは、（二重コーティングされたバイオチップまたはrhTF）ブロッキングバッファーと不十分な付着したコラーゲンを削除します。
- 灌流ポンプを準備します
- 灌流ポンプのドライバソフトウェアを開きます。ソフトウェアでの注射器のアイコンをダブルクリックしてポンプを初期化します。
- 凝固bの1 mLのシリンジ：使用される注射器の種類を選択ufferと再構成された血液のための2 mLのシリンジ。
- バイオチップの建設にシリンジを接続し
- 2バイオチップを接続する1を除いて、すすぎポンプとすべてのチューブを外します。切断されたチューブは、以下の手順で再利用されます。
- 肉厚の廃液チューブのルアーロックへのシリンジコネクタピンと2 cmのチューブを接続します。注射器を使用して、標準的なペプシン溶液で厚肉チューブを埋めます。
注：廃液チューブの阻害にペプシンを加えてポスト灌流凝固を溶解するため、バックエンドでのシステムの目詰まりを防ぐことができます。 - コッヘルクランプで厚肉管の開放端を固定します。フロースルーを収集するために漂白剤の下で、適切な廃棄用容器を置きます。
- コーティングされたバイオチップの出口へのピンでチューブを固定してください。
血液試料の調製
- 健常者から血液を採取し、その成分を分離4
- 避難エチレンジアミン四酢酸（EDTA）の容器に血液を収集します。唯一の自動血液分析装置を用いて、完全な血球数（CBC）を実行するため、このサンプルを使用してください。
- 避難クエン酸ナトリウム容器内の血液を採取します。血液5mLをチャネルごとに必要とされます。
- 水平回転体保留中の血液の再構成上のサンプル（複数可）を配置します。
注：このアッセイは、瀉血の3時間以内に完了する必要があります。血小板濃縮物と、全血試料は、マッチしたABO /のRhD血液型です。 - 250×gで13分間遠心分離し、多血小板血漿（PRP）を調製しました。ゆるく充填されたペレットの乱れを防止するために、遠心ブレーキを使用しないでください。
- 新鮮な円錐形の遠心チューブにPRPを転送します。血小板をペレット化し、乏血小板血漿（PPP）を準備する（ブレーキ付）4,500×gで10分間遠心分離します。 PLATを破棄eletペレット。 37℃の水浴中でPPPをインキュベートします。
- 21 G針で元の1の底部を穿孔することにより、新鮮なコニカルチューブにパックされた赤血球を転送します。
注：パックされた赤血球画分中の残存血小板数がμLあたり11±4×10 3（平均±SD、n個= 10）です。
- 血液を再構成
- 自動血液分析装置を用いて、ステップ2.1.6で製造した濃縮赤血球のヘマトクリットを決定します。
- 自動血液分析装置を用いた分析のために使用される濃厚血小板の血小板濃度を決定します。
- 2.5mLの最終容積で40％ヘマトクリットおよび250×10 3血小板/μLをもたらす濃縮赤血球、血小板濃縮物、およびPPPの体積を計算します。再構成された血液を準備し、CBCを実行するために、これらのミックス。
注：細胞の他の標的力価は番目に応じて、使用することができ電子調査の質問。 - 血小板濃縮物の体積は、「内因性」血小板（ すなわち、非血液バンク血小板）の濃度を決定するために生理食塩水を同じ体積で置換された「ブランク」対照試料を準備します。
- 血小板およびフィブリノゲンのために再構成された血液にラベルを付けます
- 試験管内アレクサフルオロ405標識フィブリノーゲン（70μgの/ mLの最終濃度）の10.7ミリグラム/ mL溶液のピペットで13μLと再構成された血液の1ミリリットルを追加します。
注：フィブリノーゲンは、メーカーのマニュアルに従って市販のキットを用いて標識しました。 - 1 mMのDIOC 6（最終濃度1μM）の2μLを含むか、5 mMのカルセインAM（5μM最終濃度）の2μLを含む試験管内で再構成された血液の別の1ミリリットルを混ぜます。フィブリノゲンの血小板の2 mLの最終容量を与え、フィブリノゲンと血液を含むチューブにこれを追加し、tained血。
注：染料の選択は、研究課題や研究者5の好みに依存することができます。任意の色素の励起は、光化学アーチファクトを引き起こす可能性があることに注意してください。 - 静かに転倒混和します。 37℃で10分間、試料をインキュベートします。
- 試験管内アレクサフルオロ405標識フィブリノーゲン（70μgの/ mLの最終濃度）の10.7ミリグラム/ mL溶液のピペットで13μLと再構成された血液の1ミリリットルを追加します。
- 凝固バッファを準備
- HBS中の10mMのCaCl 2および3.75のMgCl 2を含む凝固バッファを準備します。 1チャネルの凝固緩衝液1mlを準備します。
- フィルター滅菌0.2μmのフィルターを通して凝固バッファを。 37°Cにこれを事前に温めます。
3.灌流アッセイ
- チャネルの底に付着したコラーゲン繊維への顕微鏡光学系の焦点を合わせます。位相コントラストまたは微分干渉コントラスト（DIC）を使用します。デジタル的に選択フォーカスを固定するための実験用ソフトウェアで「選択されたタイル領域に設定されている現在のZ "を選択します。
- 顕微鏡の収集ソフトウェアを使用して、選択したチャンネルに関心領域（ROI）を定義します。
注：ROIは任意に灌流チャネル内で選択した任意の表面積することができます。偏在血栓の画像を取得避けるために、入口と出口の近くに血栓形成とフィブリンの生成を分析しないようにお願いします。 ROIの表面積は、個々の血小板による信号変動のうち平準化を可能にするために血栓のかなりの数が含まれている必要があります。チャネルのxy平面におけるROIの位置が常に一定と灌流前に決定されます。必要に応じて、チャンネルのコーティングされていない部分は、血小板は、バイオチップのプラスチックに非特異的に結合するかどうかを決定するための分析に含めることができます。 - 灌流のためのサンプルを調製
- 灌流ポンプで予熱した凝固バッファの1 mLを含む1 mLシリンジをマウントします。
- 軽く2メートルを反転し、負荷によって予め温め再構成された血液を混ぜます2 mLシリンジでL。
- すべての空気が両方の注射器から除去し、シリンジコネクタピンを使って8 cmのチューブにそれぞれを接続していることを確認します。
- 総理コネクタと高速（400μL/分）で、両方の注射器のチューブとすべてが凝固緩衝液または血液で満たされている場合に停止します。
注：実験開始時にチューブをプライミングすることにより、凝固バッファおよび再構成された血液は直ちに灌流チャンバーへの空気の導入を避け、混合バイオチップのY字型チャンネルにミックスされます。
- ピンを使用して、混合バイオチップのY字型チャンネルの分割足の両方にチューブのもう一方の端を固定します。下部の脚は、凝固バッファおよび再構成された血液のための上肢を灌流するために使用されます。
- 凝固バッファ用の4.4μL/分、再構成された血液のために44μL/ minで灌流を開始することによって、実験を開始します。 perfuを可能にするために、廃液チューブの出口でコッヘルクランプを削除しますシオン。
注：流速が調査の質問に応じて変更することができます。実験の開始およびリアルタイム画像取得の開始との間の時間を決定するために、ストップウォッチを開始します。 - レコード画像顕微鏡の取得と実験ソフトウェアを使用して、リアルタイムで30分ごとに10秒。再構成された血液凝固バッファのミックスは、顕微鏡ステージ上に取り付けられたコーティングされたバイオチップに入ったときに録音を開始します。
注：他の時系列は、実験に応じて使用することができます。 100X倍率（10倍対物レンズと10倍レンズ）を使用します。
4.終端実験
- 信号が飽和している場合は、それ以前の30分後にポンプや画像の取得を終了しますか。すべてのチューブとシリンジを外し、バイオハザード廃棄物としてそれらを捨てます。
5.データ解析
- 血栓成長（緑色蛍光）およびフィブリン形成を決定します（紫色fluorescencE）画像解析ソフトウェアと動力学。次のコマンドは、ここで使用されているソフトウェアに特異的です：
- プラグインの処理を開きます時点ごとのサイドバイサイド画像をつなぎ合わせるステッチ 。
- 血小板の表面被覆率を決定するために、プラグインの画像解析を開きます 。
- プラグインのメジャーを開きます。すべての血栓およびフィブリン繊維を含む矩形領域を描画することでROIを定義します。このプロトコルでは、ROIは637ミリメートル2を測定する長方形です。
すべてのビューが記録されたすべての時間点を含むようにタブを選択します。 - 自動的に各時点の選択された矩形領域の平均蛍光強度の値が含まれたスプレッドシートを生成するために、 表の作成に使用します。
- xml形式でスプレッドシートを保存します。
- さらなる計算のためのスプレッドシートプログラムでスプレッドシートを開きます。
- 初期（backgrouを減算ND）すべてのデータの値。
- 緑（血小板）と紫（フィブリン）染料の両方の灌流時間の関数として蛍光シグナルをプロットします。
注：アカウントにポンプの初期化と画像取得の実際の出発点間の時間をかけてください。血栓形成は、一般的に、このモデルにおける二段階プロセスである：（1）血小板結合（両方の「急速」の増加（2）凝固駆動型血栓の成長に続いて、固定化コラーゲンへの血小板接着（ すなわち、接着）を「遅いです」 すなわち、蓄積）およびフィブリン沈着（ すなわち、凝固）（ 図1）。 - 線形回帰によって血小板付着及び蓄積の傾きを計算します。この傾きは、その形成の各段階における血小板血栓成長速度が得られます。
- フィブリン凝固の傾きを計算し、X軸を傍受するために、このラインを外挿する、発症の瞬間を決定します。
Representative Results
リアルタイムの生データの分析は、 図1に記載されています。まず、血小板が記録された緑色蛍光が着実に増加（ 図1A、i）で得られた、反応性表面に付着し、 付着性と呼ばれます。このフェーズでは、フィブリンがないか、またはわずかに（ 図1B）が形成されていることを示し、小さな紫色蛍光があります。 凝固の開始時、紫色蛍光フィブリン沈着急速に（III）、および血小板の蓄積 （ii）は、ここで指定されたほぼ同じ速度でその時間の間、血小板緑色蛍光が増大します。単一の実験は、このように、血小板およびフィブリン沈着は、このモデルで行われる速度のための代理マーカーとして蛍光増加（I、II、およびIII）の3率を返します。さらに、凝固開始（ モーメントの発症 （IV））の瞬間は、血小板の決定要因である、外挿する凝血促進の可能性。
TFの非存在下では、凝固開始が遅く、主に内因性テナーゼ複合体は、FXIおよび/またはFXIIによってFIX 6の直接の活性化を介してFXを活性化させる接触経路を介して実行されます。 FXII依存性を実証するために、トウモロコシトリプシン阻害剤（CTI）の4μMは、活性化FXII（たFXIIa）7を阻害するために添加しました。この阻害は、血小板の接着（ 図2A）には影響しませんでしたが、凝固は灌流実験（ 図2B及び補足ビデオ1）の任意に定義された合計時間のために起動しませんでした。
インビトロでは 、接触経路は、カオリンのような無機材料を用いて、ガラスのような、または臨床アッセイにおける異物によって開始することができます。 生体内では 、活性化された血小板は、負電荷8を提供します</ SUP>酸性リン脂質9の膜露光により、ホスファチジルセリンのような、および/またはポリリン酸のリリースを経て（ポリP）10、11。我々のマイクロ流体リアルタイムアッセイ模倣後者ので、血小板濃度の範囲内で、止血反応は、血小板数（ 図3）に依存します。再構成されたサンプル中の血小板の数を増加させることにより、密着性の割合（ 図3A）、蓄積（緑図3B）、及び凝固（ 図3B、紫色）が直線的に増加しました。モーメントの発症が有意に凝固を誘発するために必要とされる（活性化）の閾値数は、血小板を堆積することを示唆し、血小板の濃度を増加させることによって（ 図3C）を短くします。
インビボでの組織の損傷時に、しかしながら、TFを有する細胞がi意志Ca 2+の存在下でのFVIIa-TF外因性テナーゼ複合体を介して血液の凝固をnitiate。これは、脂質化rhTFでコラーゲン含有灌流チャンバーをポストコーティングすることによって私たちの実験で模倣されます。コラーゲンのみ、またはrhTFとの組み合わせででコーティングされたチャンネルのペアの分析では、凝固開始が大幅に高速化（ 図4A）でした。血小板接着の速度は、線形ではなかったので、何の線形回帰（データは示していない）を行うことができませんでした。どちらの凝固および血小板蓄積速度は、条件（ 図4B-4C、 補足動画2）との間に差はなかったです。
図1：マイクロ流体灌流チャンバーにおける血小板接着および凝集の回帰分析。この図は、リアルタイム蛍光生データから導出されたパラメータを明確に反応性表面上のカルシウム再血流中に取得しました。緑色蛍光の（A）平均強度は、灌流時間の関数における血小板沈着を示します。曲線は、（i）がゆっくりと（ii）は、急速に成長している線形の蓄積が続く線形血小板の接着を増加させることから始まる二峰性のプロセスを説明します。曲線の両方の線形部分は、退行し、これらの勾配は、血小板蛍光により血栓形成の2つのレートを記載しています。 （ⅰ）接着および（ii）の蓄積。 （B）紫色の蛍光強度の平均は、時間の関数としてのフィブリンの堆積を示します。それはすぐに凝固の次の開始を開発しながら、血小板の接着時には、紫色の蛍光は、本質的に存在しません。 （iv）のモーメントの発症は、 凝固として、ここで指定されたフィブリン蛍光による血栓形成の（iii）の第二相の外挿された線形回帰のx軸との切片として定義されています。EF = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55351/55351fig1large.jpg"ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：TFの非存在下では、コラーゲンでコーティングされた潅流チャンバー内凝固がたFXIIaによって異なります。 CTIまたは対照緩衝液（CONTROL）を含む再構成血液のマイクロ流体灌流、1000秒の剪断速度-1 30分の合計で行いました。 （A）血小板粘着率は（秒-1）CTIに依存しませんでした。 （B）モーメントの発症CTI処理サンプルのためには、このパラメータのたFXIIaへの依存性を実証し、（点線で示す）は、実験の30分の制限を超えていました。バーとドットが平均値である、ウィスカは標準偏差です。統計分析は、対応のあるt検定によって行いました。 （NS =有意ではない、のn≥3）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：流通下凝固は血小板数に依存します。マイクロ流体灌流実験は、Ca 2+の存在下で再構成血液と変化血小板濃度（N≥3）でコラーゲン被覆チャンバ内で行いました。 （A）レートは、血小板の蓄積（緑）、凝固（紫）、および（C）モーメントの発症の血小板接着（B）レートの再構成された、血液中の血小板濃度の関数として示されています。ドットは平均値であり、ウィスカーは標準偏差です。 より大きなversiを表示するには、こちらをクリックしてください。この図の上。
図4：両方TFと接触経路凝固の活性化は著しくモーメントの発症凝固を短縮します。 Ca 2+の存在下で、血液を再構成し、コラーゲン単独で、または単独の接触経路やコンタクトとTF経路の組み合わせを研究するためのコラーゲンとrhTFとでコーティングされたチャンバーを介して灌流しました。 （A）モーメントの発症凝固を有意にTFを含むフローチャンバーに短縮されます。 （B）凝固および（C）中の血小板の蓄積速度凝固の速度は、コラーゲンのみ、またはコラーゲンとrhTFコーティングされたフローチャンバーの間で有意差はありません。バーとドットが平均値です。ウィスカーは標準偏差です。統計分析は、対応のあるt検定によって行いました。 （NSは、* P <、有意ではありません= 0.05、nは≥3）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
補足ビデオ1：TFの非存在下では、コラーゲンでコーティングされた潅流チャンバー内凝固がたFXIIaによって異なります。連絡経路の役割は、コラーゲン被覆灌流チャンバーにおいて決定されます。 CTIの非存在下における血小板（緑）、フィブリン（フィブリノーゲン）（紫）の堆積の（A）オーバーレイ蛍光画像シーケンス。 （B）パネルAとしてではなく、緑のチャンネルがオフと同じ配列です。 （C）オーバーレイ血小板の蛍光画像シーケンス（緑）とCTIの存在下でフィブリン（フィブリノーゲン）（紫）の堆積。 （D）パネルCとしてではなく、緑のチャンネルがオフと同じ配列です。ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55351/Supplementary_video_1.avi "ターゲット=" _空白 ">このビデオをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。
補足動画2：TFと接触経路の両方の活性化が著しく凝固モーメントの発症を短縮します。 TFの役割を研究するために、単独で、コラーゲンまたはコラーゲンとrhTFで被覆されたフローチャンバーを使用しました。血小板（緑）、フィブリン（フィブリノーゲン）のみ、コラーゲンでコーティングされたフローチャンバー内（紫）の堆積の（A）オーバーレイ蛍光画像シーケンス。 （B）パネルAとしてではなく、緑のチャンネルがオフと同じ配列です。 （C）オーバーレイ血小板の蛍光画像シーケンス（緑）、コラーゲンとrhTFの両方でコーティングされたフローチャンバー内のフィブリン（フィブリノーゲン）（紫）の堆積。 （D）パネルCとしてではなく、緑チャンネルswitcと同じ順序オフHED。 このビデオをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。
Discussion
血小板輸血は、予防または出血を止めるために血小板減少症患者のために処方される濃縮物。その臨床的影響は、最近、60年代、70年代における小児患者の生存率の増加率は、（血小板）輸血医療の改善に主に起因していたことを想起し、急性白血病12の歴史的なレビューで強調されました。血小板濃縮物はまた、急性外傷または手術中の出血を止めるために使用されます。これらの条件では、急速に止血を開始する優れた凝固促進特性を有する血小板が好ましいが、血小板濃縮物は、自発的なドナーの寄付から調製されると、薬理学的な薬物療法とは異なり、だけではなく、（化学）組成によって準備することによって標準化されています。したがって、血液銀行の分野でいくつかの質問には、最適な寄付モダリティ、保存条件、輸血慣行上のものを含め、応答がありません。 PLの分野ではatelet（輸血）生物は、細胞の循環からのクリアランス、止血に輸血血小板の貢献、またはその免疫学上の多くの質問も未解決のまま。
血小板機能解析のための多数の実験技術が利用可能であるが、これらは主に凝集や脱顆粒13のように、血小板機能の特異側面に取り組みます。広く血小板および血小板濃縮物を評価するために、止血の包括的なモデルが不可欠であり、これらは流体力学を含める必要があります。血液レオロジーは、抗凝固療法は、Caを防ぎ2+および/またはトロンビンは、クエン酸塩またはヘパリン、それぞれ2の存在に参加する場合でも、正しく止血14、15または血栓症16時の血小板の挙動を解釈することが重要です。流れ17の下で、凝固および血小板機能間の相互作用を研究するために、同様に、 図18に示すように 、正常なトロンビン生成が要求され、従って、遊離Ca 2+。防止策「アーティファクト」または凝固の制御不能な活性化はできるだけ取られるべきであるため、これらの条件下で止血を研究するための実験は、複雑です。さらに、多くの専門の研究グループが使用するカスタムメイドのハードウェア19、20、実質的な研究室間のばらつきの原因となる5。このアプローチの典型的な制約は、矩形の容器、非拍動流プロファイル、および非ヒト表面コーティング5の使用です。ここで説明するアッセイは、商業的に利用可能なツールを使用するため、標準化に適してもよいです。
血液が人体内に含まれていない一度凝固カスケード反応を容易に活性化されているので、制御再石灰は極めて重要なステップです。 TCa 2+緩衝液が静的血液に大量に供給された場合、凝固は必然的に、最終的にチューブが詰まるとデータバイアス、行われるので、O、反応性コラーゲン表面上だけ灌流前に延期する必要があるの Ca 2+のこの加算を達成解釈（データは示さず）。この問題を解決するには、分析室へ向かう途中で灌流の間の対流と拡散力による混合を可能にする、別々のCa 2+緩衝液と血液を送り出すことです。完全な混合は、混合と分析室との間のチューブ46 cmのセグメントで実現されます。この長さは、試薬の最適な滞留時間を算出したが、使用流量で灌流中の質量および対流輸送21の基本法則（千秒-1）に基づいて混合します。このアプローチは、制御可能で再現性のあることが判明しました。
凝固の接触活性化は時々簡単なのアーティファクトと見られています血液サンプリングおよび凝固時間を解釈する際に回避すべき。したがって、我々は、阻害剤の非存在下で、接触誘発性凝固は、灌流の16.7分（±3.7分）で開始する、ことを実証しました。たFXIIa媒介接触活性化を阻害するためのCTIの存在下で、凝固実験（30分）の任意に定義された過程で開始されません。この実験のウィンドウには、プロまたは抗血栓あるサンプルを識別するのに十分な長さです。接触活性化による凝固が人工表面に接触し、血液の望ましくない結果であることができるにもかかわらず、我々のデータは、血小板の明確な生物学的線量効果を実証します。 FXII、血小板ポリリン酸10、ホスファチジルセリン分布22、および血小板微粒子に関する最近の調査結果は23が実際に 、止血に重要な貢献者として、電子を接触経路の凝固を再評価しているので、これは、輸血医療のために重要であり得ます特別に血栓24の文脈インチ成功した凝固は、これらの要因に依存することが示されている場合、例えば、患者における血小板輸血の可変収率またはバンク血小板の可変ホスファチジルセリンの発現は、このように治療効果の変動を誘導し得ます。
コラーゲンとrhTFを脂質化の同時固定化することによって、外因性凝固経路、またはTF経路は、コラーゲン上の血小板沈着の間に活性化されます。これは、TFを有する細胞や組織との接触に血液をもたらす傷害のモデルとして、その最も包括的なモードに分析を拡張します。我々のデータは、コラーゲンとTFとの共固定化は、凝固開始の瞬間を減少するが、凝固の速度を変化させないことを示しています。注目すべきは、表面に固定化されたrhTFの量は、このモデル25、26で重要な変数であると指定された研究の中に標準化されるべきです。 PRESENで接触活性化が防止されるので、CTIのCEが、TF経路が独占的に研究することができる（図示せず）。
結論として、我々の実験セットアップはバンク血小板と血小板減少症、血液の再構成および流体力学的流動下でのカルシウム依存性血小板沈着およびフィブリン形成による止血のモデルによる輸血のモデルを組み合わせたものです。このアッセイは、バンク血小板および血小板濃縮物の調製技術は、これに持っている効果の凝固促進性に関する質問に答えるために使用されます。
Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
この研究はベルギー赤十字・フランダース血液サービスの研究開発のための財団によってサポートされていました。契約番号BOF30290744でプロジェクトに付与されたゲント大学から - 私たちは、 "Bijzonder onderzoeksfond」（特別研究基金BOF）が提供する財政支援を認めます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Syringe | BD | A00434 | |
| 10 mL Syringe | BD | 309604 | |
| 2 mL Syringe | BD | 307727 | |
| Alexa Fluor 405 | Life Technologies | A30100 | The manufacturer's manual was followed for labeling of fibrinogen |
| BD vacutainer Eclipse | Becton, Dickinson and Company | 368650 | Blood collection needle with preattached holder |
| BD vacutainer tube with EDTA | Becton, Dickinson and Company | 368856 | |
| BD vacutainer tube with Sodium Citrate | Becton, Dickinson and Company | 366575 | |
| Blocking buffer | in house preparation | in house preparation | 1.0% (w/v) bovine serum albumin and 0.1% (w/v) glucose in HBS |
| Calcein AM | Molecular probes | C1430 | |
| Coagulation buffer | in house preparation | in house preparation | 10 mM CaCl2 and 3.75 mM MgCl2 in HBS |
| Conical tube 15 mL | Greiner bio-one | 1888271 | |
| Conical tube 50 mL | Greiner bio-one | 227261 | |
| Corn trypsin inhibitor (CTI) | Enzyme Research Laboratories | CTI | |
| Denaturated alcohol | Fiers | T0011.5 | |
| DiOC6 | Sigma-Aldrich | 318426 | 3,3′-Dihexyloxacarbocyanine iodide - 1 mM solution in DMSO |
| Exigo microfluidic pump | Cellix | EXIGO-PC-FS7.0-MF | |
| Fibrinogen | Sigma-Aldrich | F3879 | Labelled in house with AF 405 - stock concentration 10.7 mg/mL |
| Hematology analyzer | Sysmex | pocH-100i | |
| HEPES buffered saline (HBS) | in house preparation | in house preparation | 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) buffered saline (0.9% (w/v) NaCl), pH 7.4 |
| Horm Collagen | Takeda/Nycomed | 1130630 | Native equine tendon collagen (type I) Isotonic glucose solution to dilute collagen is supplemented |
| Humidified box | Cellix | HUMID-BOX | |
| Incubation water bath | GFL | 1013 | |
| Microscope | Zeiss | Axio Observer Z1 | equipped with a colibri-LED and high resolution CCD camera |
| Mirus Evo Nanopump | Cellix | 188-MIRUS-PUMP-EVO | with Multiflow8 |
| Pipette | Brand | A03429 | |
| Pipette tips 100-1000 | Greiner bio-one | 740290 | |
| Pipette tips 1-10 | Eppendorf | A08928 | |
| Pipette tips 2-200 | Greiner bio-one | 739280 | |
| Platelet concentrate orbital shaker | Helmer | PF-48i | |
| Precision wipes | Kimtech | 5511 | |
| Pepsin solution | Hanna instrument | HI7073L | 2 g pepsin per 75 mL solution, Protein cleaning solution with pepsin |
| Recombinant Human Tissue Factor Innovin | Dade Berhing | B4212-40 | rhTF with synthetic phospholipids |
| Software microscope | Zeiss | N/A | ZEN 2012 |
| Sterile docking device | Terumo BCT | TSCD | |
| Table Top Centrifuge | Eppendorf | 521-0095 | |
| Tube Roller | Ratek | BTR5-12V | |
| Tubing Sealer | Terumo BCT | AC-155 | |
| Vena8 syringe connector pin | Cellix | CONNECTORS-B1IC-PACK100 | |
| Vena8 Fluoro+ Biochips | Cellix | 188V8CF-400-100-02P10 | Coated biochip |
| Vena8 Needles | Cellix | SS-P-B1IC-B1OC-PACK200 | |
| Vena8 Tubing | Cellix | TUBING-TYGON-B1IC-B1OC-ROLL 100F | |
| VenaDelta Y1 Biochips | Cellix | VDY1-400-100-01-02 | Mixing biochip |
| Vortex mixer | VWR | 58816-121 | |
| ZEN2012 software | Zeiss |
References
- Levi, M., Hunt, B. J. A critical appraisal of point-of-care coagulation testing in critically ill patients. J. Thromb. Haemost. 13 (11), 1960-1967 (2015).
- Van Aelst, B., Feys, H. B., Devloo, R., Vandekerckhove, P., Compernolle, V. Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro. J. Vis. Exp. (109), e53823 (2016).
- Witt, S. M., et al. Identification of platelet function defects by multi-parameter assessment of thrombus formation. Nat. Commun. 5, 4257 (2014).
- Cazenave, J. P., et al. Preparation of washed platelet suspensions from human and rodent blood. Methods Mol. Biol. 272, 13-28 (2004).
- Roest, M., et al. Flow chamber-based assays to measure thrombus formation in vitro: requirements for standardization. J. Thromb. Haemost. 9 (11), 2322-2324 (2011).
- Zwaal, R. F., Comfurius, P., Bevers, E. M.
- Dargaud, Y., Luddington, R., Baglin, T. P. Elimination of contact factor activation improves measurement of platelet-dependent thrombin generation by calibrated automated thrombography at low-concentration tissue factor. J. Thromb. Haemost. 4 (5), 1160-1161 (2006).
- Bevers, E. M., et al. Defective Ca(2+)-induced microvesiculation and deficient expression of procoagulant activity in erythrocytes from a patient with a bleeding disorder: a study of the red blood cells of Scott syndrome. Blood. 79 (2), 380-388 (1992).
- Bevers, E. M., Comfurius, P., van Rijn, J. L., Hemker, H. C., Zwaal, R. F. Generation of prothrombin-converting activity and the exposure of phosphatidylserine at the outer surface of platelets. Eur. J. Biochem. 122 (2), 429-436 (1982).
- Muller, F., et al. Platelet polyphosphates are proinflammatory and procoagulant mediators in vivo. Cell. 139 (6), 1143-1156 (2009).
- Smith, S. A., et al. Polyphosphate modulates blood coagulation and fibrinolysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (4), 903-908 (2006).
- Tiberghien, P., Follea, G., Muller, J. Y.
- Deckmyn, H., Feys, H. B. Assays for quality control of platelets for transfusion. ISBT Science Series. 8 (1), 221-224 (2013).
- Sakariassen, K. S., Bolhuis, P. A., Sixma, J. J. Human blood platelet adhesion to artery subendothelium is mediated by factor VIII-Von Willebrand factor bound to the subendothelium. Nature. 279 (5714), 636-638 (1979).
- Alevriadou, B. R., et al. Real-time analysis of shear-dependent thrombus formation and its blockade by inhibitors of von Willebrand factor binding to platelets. Blood. 81 (5), 1263-1276 (1993).
- Nesbitt, W. S., et al. A shear gradient-dependent platelet aggregation mechanism drives thrombus formation. Nat. Med. 15 (6), 665-673 (2009).
- Stalker, T. J., et al. Hierarchical organization in the hemostatic response and its relationship to the platelet-signaling network. Blood. 121 (10), 1875-1885 (2013).
- Swieringa, F., Kuijpers, M. J., Lamers, M. M., vander Meijden, P. E., Heemskerk, J. W. Rate-limiting roles of the tenase complex of factors VIII and IX in platelet procoagulant activity and formation of platelet-fibrin thrombi under flow. Haematologica. 100 (6), 748-756 (2015).
- McDonald, J. C., et al.
- Gutierrez, E., et al. Microfluidic devices for studies of shear-dependent platelet adhesion. Lab. Chip. 8 (9), 1486-1495 (2008).
- Hartman, R. L., McMullen, J. P., Jensen, K. F. Deciding whether to go with the flow: evaluating the merits of flow reactors for synthesis. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 50 (33), 7502-7519 (2011).
- Podoplelova, N. A., et al. Blood coagulation factors bound to procoagulant platelets are concentrated in their cap structures to promote clotting. , Blood. (2016).
- Der Meijden, P. E. V. an, et al. Platelet- and erythrocyte-derived microparticles trigger thrombin generation via factor XIIa. J. Thromb. Haemost. 10 (7), 1355-1362 (2012).
- Nickel, K. F., et al. The polyphosphate-factor XII pathway drives coagulation in prostate cancer-associated thrombosis. Blood. 126 (11), 1379-1389 (2015).
- Okorie, U. M., Denney, W. S., Chatterjee, M. S., Neeves, K. B., Diamond, S. L. Determination of surface tissue factor thresholds that trigger coagulation at venous and arterial shear rates: amplification of 100 fM circulating tissue factor requires flow. Blood. 111 (7), 3507-3513 (2008).
- Shen, F., Kastrup, C. J., Liu, Y., Ismagilov, R. F. Threshold response of initiation of blood coagulation by tissue factor in patterned microfluidic capillaries is controlled by shear rate. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 28 (11), 2035-2041 (2008).
