En mikroflödessystem Flow avdelningen modell för Platelet Transfusion och Hemostas Åtgärder blodplättbeläggning och fibrinbildning i realtid

Summary

Detta dokument beskriver en experimentell modell av hemostas som samtidigt mäter trombocytfunktionen och koagulation. Trombocyter och fibrin fluorescens mäts i realtid, och trombocytadhesion hastighet, koaguleringshastigheten, och uppkomsten av koagulering bestäms. Modellen används för att bestämma blodplätts prokoagulerande egenskaper under flöde i koncentrat för transfusion.

Abstract

Mikroflödesmodeller hemostas bedömer trombocytfunktionen under förhållanden med hydrodynamisk skjuvning, men i närvaro av antikoagulantia är denna analys begränsad till blodplättbeläggning endast. Den intrikata relationen mellan Ca2 ⁺ -beroende koagulation och trombocytfunktionen kräver noggrann och kontrollerad rekalcifiering av blod före analys. Vår inställning använder en Y-formad blandningskanal, som levererar koncentrerad Ca2 ⁺ / Mg2 ⁺ buffert till strömmande blodet just före perfusion, vilket möjliggör snabb rekalcifiering utan prov stasis. En tio-faldig skillnad i strömningshastigheten mellan de båda reservoarerna minimerar utspädning. Den recalcified blodet sedan perfusion i en kollagenbelagd analyskammaren, och differentierad märkning tillåter realtid avbildning av både trombocyter och fibrin avsättning med hjälp av fluorescens video mikroskopi. Systemet använder endast kommersiellt tillgängliga verktyg, vilket ökar chanserna för standardisering. Rekonstitution av thrombocytopenic blod med blodplättar från bankas koncentrerar dessutom modeller trombocyttransfusion, bevisar dess användning i detta forskningsområde. Exempel på data visade att koagulation debut och fibrinavsättning var linjärt beroende av koncentrationen av blodplättar, vilket bekräftar sambandet mellan primär- och sekundär hemostas i vår modell. Inom en tidsram av 16 perfusion min, gjorde kontaktaktivering inte ske, trots rekalcifiering till normal Ca2 ⁺ och Mg ^{2 +} nivåer. När koagulationsfaktor Xlla inhiberades av majs trypsininhibitor, denna tidsram var ännu längre, vilket indikerar en betydande dynamiskt område där förändringarna i den prokoagulerande naturen av blodplättarna kan bedömas. Co-immobilisering av vävnadsfaktor med kollagen signifikant reducerade till debut på koagulation, men inte dess hastighet. Alternativet att studera vävnadsfaktor och / eller kontaktvägen ökar mångsidigheten och nyttan av analysen.

Introduction

Primär och sekundär hemostas ursprungligen conceptualized som två relativt separerbara biokemiska processer. Primär hemostas sågs som en viktig bidragsgivare i artärflödesförhållanden, med en nyckelroll för blodplättar, medan den sekundära hemostas sågs dominera koagulation enligt venösa blodflödet, vilket gör att proteaset kaskad för att bilda olösligt fibrin. De senaste decennierna har förändrat denna traditionella uppfattning avsevärt, erkänner att blodplättaktivering och koagulation är beroende av varandra och är lika viktiga processer under fysiologiska och patologiska hemostas i alla (icke-extrem) hydrodynamiska miljöer. Denna uppfattning har översatts till kliniken, där analyser utformats att övergripande mäta hela-blodkoagulering används alltmer, om än med många återstående frågor om relevans, användbarhet och nytta ^en.

Vi publicerade nyligen en funktionell analys av blodplättarkoncentrat med användning av mikroflödessystem flödeskammare belagda med fibrillärt kollagen i en modell av transfusion ² in vitro, med prover som innehåller normala mängder av röda blodkroppar, plasma och blodplättar. Denna metod använder heparin eller hirudin antikoagulerat blod, vilket innebär ingen eller begränsad inblandning av sekundär hemostas, som är beroende av trombin och joniserat kalcium (Ca2 ^+). För att stödja trombinbildning och således omfatta alla aspekter av hemostas enligt mikroflödesflöde, utvecklade vi en kompletterande metod på samma tekniska plattform, nu inklusive gratis Ca2 ^+. På detta sätt kan studeras blodplättbeläggning och fibrinbildning, återigen i en modell av blodplättstransfusion, för att bedöma blodplättskoncentrat kvalitet.

I denna metod, är blodplättar och fibrinogen märkt med fluoroforer som fullständigt har separerade emissionsspektra. Dubbel färg, video i realtid mikroskopi tillåter då analysen avprimär trombocytadhesion, liksom koagulering initiering och fibrinavsättning. En viktig variabel i denna typ av analys är rekalcifiering, eftersom tillsatsen av Ca ²⁺ till statisk blod, före perfusion, kommer oundvikligen att orsaka kontaktinitierad koagulation i behållaren. Denna initiering kommer förspänna avläsning på grund av igensättning av rör och biochip inlopp före perfusion. Därför, i vår metod, citrat antikoagulerat blod och en Ca2 ⁺ -innehållande buffert pumpas separat genom de övre benen hos en Y-formad inloppskammare. Komponenterna blandas under perfusionen innan en analyskammare belagd med enbart eller i kombination med rekombinant human vävnadsfaktor (rhTF) kollagen. Genom att anpassa flödeshastigheter för de separata pumpar och koncentrationen av Ca2 ⁺ i bufferten, en 10% utspädning av det slutliga provet blod äger rum.

Med hjälp av denna utökade protokollet visar vi bidrag koagulattionsfaktor XII (FXII) och blodplättskoncentration att kontakta vägen koagulation initiering i flödet. Våra data visar också att genom att belägga rhTF tillsammans kollagen, kan vävnadsfaktorreaktionsvägen mätas samtidigt.

Protocol

Detta protokoll följer de institutionella etiska riktlinjer för forskning på mänskliga prover, och informerat samtycke erhölls från alla givare inblandade. Godkännande av de experiment som beskrivs här erhölls från Institutional Review Board i Antwerpen Universitetssjukhuset (godkännandenummer 16/10/120). OBS: Temperatur indikationer är alltid rumstemperatur, om inte annat anges. 1. Microfluidics Setup Förbered mikroflödessystem flödeskammarkanaler, slangar och anslutningsstift Resuspendera kollagen lager flaskan genom att vortexa och späd sedan i isoton glukoslösning som tillhandahålls av tillverkaren till en slutlig koncentration av 50 mikrogram / ml. OBS: Använd häst senkollagen, huvudsakligen består av typ I fibriller. Hästkollagen typ I är ofta kallad "Horm" kollagen och är den gyllene standarden för denna typ av analys, för både historiska ochbiologiska skäl. Human typ III kollagen kan också användas, men dessa fibriller päls sämre, och svar trombocyter är inte lika stark. Andra beläggning av ytor kan också användas, såsom von Willebrands faktor, fibrinogen, fibronektin, laminin, vitronektin, trombospondin-1, eller kombinationer av dessa tre. Ta en ny, engångs mikroflödes biochip med åtta raka, parallella kanaler och dimensioner, i mm, av 0,4 B x 0,1 H x 20 L. Pipettera 0,8 mikroliter av kollagen in i kanalen (-erna) av biochip i ena änden och märka detta som utloppet. Fyll bara 5/6 av kanalens längd så att kollagenfibriller inte lackeras i kanalinloppet, eftersom det kan orsaka igensättning, vilket hindrar en effektiv perfusion. Inkubera biochip vid 4 ° C under åtminstone 4 h i en fuktad och förseglad behållare. Att studera vävnadsfaktor (yttre) -medierad koagulation i kombination med kontaktvägen (inneboende), belägga kanaler med collagen och rekombinant human vävnadsfaktor (rhTF). Späd rhTF i 10 mM 4- (2-hydroxietyl) -1-piperazinetansulfonsyra (HEPES) -buffered saltlösning (HBS; 0,9% (vikt / volym) NaCl, pH 7,4, 1: 3000, stamkoncentration: 4,5 nM). Ta bort kollagenbeläggningslösning via utloppet. Pipettera 0,8 mikroliter av rhTF i HBS (utspädning 1/500 av förrådskoncentration, slutkoncentration: 9:00) in i utloppet hos kanalen, att fylla 5/6 av kanalens längd, som liknar det kollagenbeläggningsstrategi. Inkubera biochip under ytterligare 30 min i en fuktad och förseglad behållare. Fyll de belagda kanaler med blockeringsbuffert (1,0% (vikt / volym) bovint serumalbumin och 0,1% (vikt / volym) glukos i HBS), utgående från den andra änden (märkt som inloppet). Fyll ett lika stort antal Y-formade kanaler med samma blockerande buffert i en blandnings biochip. Se till att alla kanaler och kanalarmar är helt fyllda med blockeringsbuffert. Inkubera både biochips under åtminstone 1 h i en fuktad och förseglad behållare. För varje kanal som används, förbereda två rör 8 cm lång, en 2 cm lång och en 46 cm lång. Placera ett stift i en ände av tre mindre rör och i båda ändar av den längsta slangen. Förbered sköljpumpen Skölj alla pump fluidik och anslutna slangar med destillerat vatten. Avfetta biochip är gjutning med en precision dammfri torka och denaturerad alkohol för att avlägsna tryck och damm. Fyll alla slangar med blockerande buffert innan du ansluter dem till biochips. Fäst belagda biochip på automatiserade mikroskop scenen. Fixa blandnings biochip på samma höjd som mikroskop scenen med användning av en laboratorie scissor jack. Anslut den belagda biochip med blandnings biochip med den längsta slangen, 46 cm lång. Se till att båda biochips är på ett avstånd så att slangen bildar en flexibel men rak linje. </li> Fästa en spruta anslutningsstift in i Luer-kompatibel slang av skölj- pumpen. Ansluta den till den fria änden av den 2-cm rör och fixera den andra änden till utloppet av den belagda biochip. Fäst två 8-cm slang till blandnings biochip inloppet med hjälp av stiften. Sätt den fria änden av varje rör i en injektionsflaska med HBS. Skölj alla slangar och alla kanaler med 1 ml HBS. OBS: HBS strömmar från flaskan genom 8-cm slang till blandnings chip och genom den 46-cm slang till den belagda chipet (som strömmar från den obelagda till den belagda delen) på grund av dragkraften av skölj- pumpen. Detta steg avlägsnar den blockerande bufferten och dåligt vidhäftade kollagen (eller rhTF i dubbelbelagda biochips). Förbered perfusion pumpar Öppna drivrutinerna för perfusion pumpar. Initiera pumparna genom att dubbelklicka på ikonen sprutor i programvaran. Välj den typ av spruta som ska användas: 1 ml sprutor för koagulation BUffer och 2 ml sprutor för den färdigställda blod. Anslut sprutorna till biochip konstruktion Koppla bort sköljpumpen och alla slangar, med undantag för en förbinder de två biochips. Den bortkopplade slangar återanvänds i följande steg. Anslut 2-cm slang med dess spruta anslutningsstiftet till Luer-låset av ett tjockväggigt avfallsslangen. Fylla det tjockväggiga slangar med standardpepsinlösning med användning av en spruta. OBS: Tillägget av pepsin till avfallsslang hämmar och lyserar efter perfusion koagulering och förhindrar därmed igensättning av systemet vid den bakre änden. Säkra den öppna änden av det tjockväggiga rör med en Kocher klämma. Placera en lämplig avfallsbehållare med blekmedel under för att samla genomströmning. Fixera slangen med dess tapp till utloppet av den belagda biochip. 2. Framställning av blodprover Samla blod från en frisk frivillig och separera dess komponenter 4 Samla in blod i en evakuerad etylendiamin-tetraättiksyra (EDTA) behållare. Använd detta prov endast för att utföra en fullständig blodstatus (CBC) med hjälp av en automatiserad hematologianalysator. Samla in blod i evakuerade natriumcitrat behållare. 5 ml blod krävs per kanal. Placera provet (s) på en horisontell rotator i avvaktan på blod beredning. OBS: Analysen bör vara avslutad inom 3 h från flebotomi. Trombocytkoncentrat och hel-blodprover är ABO / RhD blodgrupp matchas. Centrifugera i 13 min vid 250 xg för att bereda blodplättsrik plasma (PRP). Använd inte centrifugbroms för att förhindra störning av den löst packade pelleten. Överför PRP till ett nytt koniskt centrifugrör. Centrifugera i 10 min vid 4500 xg (med broms) för att pelletera blodplättarna och förbereda blodplättsfattig plasma (PPP). Släng platElet pellet. Inkubera PPP i ett vattenbad vid 37 ° C. Överföra de packade röda blodkropparna till ett färskt koniskt rör genom perforering av botten av den ursprungliga ett med en 21 G nål. OBS: Den kvarvarande blodplättsräkning i den packade röda cellfraktionen är 11 ± 4 x 10 3 per mikroliter (medel ± SD, n = 10). rekonstituera blod Bestämma hematokrit av de packade röda blodkropparna som framställts i steg 2.1.6 med användning av en automatisk hematologianalysator. Bestämma koncentrationen av blodplättskoncentrat som kommer att användas för analys med användning av en automatiserad hematologianalysator trombocyter. Beräkna volymen av packade röda blodkroppar, blodplättskoncentrat, och PPP som kommer att ge en 40% hematokrit och 250 x 10 3 trombocyter / | il i en 2,5 ml slutlig volym. Blanda dessa att förbereda rekonstituerad blod och utför en CBC. OBS: Andra mål titer av celler kan användas, beroende på the forskningsfråga. Förbered en "blank" kontrollprov i vilket volymen av blodplättskoncentrat ersätts med samma volym av koksaltlösning för att bestämma koncentrationen av "endogena" blodplättar (dvs icke-blodbanksplättar). Märka den rekonstituerade blod för blodplättar och fibrinogen Pipettera 13 mikroliter av en 10,7 mg / ml lösning av Alexa Fluor 405-märkt fibrinogen (70 mikrogram / ml slutlig koncentration) i ett provrör och tillsätt 1 ml rekonstituerat blod. OBS: Fibrinogen märktes med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt kit enligt tillverkarens manual. Blanda ytterligare 1 ml färdig blod i ett provrör innehållande 2 | il av 1 mM DiOC 6 (1 ^ M slutlig koncentration) eller innehållande 2 | il av 5 mM Calcein AM (5 | iM slutlig koncentration). Lägg till detta att röret innehållande blodet med fibrinogen, vilket ger en slutlig volym på 2 mL platelet- och fibrinogen-shålls blod. OBS: Valet av färg kan bero på frågeställningen eller föredrar forskaren 5. Var medveten om att excitering av varje färg kan orsaka foto artefakter. Blanda försiktigt genom att vända. Inkubera provet under 10 min vid 37 ° C. Förbered koagulation buffert Förbereda koagulering buffert innehållande 10 mM CaCl2 och 3,75 mM MgCl2 i HBS. Förbereda 1 ml för koagulation buffert för en kanal. Filtrera-sterilisera koagulation buffert genom ett 0,2 pm filter. Pre-värma detta till 37 ° C. 3. Perfusion Assay Fokusera mikroskopoptik till kollagenfibrerna vidhäftade till botten av kanalen. Använd faskontrast eller differentialinterferenskontrast (DIC). Välj "Ställ in aktuell Z för utvalda kakel regioner" i försöket programvara för att digitalt korrigera den valda fokus. Definiera ett område av intresse (ROI) i den valda kanalen med hjälp av förvärv programvara av mikroskopet. OBS: ROI kan vara vilken yta godtyckligt vald inom en perfusion kanal. Det rekommenderas inte att analysera blodproppsbildning och fibrin generation nära inlopp och utlopp för att undvika att förvärva bilder av ojämnt fördelad tromber. ROI ytan bör innehålla ett stort antal av tromber för att möjliggöra utjämning av signal variabilitet av enskilda blodplättar. Placeringen av ROI i xy-planet av kanalen är alltid fixerad och bestäms före perfusion. Vid behov kan den obelagda delen av kanalen ingå i analysen för att bestämma om blodplättar binder ospecifikt till biochip plast. Framställning av prover för perfusion Montera en 1 ml spruta innehållande 1 ml av förvärmd koagulering buffert i perfusion pump. Blanda förvärmda rekonstituerade blod genom att försiktigt vända och last 2 mL i en 2 ml spruta. Se till att alla luft avlägsnas från båda sprutorna och anslut dem till en 8-cm slang med en spruta anslutningsstift. Prime kontakterna och slangar av båda sprutorna med hög hastighet (400 ml / min) och stoppa när allt är fylld med koagulering buffert eller blod. OBS: Genom att priming slangen, kommer koaguleringen buffert och rekonstituerades blod omedelbart blandas i den Y-formade kanalen i blandnings biochip vid start av experimentet, undvika införandet av luft till perfusionskammare. Med användning av stift, fixera den andra änden av både slangen till de delade benen på den Y-formade kanalen i blandnings biochip. Den nedre benet används för perfusion koagulering buffert och övre ben för beredda blod. Starta experimentet genom att initiera perfusion vid 4,4 ml / min för koagulering buffert och 44 pl / min för rekonstituerad blod. Avlägsna Kocher klämman vid utloppet av avfallet slangen för att medge perfusionen. OBS: Flödeshastighet kan ändras beroende på forsknings fråga. Starta ett stoppur för att bestämma tiden mellan inledandet av experimentet och början av realtidsbildtagning. Spela in bilder var 10 s för 30 minuter i realtid med hjälp av förvärv och experimentera programvara mikroskopet. Starta inspelningen när blandningen av rekonstituerade blod och koagulation buffert in i belagda biochip monterad på mikroskop scenen. OBS: Andra tidsserie kan användas beroende på försöksuppställningen. Använd en 100 gångers förstoring (10X objektiv och 10X objektiv). 4. Avslutnings Experiment Avsluta pumpar och bildförvärv efter 30 min eller tidigare, om signalen är mättad. Lossa alla slangar och sprutor och kasta dem som biologiskt avfall. 5. Dataanalys Bestäm tromb tillväxt (grön fluorescens) och fibrinbildning (violett fluorescence) kinetik med bildanalysmjukvara. Följande kommandon är specifika för den programvara som används här: Öppna plugin Processing: sy att sy sida vid sida bilder per tidpunkt. Öppna plugin bildanalys för bestämning av yttäckningen av blodplättarna. Öppna plugin Mät. Definiera ROI genom att rita en rektangel regionen, inklusive alla tromboser och fibrin fibrer; i detta protokoll, är ROI en rektangel som mäter 637 mm 2. Välj fliken alla vyer till att omfatta alla inspelade tidpunkter. Använd Skapa tabeller för att automatiskt generera ett kalkylark som innehåller den genomsnittliga fluorescensintensitetsvärdet för den valda rektangeln regionen varje tidpunkt. Spara kalkylblad i XML-format. Öppna ett kalkylblad i ett kalkylprogram för ytterligare beräkningar. Subtrahera den initiala (backgrouND) värdet av alla data. Plotta den fluorescerande signal som en funktion av perfusionen tid för både den gröna (trombocyter) och de violetta (fibrin) färgämnen. OBS: Ta hänsyn till tiden mellan pump initiering och själva utgångspunkten för bildtagning. Trombbildning är i allmänhet en tvåstegsprocess i denna modell: (1) "långsam" trombocytvidhäftning (dvs., vidhäftning) till immobiliserat kollagen följt av (2) koagulering driven trombtillväxt med en "snabb" ökning av både blodplättsbindande ( dvs ackumulering) och fibrinavsättning (dvs koagulering) (Figur 1). Beräkna lutningen på trombocytadhesion och ackumulering av linjär regression; denna lutning ger trombocyter trombtillväxt kinetik i varje fas av dess bildande. Beräkna lutningen av fibrin koagulation och extrapolera denna linje att avlyssna X-axeln, bestämma tidpunkten för insättande.

Representative Results

Analysen av realtidsrådata beskrivs i figur 1. Först, trombocyter vidhäftar till den reaktiva ytan, vilket resulterar i en stadig ökning av inspelade grön fluorescens (figur 1 A, i), som kallas vidhäftning. Under denna fas, det finns lite violett fluorescens, vilket indikerar att fibrin är inte eller endast marginellt bildas (Figur 1B). Vid initiering av koagulation, violett-fluorescerande fibrinavsättningar snabbt (iii), och under den tiden, trombocyter grön fluorescens ökar i ungefär samma takt som här ackumulering av blodplättar (ii). En enda experiment återvänder alltså tre priser av fluorescensökning (I, II och III) som en surrogatmarkör för hastigheten vid vilken avsättning av trombocyter och fibrin sker i denna modell. Vidare är ett ögonblick av koagulering insättande (moment-of-debut (iv)) extrapoleras, vilket är en avgörande faktor för blodplättprokoagulerande potential. I frånvaro av TF, är koagulation initiering långsam och löper genom kontaktvägen där den inneboende tenase komplexet aktiverar FX via direkt aktivering av FIX 6 genom FXI och / eller FXII främst. För att demonstrera FXII beroende, 4 iM av majs trypsininhibitor (CTI) tillsattes för att inhibera aktiverad FXII (FXIIa) 7. Denna hämning påverkade inte trombocytvidhäftning (Figur 2A), men koagulering startade inte för godtyckligt definierade totala tiden för perfusion experimentet (figur 2B och kompletterande Video 1). In vitro, kan kontaktvägen initieras av främmande material som glas, eller i kliniska analyser med användning av ett mineralmaterial som kaolin. In vivo aktiverade blodplättar ger den negativa laddningen 8 </ sup> genom membranet exponering av sura fosfolipider 9, som fosfatidylserin, och / eller genom frisättning av polyfosfater (polyp) 10, 11. Våra mikroflödesrealtidsanalys härmar de senare eftersom, i ett intervall av blodplättskoncentrationer, den hemostatiska reaktionen var beroende av antalet blodplättar (figur 3). Genom att öka antalet blodplättar i det rekonstituerade provet, graden av adhesion (figur 3A), ackumulation (Figur 3B, grön), och koagulering (figur 3B, violett) ökade linjärt. Ögonblicket-of-debut avsevärt förkortad (Figur 3C) genom att öka blodplättskoncentration, vilket tyder på att en tröskel antal (aktiverad) avsatta trombocyter krävs för att utlösa koagulation. Vid vävnadsskada in vivo, men TF-bärande celler kommer jagnitiate koagulering av blod via FVIIa-TF extrinsic tenase komplexet i närvaro av Ca 2 +. Detta imiteras i vår experimentuppställning med post-beläggning av kollageninnehållande perfusion kammare med lipiderade rhTF. I en ihopkopplad analys av kanaler belagda med enbart eller i kombination med rhTF kollagen, koagulation debut var signifikant snabbare (Figur 4A). Hastigheten för trombocytvidhäftning var inte linjärt, så ingen linjär regression skulle kunna utföras (data ej visade). Både graden av koagulering och ackumulering av blodplättar var inte annorlunda mellan förhållanden (Figur 4B-4C Kompletterande Video 2). Figur 1: Regressionsanalys av trombocytvidhäftning och koagulation i mikroflödes perfusion kammare. Denna siffra klargör de parametrar som härrör från realtidsfluorescensrådata förvärvats under recalcified blodflödet över en reaktiv yta. (A) Medelvärde intensitet av grön fluorescens visar blodplättbeläggning i funktion av perfusion tid. Kurvan beskriver en bimodal process som börjar med (i) långsamt ökande linjär trombocytadhesion följt av (ii) snabbt växande linjär ackumulering. Både linjära delarna av kurvan är tillbakabildades och lutningen av dessa beskriver de två hastigheter av trombbildning genom plätt fluorescens; (I) vidhäftning och (ii) ackumulering. (B) medelintensiteten för violett fluorescens visar avsättning av fibrin i funktion av tiden. Under trombocytadhesion, är violett fluorescens i huvudsak frånvarande, medan det snabbt utvecklar följande initiering av koagulering. Den (iv) moment-of-debut definieras som skärningen med x-axeln för den extrapolerade linjär regression av (iii) den andra fasen av trombbildning genom fibrin fluorescens som här motsvarar koagulering.ef = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55351/55351fig1large.jpg" target = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra. Figur 2: I avsaknad av TF, koagulation i kollagenbelagda perfusion flödeskammare beror på FXIIa. Mikroflödes perfusion av rekonstituerade blod som innehåller CTI eller kontrollbuffert (KONTROLL) utfördes vid en skjuvhastighet av 1000 s-1 under totalt 30 min. (A) Graden av trombocytvidhäftning (s -1) inte var beroende av CTI. (B) Ögonblicket-of-debut för CTI-behandlade proverna var bortom 30 min gräns av experimentet (visad som en streckad linje), vilket visar beroendet av FXIIa av denna parameter. Barer och prickar är medelvärden, whiskers är standardavvikelse. Statistisk analys var genom parat t-test. (NS = ej signifikant, n ≥3). Klicka här för att se en större version av denna siffra. Figur 3: Koagulering enligt flödet beror på antal trombocyter. Mikroflödes perfusion experiment utfördes i kollagenbelagda kamrarna med rekonstituerade blod i närvaro av Ca2 + och varierande koncentrationer av blodplättar (n ≥3). (A) Andel trombocytadhesion (B) hastighet trombocyter ackumulering (grön) och koagulering (violett) och (C) ögonblick av debuterande visas som funktion av koncentrationen av blodplättar i rekonstituerade blod. Punkter är medelvärden, whiskers är standardavvikelser. Klicka här för att se en större versipå denna siffra. Figur 4: Aktivering av både TF och kontaktvägen koagulation förkortar avsevärt ögonblick av debuterande av koagulering. Rekonstituerade blod, i närvaro av Ca2 +, perfunderades genom kamrarna belagda med enbart eller med kollagen och rhTF att studera ensam kontaktvägen eller en kombination av kontakt- och TF vägar kollagen. (A) ögonblick av debut av koagulering avsevärt förkortas TF-innehållande flöde kammare. (B) Graden av ackumulering av blodplättar under koagulation och (C) graden av koagulering är ingen signifikant skillnad mellan kollagen enbart eller collagen- och rhTF-belagda flödeskammare. Barer och prickar är medelvärden; whiskers är standardavvikelser. Statistisk analys var genom parat t-test. (NS = ej signifikant, * P < 0,05, n ≥3). Klicka här för att se en större version av denna siffra. Kompletterande Video 1: I avsaknad av TF, koagulation i kollagenbelagda perfusion flödeskammare beror på FXIIa. Den roll som kontaktvägen bestäms i kollagenbelagda perfusion flödeskamrarna. (A) överlagrade fluorescens bild sekvens av blodplätt (grön) och fibrin (ogen) (violett) avsättning i frånvaro av CTI. (B) samma sekvens som panel A, men med den gröna kanalen avstängd. (C) överlagrade fluorescens bildsekvens av blodplättar (grön) och fibrin (ögen) (violett) avsättning i närvaro av CTI. (D) samma sekvens som panel C, men med den gröna kanalen avstängd.ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55351/Supplementary_video_1.avi "target =" _ blank "> Klicka här för att ladda ner video. Kompletterande Video 2: Aktivering av både TF och kontaktvägen förkortar avsevärt koagulering ögonblick av debuterande. För att studera betydelsen av TF, var flödeskammare belagda med enbart eller med kollagen och rhTF kollagen används. (A) överlagrade fluorescens bildsekvens av blodplättar (grön) och fibrin (ögen) (violett) deponering i flödeskammare belagda endast med kollagen. (B) samma sekvens som panel A, men med den gröna kanalen avstängd. (C) överlagrade fluorescens bild sekvens av blodplätt (grön) och fibrin (ogen) (violett) deponering i flödeskamrarna belagda med både kollagen och rhTF. (D) samma sekvens som panel C, men med den gröna kanalen switched av. Klicka här för att ladda ner video.

Discussion

Transfusion av blodplättkoncentrat är föreskriven för trombocytopenisk patienten för att förhindra eller stoppa blödningar. Dess kliniska effekt har nyligen lyfts fram i en historisk genomgång av akut leukemi ¹² och erinrar om att ökad överlevnad för pediatriska patienter i sextiotalet och sjuttiotalet var stor del tillskrivas förbättringar i (trombocyter) transfusionsmedicin. Blodplättkoncentrat används också för att hejda blödning vid akut trauma eller under kirurgi. Under dessa förhållanden är trombocyter med utmärkta prokoagulerande egenskaper som snabbt initierar hemostas föredra, men blodplättskoncentrat framställs från donationer av frivilliga blodgivare och, till skillnad från farmakologisk medicinering, är standardiserade av förberedelse bara, inte av (kemiska) sammansättning. Därför flera frågor inom blodbanker är obesvarade, bland annat på optimala donationsformer, lagringsförhållanden, och transfusionspraxis. Inom området för platelet (transfusion) biologi, många frågor på cell clearance från cirkulationen, bidrag transfusion trombocyter till hemostas, eller deras immunologi förblir också obesvarad.

Ett stort antal laboratorietekniker för blodplättsanalysfunktion finns, men dessa mestadels hantera en enda aspekt av trombocytfunktionen, som aggregering eller degranulering ^13. Att i stort sett bedöma blodplättar och blodplättskoncentrat, omfattande modeller av hemostas är oumbärliga, och dessa måste innehålla hydrodynamik. Blod reologi är avgörande för att korrekt tolka plätt beteende under hemostas ^{14, 15} eller trombos ^16, även om antikoagulation förhindrar Ca2 ⁺ och / eller trombin för att delta i närvaro av citrat eller heparin, respektive ^2. För att studera samspelet mellan koagulering och trombocytfunktionen i flödet ¹⁷, ^18, normal trombinbildning krävs, och därför fri Ca2 ⁺ samt. Experimentuppställning för att studera hemostas under dessa betingelser är komplex, eftersom åtgärder för att förhindra "artefakt" eller okontrollerad aktivering av koagulering bör fattas så mycket som möjligt. Dessutom har många specialiserade forskargrupper använder skräddarsydd hårdvara ^{19, 20,} som orsakar betydande mellan laboratorier variabilitet ^5. Typiska begränsningar av denna metod är användningen av rektangulära behållare, icke-pulserande flödesprofiler, och icke-mänskliga ytbeläggningar ^5. Analysen vi beskriver här använder kommersiellt tillgängliga verktyg och kan därför vara lämplig för standardisering.

Eftersom koagulationskaskaden reaktionen aktiveras lätt gång blodet inte är innesluten i den mänskliga kroppen, är kontrollerad rekalcifiering en svängbar steg. To uppnå detta tillsats av Ca2 ⁺ måste skjutas upp till strax före perfusion över reaktiva kollagenytan, eftersom när Ca2 ⁺ bufferten levereras i bulk till statisk blod, koagulation tar oundvikligen rum, så småningom täpper slangen och polarisering uppgifter tolkning (data ej visade). Lösningen på detta problem är att pumpa den Ca2 ⁺ buffert och blodet separat, vilket möjliggör blandning genom konvektiva och diffusiva krafter under perfusionen på dess väg till analyskammaren. Fullständig blandning uppnås i en 46-cm långt segment av slangen mellan blandnings- och analyskamrarna. Denna längd beräknades för optimal uppehållstid av reagenser för att blanda baseras på grundlagar för massa och konvektiv transport ²¹ under perfusion vid en flödeshastighet som används (1000 s ^-1). Detta tillvägagångssätt visade sig vara kontrollerbar och reproducerbar.

Kontaktaktivering av koagulation anses ibland en artefakt av enkelblodprovstagning och som bör undvikas när man tolkar koagulationstider. Därför visade vi att, i frånvaro av inhibitorer, börjar kontakt-inducerad koagulation vid 16,7 min (± 3,7 min) av perfusion. I närvaro av CTI att hämma FXIIa-medierad kontaktaktivering, är koagulation inte initieras under godtyckligt definierad loppet av experimentet (30 min). Detta fönster experimenterande är tillräckligt lång för att urskilja prov som är pro- eller antitrombotisk. Även om koagulation genom kontaktaktivering kan vara en oönskad konsekvens av blod i kontakt med artificiella ytor, våra data visar en tydlig biologisk dos effekten av blodplättar. Detta kan vara viktigt för transfusionsmedicin, eftersom nya rön om FXII, polyfosfater trombocyter ^10, fosfatidylserin fördelning ^22, och blodplättsmikropartiklar ²³ har faktiskt omvärderas kontaktvägen koagulation som en viktig bidragande faktor till hemostas, especiellt i samband med trombos ^24. Till exempel kan den rörliga avkastningen av trombocyttransfusioner i patienter eller variabel fosfatidylserin uttryck för bankas trombocyter därmed framkalla variabilitet i terapeutisk effekt om det lyckas koagulering har visat sig bero på dessa faktorer.

Genom samtidig immobilisering lipiderade rhTF med kollagen, den yttre koagulation rutt eller TF vägen aktiveras under blodplättbeläggning på kollagen. Detta sträcker sig analysen till sitt mest omfattande läge, som en modell för skador som ger blod i kontakt med TF-bärande celler och vävnader. Våra data visar att samtidig immobilisering av kollagen och TF minskar ögonblicket av koagulation insättande men ändrar inte graden av koagulering. Att notera är mängden av rhTF immobiliserat till ytan en viktig variabel i denna modell ^{25, 26} och bör vara standardiserat inom en given studie. I prece av CTI, kan studeras TF vägen enbart (ej visad) på grund av kontaktaktivering förhindras.

Sammanfattningsvis vår experimentuppställning kombinerar en modell av transfusion genom rekonstituering av trombocytopenisk blod med doserade plättar och en modell av hemostas genom kalciumberoende blodplättbeläggning och fibrinbildning i hydrodynamiskt flöde. Denna analys kommer att användas för att svara på frågor om den prokoagulerande karaktär doserade trombocyter och effekterna blodplättskoncentratframställningstekniker har på detta.

Materials

1 mL Syringe	BD	A00434
10 mL Syringe	BD	309604
2 mL Syringe	BD	307727
Alexa Fluor 405	Life Technologies	A30100	The manufacturer's manual was followed for labeling of fibrinogen
BD vacutainer Eclipse	Becton, Dickinson and Company	368650	Blood collection needle with preattached holder
BD vacutainer tube with EDTA	Becton, Dickinson and Company	368856
BD vacutainer tube with Sodium Citrate	Becton, Dickinson and Company	366575
Blocking buffer	in house preparation	in house preparation	1.0% (w/v) bovine serum albumin and 0.1% (w/v) glucose in HBS
Calcein AM	Molecular probes	C1430
Coagulation buffer	in house preparation	in house preparation	10mM CaCl2 and 3.75 mM MgCl2 in HBS
Conical tube 15mL	Greiner bio-one	1888271
Conical tube 50mL	Greiner bio-one	227261
Corn trypsin inhibitor (CTI)	Enzyme Research Laboratories	CTI
Denaturated alcohol	Fiers	T0011.5
DiOC6	Sigma-Aldrich	318426	3,3′-Dihexyloxacarbocyanine iodide – 1mM solution in DMSO
Exigo microfluidic pump	Cellix	EXIGO-PC-FS7.0-MF
Fibrinogen	Sigma-Aldrich	F3879	Labelled in house with AF 405 – stock concentration 10.7 mg/mL
Hematology analyzer	Sysmex	pocH-100i
HEPES buffered saline (HBS)	in house preparation	in house preparation	10mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) buffered saline (0.9% (w/v) NaCl, pH 7.4
Horm Collagen	Takeda/Nycomed	1130630	Native equine tendon collagen (type I) Isotonic glucose solution to dilute collagen is supplemented
Humidified box	Cellix	HUMID-BOX
Incubation water bath	GFL	1013
Microscope	Zeiss	Axio Observer Z1	equipped with a colibri-LED and high resolution CCD camera
Mirus Evo Nanopump	Cellix	188-MIRUS-PUMP-EVO	with Multiflow8
Pipette	Brand	A03429
Pipette tips 100-1000	Greiner bio-one	740290
Pipette tips 1-10	Eppendorf	A08928
Pipette tips 2-200	Greiner bio-one	739280
Platelet concentrate orbital shaker	Helmer	PF-48i
Precision wipes	Kimtech	5511
Pepsin solution	Hanna instrument	HI7073L	2g pepsin per 75 ml solution, Protein cleaning solution with pepsin
Recombinant Human Tissue Factor Innovin	Dade Berhing	B4212-40	rhTF with synthetic phospholipids
Software microscope	Zeiss	N/A	ZEN 2012
Sterile docking device	Terumo BCT	TSCD
Table Top Centrifuge	Eppendorf	521-0095
Tube Roller	Ratek	BTR5-12V
Tubing Sealer	Terumo BCT	AC-155
Vena8 syringe connector pin	Cellix	CONNECTORS-B1IC-PACK100
Vena8 Fluoro+ Biochips	Cellix	188V8CF-400-100-02P10	Coated biochip
Vena8 Needles	Cellix	SS-P-B1IC-B1OC-PACK200
Vena8 Tubing	Cellix	TUBING-TYGON-B1IC-B1OC-ROLL 100F
VenaDelta Y1 Biochips	Cellix	VDY1-400-100-01-02	Mixing biochip
Vortex mixer	VWR	58816-121
ZEN2012 software	Zeiss