Cet article décrit un modèle expérimental d'hémostase qui permet de mesurer simultanément la fonction plaquettaire et de la coagulation. Plaquettaires et de la fluorescence de la fibrine est mesurée en temps réel et le taux de plaquettes d'adhérence, la vitesse de coagulation, et le début de la coagulation sont déterminés. Le modèle est utilisé pour déterminer les propriétés des plaquettes procoagulantes sous flux de concentrés pour la transfusion.
microfluidiques modèles de hémostatique évaluer la fonction plaquettaire dans des conditions de cisaillement hydrodynamique, mais en présence d'anticoagulants, cette analyse est limitée à un dépôt de plaquettes seulement. La relation complexe entre la fonction de coagulation et des plaquettes dépendant de Ca nécessite recalcification prudent et contrôlé de sang avant l'analyse. Notre configuration utilise un canal de mélange en forme de Y, qui fournit Ca 2+ / Mg 2+ tampon concentré à l' écoulement du sang juste avant la perfusion, permettant recalcification rapide sans échantillon stase. Une différence de dix fois de la vitesse d'écoulement entre les deux réservoirs minimise la dilution. Le sang recalcifié est ensuite perfusé dans une chambre d'analyse revêtu de collagène et de marquage différentiel permet une imagerie en temps réel à la fois des plaquettes et de la fibrine le dépôt en utilisant la fluorescence vidéo-microscopie. Le système utilise uniquement des outils disponibles dans le commerce, ce qui augmente les chances de normalisation. Reconstitution de throsang mbocytopenic avec les plaquettes de banked se concentre en outre des modèles transfusion de plaquettes, ce qui prouve son utilisation dans ce domaine de recherche. Des exemples de données ont démontré que la coagulation et le début du dépôt de fibrine étaient linéairement dépendante de la concentration des plaquettes, ce qui confirme la relation entre l'hémostase primaire et secondaire dans notre modèle. Dans un délai de 16 perfusion min, activation de contact n'a pas eu lieu, en dépit de recalcification Ca 2+ et normale niveaux Mg 2+. Lorsque le facteur de coagulation XIIa a été inhibée par l'inhibiteur de trypsine de maïs, ce laps de temps est encore plus longue, ce qui indique une plage dynamique importante dans laquelle les changements dans la nature procoagulante des plaquettes peuvent être évaluées. Co-immobilisation du facteur tissulaire au collagène a réduit significativement le temps d'apparition de la coagulation, mais pas son taux. La possibilité d'étudier le facteur tissulaire et / ou la voie de contact augmente la polyvalence et l'utilité du dosage.
hémostase primaire et secondaire ont été initialement conceptualisé comme deux processus biochimiques relativement séparables. hémostase primaire a été considéré comme un contributeur majeur dans des conditions d'écoulement artériel, avec un rôle clé pour les plaquettes, tandis que l'hémostase secondaire a été vu pour dominer la coagulation dans le flux sanguin veineux, permettant la cascade de protéase pour former la fibrine insoluble. Les dernières décennies ont transformé cette vision traditionnelle sensiblement, en reconnaissant que l'activation plaquettaire et la coagulation sont interdépendants et sont des processus aussi importants pendant l'hémostase physiologique et pathologique dans tous les (non extrêmes) milieux hydrodynamiques. Ce point de vue a été traduit à la clinique, où des essais conçus pour mesurer globalement la coagulation du sang entier sont de plus en plus utilisés, mais avec beaucoup d'autres questions sur la pertinence, l' applicabilité et l' utilité 1.
Nous avons récemment publié une analyse fonctionnelle des plaquettesles concentrés en utilisant des chambres d'écoulement microfluidique revêtues de collagène fibrillaire dans un modèle in vitro de transfusion 2, avec des échantillons contenant des quantités normales de globules rouges, le plasma et les plaquettes. Cette méthode utilise l' héparine ou l' hirudine anticoagulant du sang, ce qui implique non ou participation limitée de l' hémostase secondaire, qui dépend de la génération de thrombine et le calcium ionisé (Ca 2+). Afin de soutenir la formation de thrombine et donc d'inclure tous les aspects de l' hémostase sous flux microfluidique, nous avons développé une méthode complémentaire sur la même plate – forme technique, y compris maintenant libre Ca 2+. De cette manière, le dépôt plaquettaire et la formation de fibrine peuvent être étudiés, encore une fois dans un modèle de transfusion de plaquettes, afin d'évaluer la qualité du concentré de plaquettes.
Dans ce procédé, les plaquettes et le fibrinogène sont marquées avec des fluorophores qui sont complètement séparés les spectres d'émission. Double couleur, vidéo en temps réel la microscopie permet alors l'analyse desl'adhésion primaire des plaquettes, ainsi que l'initiation et la coagulation du dépôt de fibrine. Une variable importante dans ce type de dosage est recalcification, parce que l'addition de Ca 2+ au sang statique, avant la perfusion, va inévitablement provoquer un contact initié par la coagulation dans le récipient. Cette initiation biaiser la lecture en raison de l'obstruction des tubes et des biopuces entrées avant perfusion. Par conséquent, dans notre procédé, le citrate anticoagulé de sang et d' un tampon contenant Ca2 + sont pompés séparément par les branches supérieures d'une chambre d'entrée en forme de Y. Les composants sont mélangés pendant la perfusion avant d'entrer dans une chambre d'analyse revêtue de collagène seul ou en combinaison avec un facteur tissulaire humain recombinant (rhTF). En adaptant les vitesses d'écoulement des pompes séparées , et la concentration de Ca 2+ dans la mémoire tampon, une dilution à 10% de l'échantillon de sang final a lieu.
En utilisant ce protocole étendu, nous démontrons la contribution de coagulafacteur de tion XII (FXII) et la concentration de plaquettes pour contacter la voie de coagulation initiation sous flux. Nos données montrent également que par revêtement rhTF le long du collagène, de la voie du facteur tissulaire peut être mesurée de façon concomitante.
La transfusion de concentrés plaquettaires est prescrit pour le patient thrombocytopénique pour prévenir ou arrêter le saignement. Son impact clinique a récemment été mis en évidence dans un examen historique de la leucémie aiguë 12, rappelant que l' augmentation des taux de patients pédiatriques dans les années soixante et soixante – dix survie étaient en grande partie attribuable à l' amélioration de la (plaquettes) de la médecine transfusionnelle. Les concentrés plaquettaires sont également utilisés pour enrayer un saignement dans un traumatisme aigu ou pendant la chirurgie. Dans ces conditions, les plaquettes avec d'excellentes propriétés coagulantes qui déclenchent rapidement hémostase sont préférés, mais concentrés plaquettaires sont préparés à partir de dons de donneurs volontaires et, contrairement à un médicament pharmacologique, sont normalisés par la préparation, et non par (chimique) composition. Par conséquent, plusieurs questions dans le domaine de la banque de sang sont sans réponse, y compris celles concernant les modalités optimales de dons, les conditions de stockage, et les pratiques de transfusion. Dans le domaine de la platelet (transfusion) biologie, de nombreuses questions sur la clairance des cellules de la circulation, la contribution des plaquettes transfusées à l'hémostase, l'immunologie ou leur restent également sans réponse.
Techniques de laboratoire nombreuses pour l' analyse de la fonction plaquettaire sont disponibles, mais ceux – ci portent la plupart du temps un aspect singulier de la fonction plaquettaire, comme l' agrégation ou la dégranulation 13. Pour évaluer globalement les plaquettes et les concentrés de plaquettes, des modèles globaux de l'hémostase sont indispensables, et ceux-ci doivent inclure hydrodynamisme. La rhéologie du sang est essentielle pour interpréter correctement le comportement des plaquettes au cours de l' hémostase 14, 15 ou 16 thrombose, même si un traitement anticoagulant empêche Ca2 + et / ou de la thrombine pour participer à la présence d' un citrate ou héparine, respectivement 2. Pour étudier l'interaction entre la coagulation et la fonction plaquettaire sous flux 1718, la génération de thrombine normale est requise, et par conséquent libre de Ca2 + aussi bien. Le dispositif expérimental pour l'étude de l'hémostase dans ces conditions est complexe, car les mesures de prévention «artefact» ou l'activation incontrôlée de la coagulation doivent être prises, autant que possible. En outre, de nombreux groupes de recherche spécialisés utilisent du matériel 19, 20, ce qui provoque importante variabilité inter-laboratoire sur -mesure 5. Limitations typiques de cette approche sont l'utilisation de navires rectangulaires, des profils d'écoulement non pulsatiles et revêtements de surface non humains 5. Le test que nous décrivons ici utilise des outils disponibles dans le commerce et peut donc être adapté à la normalisation.
Comme la réaction de coagulation en cascade est facilement activé une fois que le sang ne se trouve pas dans le corps humain, recalcification contrôlée est une étape essentielle. To atteindre cet objectif, l' addition de Ca 2+ doit être reportée à juste avant la perfusion sur la surface de collagène réactive, parce que quand le tampon 2+ Ca est fourni en vrac au sang statique, la coagulation prend inévitablement lieu, éventuellement obstruer la tubulure et de sollicitation de données interprétation (données non présentées). La solution à ce problème consiste à pomper le tampon de Ca 2+ et le sang séparément, ce qui permet de mélanger des forces convectifs et diffusifs pendant la perfusion sur son chemin vers la chambre d'analyse. Le mélange complet est réalisé dans un segment de 46 cm de tube entre les chambres de mélange et d'analyse. Cette longueur a été calculée pour le temps de séjour optimal des réactifs à mélange à base sur les lois fondamentales de la masse et de transport convectif 21 au cours de la perfusion au débit utilisé (1.000 s -1). Cette approche a été contrôlable et reproductible.
Contacter l'activation de la coagulation est parfois considérée comme un artefact d'une simplele prélèvement de sang et à éviter lors de l'interprétation des temps de coagulation. Par conséquent, nous avons démontré que, en l'absence d'inhibiteurs, la coagulation induite par contact, à partir de 16,7 min (± 3,7 min) de la perfusion. En présence de CTI pour inhiber l'activation de contact FXIIa médiation, la coagulation ne sont pas initié au cours défini arbitrairement de l'expérience (30 min). Cette fenêtre d'expérimentation est suffisamment longue pour distinguer des échantillons qui sont pro- ou anti-thrombotique. Même si la coagulation par activation de contact peut être une conséquence indésirable de contact avec le sang des surfaces artificielles, nos données montrent un effet de dose biologique claire des plaquettes. Cela peut être important pour la médecine transfusionnelle, car les découvertes récentes sur FXII, plaquettes polyphosphates 10, la distribution de phosphatidylsérine 22, et des microparticules de plaquettes 23 ont effectivement réévalué le contact voie coagulation comme un facteur important de l' hémostase, espécialement dans le contexte de la thrombose 24. Par exemple, le rendement variable de transfusions de plaquettes chez les patients ou l'expression de la phosphatidylsérine variable de plaquettes mis en réserve peuvent donc induire une variabilité de l'efficacité thérapeutique, si la coagulation est montré avec succès à dépendre de ces facteurs.
Par co-immobilisant lipidée rhTF avec du collagène, de la voie extrinsèque de la coagulation, ou une voie de TF, est activé au cours du dépôt des plaquettes sur le collagène. Ceci étend le test dans son mode le plus complet, en tant que modèle pour des blessures qui amènent le sang en contact avec les cellules et les tissus TF porteurs. Nos données montrent que la co-immobilisation du collagène et TF diminue le moment de la coagulation apparition, mais ne modifie pas le taux de coagulation. Il faut noter que la quantité de rhTF immobilisée à la surface est une variable importante dans ce modèle , 25, 26 et devrait être normalisée dans une étude donnée. Dans la présence de CTI, la voie TF peut être étudiée uniquement (non représentée) car l'activation du contact est empêchée.
En conclusion, notre dispositif expérimental combine un modèle de transfusion de sang par reconstitution avec les plaquettes thrombocytopénique mis en réserve et d'un modèle de l'hémostase par le dépôt de plaquettes dépendante du calcium et la formation de fibrine sous un flux hydrodynamique. Ce test sera utilisé pour répondre à des questions sur la nature procoagulante des plaquettes en banque et les techniques de préparation de concentré de plaquettes effets ont sur ce point.
The authors have nothing to disclose.
Cette recherche a été soutenue par la Fondation pour la recherche et le développement du Service belge Blood Red Cross-Flandre. Nous reconnaissons l'appui financier fourni par "Bijzonder onderzoeksfond" (BOF – Fonds spécial de recherche) de l'Université de Gand accordée au projet avec le numéro de contrat BOF30290744.
1 mL Syringe | BD | A00434 | |
10 mL Syringe | BD | 309604 | |
2 mL Syringe | BD | 307727 | |
Alexa Fluor 405 | Life Technologies | A30100 | The manufacturer's manual was followed for labeling of fibrinogen |
BD vacutainer Eclipse | Becton, Dickinson and Company | 368650 | Blood collection needle with preattached holder |
BD vacutainer tube with EDTA | Becton, Dickinson and Company | 368856 | |
BD vacutainer tube with Sodium Citrate | Becton, Dickinson and Company | 366575 | |
Blocking buffer | in house preparation | in house preparation | 1.0% (w/v) bovine serum albumin and 0.1% (w/v) glucose in HBS |
Calcein AM | Molecular probes | C1430 | |
Coagulation buffer | in house preparation | in house preparation | 10mM CaCl2 and 3.75 mM MgCl2 in HBS |
Conical tube 15mL | Greiner bio-one | 1888271 | |
Conical tube 50mL | Greiner bio-one | 227261 | |
Corn trypsin inhibitor (CTI) | Enzyme Research Laboratories | CTI | |
Denaturated alcohol | Fiers | T0011.5 | |
DiOC6 | Sigma-Aldrich | 318426 | 3,3′-Dihexyloxacarbocyanine iodide – 1mM solution in DMSO |
Exigo microfluidic pump | Cellix | EXIGO-PC-FS7.0-MF | |
Fibrinogen | Sigma-Aldrich | F3879 | Labelled in house with AF 405 – stock concentration 10.7 mg/mL |
Hematology analyzer | Sysmex | pocH-100i | |
HEPES buffered saline (HBS) | in house preparation | in house preparation | 10mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) buffered saline (0.9% (w/v) NaCl, pH 7.4 |
Horm Collagen | Takeda/Nycomed | 1130630 | Native equine tendon collagen (type I) Isotonic glucose solution to dilute collagen is supplemented |
Humidified box | Cellix | HUMID-BOX | |
Incubation water bath | GFL | 1013 | |
Microscope | Zeiss | Axio Observer Z1 | equipped with a colibri-LED and high resolution CCD camera |
Mirus Evo Nanopump | Cellix | 188-MIRUS-PUMP-EVO | with Multiflow8 |
Pipette | Brand | A03429 | |
Pipette tips 100-1000 | Greiner bio-one | 740290 | |
Pipette tips 1-10 | Eppendorf | A08928 | |
Pipette tips 2-200 | Greiner bio-one | 739280 | |
Platelet concentrate orbital shaker | Helmer | PF-48i | |
Precision wipes | Kimtech | 5511 | |
Pepsin solution | Hanna instrument | HI7073L | 2g pepsin per 75 ml solution, Protein cleaning solution with pepsin |
Recombinant Human Tissue Factor Innovin | Dade Berhing | B4212-40 | rhTF with synthetic phospholipids |
Software microscope | Zeiss | N/A | ZEN 2012 |
Sterile docking device | Terumo BCT | TSCD | |
Table Top Centrifuge | Eppendorf | 521-0095 | |
Tube Roller | Ratek | BTR5-12V | |
Tubing Sealer | Terumo BCT | AC-155 | |
Vena8 syringe connector pin | Cellix | CONNECTORS-B1IC-PACK100 | |
Vena8 Fluoro+ Biochips | Cellix | 188V8CF-400-100-02P10 | Coated biochip |
Vena8 Needles | Cellix | SS-P-B1IC-B1OC-PACK200 | |
Vena8 Tubing | Cellix | TUBING-TYGON-B1IC-B1OC-ROLL 100F | |
VenaDelta Y1 Biochips | Cellix | VDY1-400-100-01-02 | Mixing biochip |
Vortex mixer | VWR | 58816-121 | |
ZEN2012 software | Zeiss |