Summary
Dit artikel beschrijft een experimenteel model van hemostase die gelijktijdig meet bloedplaatjesfunctie en coagulatie. Bloedplaatjes en fibrine fluorescentie wordt gemeten in real-time en bloedplaatjesadhesie rate, coagulatie snelheid, en het begin van coagulatie bepaald. Het model wordt gebruikt voor bloedplaatjes stollingsbevorderende eigenschappen bepalen onder stroom concentraten voor transfusie.
Abstract
Microfluïdische modellen van hemostase beoordelen bloedplaatjes functie onder omstandigheden van hydrodynamische afschuifkrachten, maar in aanwezigheid van anticoagulantia, wordt deze analyse beperkt tot bloedplaatjes afzetting. De ingewikkelde relatie tussen Ca 2+ -afhankelijke stolling en bloedplaatjes functie vereist een zorgvuldige en gecontroleerde recalcificatietijd van het bloed voorafgaand aan analyse. Onze setup maakt gebruik van een Y-vormige mengen kanaal, dat geconcentreerde Ca 2+ / Mg 2+ buffer levert aan stromend bloed vlak voor perfusie, waardoor een snelle recalcificatietijd zonder monster stasis. Een tienvoudige verschil in stroomsnelheid tussen beide reservoirs minimaliseert verdunning. De recalcified bloed wordt vervolgens doorbloed in een met collageen beklede analyse kamer, en differentiële labeling maakt real-time beeldvorming van zowel het aantal bloedplaatjes en fibrine afzetting met behulp van fluorescentie microscopie video. Het systeem gebruikt handel verkrijgbare instrumenten, de kansen op normalisatie. Reconstructie van thrombocytopenic bloed met plaatjes van dwarshelling concentreert zich bovendien modellen bloedplaatjestransfusie, bewijst het gebruik ervan in dit onderzoeksdomein. Voorbeeldgegevens aangetoond dat coagulatie begin en fibrine depositie was lineair afhankelijk van de concentratie van bloedplaatjes, hetgeen de verhouding tussen de primaire en secundaire hemostase in ons model. In een tijdsbestek van 16 perfusie min, had contact activering niet plaats, ondanks recalcificatietijd normaal Ca 2+ en Mg 2+ niveaus. Wanneer coagulatie factor XIIa werd geremd door maïs trypsineremmer deze periode was zelfs langer, hetgeen een aanzienlijke dynamische bereik waarin de veranderingen in de procoagulant aard van de bloedplaatjes kan worden beoordeeld. Co-immobilisatie van tissue factor met collageen verminderde significant de tijd tot begin van bloedstolling, maar niet de snelheid. De mogelijkheid om de weefselfactor en / of de contact route bestuderen verhoogt de veelzijdigheid en het nut van de test.
Introduction
Primaire en secundaire hemostase werden oorspronkelijk opgevat als twee relatief gescheiden biochemische processen. Primaire hemostase werd gezien als een belangrijke bijdrage van de arteriële stroomomstandigheden, die een sleutelrol vervullen voor bloedplaatjes, terwijl secundaire hemostase waargenomen coagulatie domineren onder veneuze bloedstroom, waardoor de protease cascade om onoplosbaar fibrine te vormen. De laatste decennia hebben deze traditionele opvatting aanzienlijk hervormd, erkennen dat bloedplaatjes activering en stolling van elkaar afhankelijk zijn en zijn even belangrijk processen tijdens fysiologische en pathologische hemostase in alle (niet-extreme) hydrodynamische milieus. Deze visie is vertaald naar de kliniek, waar de assays bedacht om volledig te meten hele bloedstolling worden steeds vaker gebruikt, zij het met veel resterende vragen over de relevantie, toepasbaarheid en het nut 1.
We hebben onlangs een functionele analyse van bloedplaatjesconcentraten gebruikt microfluïdische stroomkamers bekleed met fibrillair collageen in een in vitro model van transfusie 2, met monsters die normale hoeveelheid rode bloedcellen, plasma en bloedplaatjes. Deze werkwijze gebruikt heparine of hirudine anticoagulanteerd bloed, impliceert geen of beperkte betrokkenheid secundaire hemostase, die afhankelijk is van trombinevorming en geïoniseerd calcium (Ca2 +). Trombine vorming ondersteunen en aldus alle aspecten van hemostase onder microfluïdische stroom omvatten, ontwikkelden we een aanvullende methode hetzelfde technische platform, nu ook vrij Ca2 +. Zo kan afzetting van trombocyten en fibrinevorming bestudeerd, opnieuw in een model van trombocytentransfusie, bloedplaatjes concentraat kwaliteit te beoordelen.
In deze werkwijze worden de bloedplaatjes en fibrinogeen gelabeld met fluoroforen die volledig emissiespectra gescheiden. Tweekleurige, real-time video microscopie maakt dan is de analyse van deprimaire bloedplaatjesadhesie, alsmede coagulatie initiatie en fibrine depositie. Een belangrijke variabele in dit type test is recalcificatietijd, omdat de toevoeging van Ca2 + statische bloed vóór perfusie, zal onvermijdelijk contact geïnitieerde coagulatie in de houder veroorzaken. Deze initiatie zal vertekening van de uitlezing als gevolg van verstopping van de slang en biochip inhammen voorafgaand aan de perfusie. Dus in onze werkwijze, citraat geanticoaguleerd bloed en Ca2 + -bevattende buffer afzonderlijk gepompt door de bovenbenen van een Y-vormige inlaatkamer. De componenten worden gemengd tijdens perfusie alvorens een analysekamer bekleed met alleen of in combinatie met recombinant humaan weefselfactor (rhTF) collageen. Door het aanpassen van de stroomsnelheden van de afzonderlijke pompen en de concentratie van Ca2 + in de buffer, een 10% verdunning van het laatste bloedmonster plaatsvindt.
Gebruik van deze uitgebreide protocol tonen we de bijdrage van coagulatie factor XII (FXII) en bloedplaatjes concentratie contact route coagulatie initiatie onder stroom. Onze gegevens tonen ook aan dat door bekleding rhTF naast collageen, de tissue factor pathway kan gelijktijdig gemeten.
Protocol
Dit protocol volgt de institutionele ethische richtlijnen voor onderzoek naar menselijke monsters, en geïnformeerde toestemming werd verkregen van alle betrokken donoren. Goedkeuring voor de hier beschreven experimenten werd verkregen van de institutionele review board van het Universitair Ziekenhuis Antwerpen (erkenningsnummer 16/10/120).
OPMERKING: Temperatuur indicaties zijn altijd kamertemperatuur, tenzij anders aangegeven.
1. Microfluidics Setup
- Bereid de microfluïdische stroom kamer kanalen, slangen, en verbindingspennen
- Resuspendeer het collageen stock flacon door vortex mengen, en vervolgens verdund in isotone glucoseoplossing van de fabrikant tot een uiteindelijke concentratie van 50 ug / ml.
LET OP: Gebruik paarden pees collageen, voornamelijk samengesteld uit type I vezels. Paarden collageen type I wordt vaak aangeduid als "Horm" collageen en is de gouden standaard voor dit type assay, zowel historischbiologische redenen. Humaan type III collageen kunnen ook worden gebruikt, maar deze fibrillen vacht minder goed en het trombocytenrespons niet zo sterk. Andere coatings oppervlakken kunnen ook worden gebruikt, zoals von Willebrand factor, fibrinogeen, fibronectine, laminine, vitronectine, trombospondine-1 of combinaties van deze 3. - Neem een nieuwe wegwerpbare microfluïdische biochip met acht rechte, parallelle kanalen en afmetingen, in mm, van 0,4 W x H 0,1 x 20 L. Pipetteer 0,8 pi van collageen in het kanaal (s) van de biochip aan de ene kant en label dit als de outlet. Vullen slechts 5/6 van de kanaallengte zodat de collageen fibrillen niet de kanaalinlaat bekleed, omdat dit kan leiden tot verstopping, hetgeen een doeltreffende perfusie belemmert.
- Incubeer de biochip bij 4 ° C gedurende ten minste 4 uur in een bevochtigde en doos.
- Om weefselfactor (extrinsieke) gemedieerde coagulatie onderzoeken in combinatie met het contact pad (intrinsieke), laag de kanalen met collagen en recombinant tissue factor (rhTF) mens.
- Verdun rhTF in 10 mM 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethaansulfonzuur (HEPES) -buffered zoutoplossing (HBS; 0,9% (w / v) NaCl, pH 7,4, 1: 3000, voorraadconcentratie: 4,5 nM).
- Verwijder de collageen-bekledingsoplossing via de uitlaat. Pipet 0,8 pl rhTF in HBS (verdunning 1/500 van voorraadconcentratie, eindconcentratie: 09:00) in de uitgang van het kanaal vullen 5/6 van de kanaallengte, vergelijkbaar met de collageen-coating strategie.
- Incubeer de biochip gedurende nog 30 min in een vochtige en doos.
- Vul het gecoate kanalen met blokkerende buffer (1,0% (w / v) runderserumalbumine en 0,1% (w / v) glucose in HBS), uitgaande van het andere uiteinde (aangeduid als de inlaat). Vul een gelijk aantal Y-vormige kanalen met dezelfde blokkerende buffer in een meng biochip.
- Zorg ervoor dat alle kanalen en het kanaal armen zijn volledig gevuld met blokkerende buffer. Incubate beide biochips ten minste 1 uur in een bevochtigde en doos.
- Voor elk kanaal in gebruik, bereiden twee buizen van 8 cm, een 2 cm lengte, en een 46 cm lang. Plaats een pin in een uiteinde van de drie kleinere buis en in beide uiteinden van de langste buis.
- Resuspendeer het collageen stock flacon door vortex mengen, en vervolgens verdund in isotone glucoseoplossing van de fabrikant tot een uiteindelijke concentratie van 50 ug / ml.
- Bereid de spoelen pomp
- Spoel alle pomp fluïdica en de aangesloten buis met gedestilleerd water.
- Ontvet casting van de biochip's met een precisie stofvrij vegen en gedenatureerde alcohol om afdrukken en stof te verwijderen.
- Vul alle buis met blokkerende buffer voordat ze worden aangesloten op de biochips.
- Bevestig de gecoate biochip van de geautomatiseerde microscoop podium. Bevestig het mengen biochip op dezelfde hoogte als de microscooptafel met een klinisch schaar jack.
- Sluit de beklede biochip de biochip mengen met de langste buis, 46 cm lang. Controleer beide biochips op een afstand zodat de buis vormt een flexibele maar rechte lijn. Bevestig een injectiespuit connector pin in de Luer-compatible buis van het spoelen pomp. Aansluiten op het vrije einde van de 2 cm buis en bevestig het andere uiteinde met de uitlaat van de beklede biochip.
- Bevestig de twee 8-cm slang aan op de mengen biochip inlaat met behulp van de pinnen. Zet het vrije uiteinde van elke buis in een flacon HBS. Spoel alle slangen en alle kanalen met 1 ml HBS.
OPMERKING: HBS stroomt van het flesje via de 8-cm slang aan het mengen chip en door de 46-cm slang aan de beklede chip (die uit de onbeklede naar de beklede deel) als gevolg van de trekkracht van de spoelpomp. Deze stap verwijdert de blokkerende buffer en slecht gehandeld collageen (of rhTF in dubbel gecoat biochips).
- Bereid de perfusie pompen
- Open de driver-software van de perfusie pompen. Initialiseren van de pompen door te dubbelklikken op het pictogram van injectiespuiten in de software.
- Selecteer het type spuit worden gebruikt: 1 ml spuiten voor de coagulatie bUffer en 2 ml spuiten voor de bereide bloed.
- Sluit de spuiten op de biochip bouw
- Koppel de spoelpomp en alle buizen, behalve de ene die de twee biochips. De losgekoppelde buis wordt hergebruikt in de volgende stappen.
- Sluit de 2-cm buis met de spuit-connector pin aan de Luer lock van een dikwandige buizen afval. Vul het dikwandige buizen met standaard pepsine oplossing met behulp van een injectiespuit.
OPMERKING: De toevoeging van pepsine het afval buis remt en lyseert na perfusie stolling en voorkomt dus verstopping van het systeem aan de achterkant. - Zet het open einde van de dikwandige buis met een Kocher klem. Plaats een geschikte afvalhouder met bleekmiddel hieronder om de doorstroming te verzamelen.
- Bevestig de buis met zijn as aan de uitlaat van de beklede biochip.
2. Voorbereiding bloedmonsters
- Verzamel bloed van een gezonde vrijwilliger en te scheiden zijn componenten 4
- Verzamelen van bloed in een geëvacueerde ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) container. Gebruik dit monster alleen voor het uitvoeren van een complete bloedbeeld (CBC) met behulp van een geautomatiseerde hematologie-analyse.
- Verzamelen van bloed in geëvacueerde natriumcitraat containers. 5 ml bloed nodig per kanaal.
- Het monster (s) op een horizontale rotator afwachting bloed oplossen.
LET OP: De test moet binnen 3 uur van aderlaten worden afgerond. Bloedplaatjes concentraat en hele bloedmonsters zijn ABO / RhD bloedgroep geëvenaard. - Centrifugeer gedurende 13 minuten bij 250 xg om bloedplaatjes rijk plasma (PRP) te bereiden. Gebruik de centrifuge rem om verstoring van de los gepakt pellet te voorkomen.
- Breng de PRP een nieuwe conische centrifugebuis. Centrifugeer 10 minuten bij 4500 xg (met rem) de bloedplaatjes pellet bereiden bloedplaatjes-arm plasma (PPP). Gooi de platElet pellet. Incubeer de PPP in een waterbad bij 37 ° C.
- Breng de rode bloedcellen een nieuwe conische buis door het perforeren van de bodem van de originele met een 21 G naald.
OPMERKING: De resterende bloedplaatjes in de gepakte rode cellen fractie 11 ± 4 x 10 3 per pi (gemiddelde ± SD, n = 10).
- reconstrueren bloed
- Bepaal de hematocriet van de rode bloedcellen bereid in stap 2.1.6 behulp van een geautomatiseerde hematologie-analyse.
- Bepaal de bloedplaatjes concentratie van de bloedplaatjes concentraat dat wordt gebruikt voor analyse met een geautomatiseerde hematologie-analyse.
- Bereken het volume van verpakte rode bloedcellen, bloedplaatjes concentraat en PPP dat een 40% hematocriet en 250 x 10 3 bloedplaatjes / ul oplevert in een 2,5 ml eindvolume. Meng deze met gereconstitueerde bloed voorbereiden en uitvoeren van een CBC.
OPMERKING: Andere doelwit titers van cellen kan worden gebruikt, afhankelijk van The onderzoeksvraag. - Bereid een "blanco" controlemonster, waarbij het volume van bloedplaatjes concentraat wordt vervangen door een gelijk volume zoutoplossing om de concentratie van "endogeen" bloedplaatjes (dwz niet-bloedbank bloedplaatjes) bepaald.
- Label de gereconstitueerde bloed voor bloedplaatjes en fibrinogeen
- Pipetteer 13 ul van een 10,7 mg / mL oplossing van Alexa Fluor 405-gelabeld fibrinogeen (70 ug / ml eindconcentratie) in een reageerbuis en voeg 1 ml gereconstitueerde bloed.
OPMERKING: Fibrinogeen werd gelabeld met een commercieel verkrijgbare kit volgens de handleiding van de fabrikant. - Meng nog een 1 ml gereconstitueerde bloed in een reageerbuis met 2 ui 1 mM Dioc 6 (1 uM eindconcentratie) of met 2 pl van 5 mM calceïne AM (5 uM eindconcentratie). Voeg dit toe aan de buis met het bloed met fibrinogeen, waardoor een eindvolume van 2 ml van bloedplaatjes en fibrinogeen-sgehandhaafd bloed.
LET OP: De keuze van de kleurstof kan afhangen van de vraag onderzoek of de voorkeur van de onderzoeker 5. Wees ervan bewust dat excitatie van elke kleurstof fotochemische artefacten kan veroorzaken. - Meng door omkeren. Incubeer het monster gedurende 10 minuten bij 37 ° C.
- Pipetteer 13 ul van een 10,7 mg / mL oplossing van Alexa Fluor 405-gelabeld fibrinogeen (70 ug / ml eindconcentratie) in een reageerbuis en voeg 1 ml gereconstitueerde bloed.
- Bereid de coagulatie buffer
- Bereid coagulatie buffer die 10 mM CaCl2 en 3,75 mM MgCl2 in HBS. Bereid 1 ml coagulatie buffer voor één kanaal.
- Filter-steriliseer de coagulatie buffer door een 0,2 pm filter. Pre-warm deze tot 37 ° C.
3. Perfusie Assay
- Focus de microscoop optiek om de collageenvezels gehecht aan de bodem van het kanaal. Gebruik fase contrast of differentieel interferentie contrast (DIC). Selecteer "Set huidige Z voor geselecteerde tegel regio's" in het experiment software om de geselecteerde focus digitaal op te lossen.
- Definieer een interessegebied (ROI) in het geselecteerde kanaal met de acquisitie software van de microscoop.
LET OP: De ROI kan elk oppervlak willekeurig gekozen binnen een perfusie kanaal. Het wordt niet aanbevolen aan trombusvorming en fibrine generatie vlakbij de inlaat en uitlaat analyseren om te voorkomen verwerven afbeeldingen ongelijk verdeeld trombi. De ROI oppervlakte moet een aanzienlijk aantal trombi bevatten mogelijk te maken voor de nivellering van het signaal variabiliteit door individuele bloedplaatjes. De locatie van de ROI in het xy-vlak van het kanaal is altijd vast, welomschreven vóór perfusie. Desgewenst kan het onbeklede deel van het kanaal in de analyse opgenomen om te bepalen of bloedplaatjes niet specifiek binden aan het plastic biochip. - Bereiden monsters voor perfusie
- Monteer een 1 ml spuit met 1 ml voorverwarmde buffer coagulatie in de perfusiepomp.
- Meng de voorverwarmde opgelost bloed door voorzichtig omkeren en de belasting 2 mL in een 2 ml spuit.
- Zorg ervoor dat alle lucht uit beide spuiten verwijderd en sluit elk met een 8-cm slang met behulp van een injectiespuit connector pin.
- Prime de aansluitingen en leidingen van beide spuiten met hoge snelheid (400 pL / min) en stopt wanneer alles is gevuld met buffer stolling of bloed.
OPMERKING: Bij het vullen van de buis, de coagulatie buffer en geregenereerde bloed onmiddellijk worden gemengd in het Y-vormig kanaal van het mengen biochip bij het starten van het experiment, het vermijden van de introductie van lucht naar de perfusiekamers.
- Met pennen, bevestig het andere uiteinde van beide buizen om de splitsing benen van de Y-vormige kanaal in het mengen biochip. Het onderste been wordt gebruikt voor het perfuseren coagulatie buffer en het bovenbeen voor gereconstitueerd bloed.
- Begin het experiment door het initiëren perfusie aan 4,4 ul / min gedurende coagulatie buffer en 44 ul / min gedurende gereconstitueerd bloed. Verwijder de Kocher klem bij de uitlaat van de buis afvalstoffen toe te staan Japanse producteSion.
LET OP: Flow tarief kan worden veranderd afhankelijk van de vraagstelling. Start een stopwatch om de tijd tussen het begin van het experiment en de start van de real-time beeld acquisitie te bepalen. - Record beelden elke 10 s gedurende 30 minuten in real time via de verwerving en experiment software van de microscoop. Opname starten wanneer de mix gereconstitueerd bloed coagulatie buffer gaat de beklede biochip geplaatst op de microscoop podium.
LET OP: Andere grafieken kunnen worden gebruikt afhankelijk van de experimentele opstelling. Gebruik een 100X vergroting (10x objectief en 10x lenzen).
4. Terminating Experiment
- Sluit de pompen en beeldopname na 30 min of minder, als het signaal verzadigd. Maak alle slangen en spuiten en gooi ze als biologisch gevaarlijk afval.
5. Data Analysis
- Bepaal groei trombus (groene fluorescentie) en de vorming van fibrine (violet fluorescence) kinetiek met beeldanalyse software. De volgende opdrachten zijn specifiek voor de software die hier gebruikt:
- Open de plugin Processing: stiksels om te borduren de side-by-side beelden per tijdstip.
- Open de plugin Image Analysis aan de oppervlakte dekking van de bloedplaatjes te bepalen.
- Open de plugin Measure. Definieer de ROI door het tekenen van een rechthoek regio met inbegrip van alle trombi en fibrine vezels; in dit protocol, de ROI is een rechthoek van 637 mm 2.
Selecteer het tabblad Alle Uitzicht naar alle geregistreerde tijdstippen omvatten. - Gebruik tabellen maken om automatisch een spreadsheet dat de gemiddelde fluorescentie-intensiteit waarde van de geselecteerde rechthoek regio elk tijdstip bevat.
- Sla de spreadsheets in xml-formaat.
- Open een werkblad in een spreadsheet programma voor verdere berekeningen.
- Trek de aanvankelijke (background) waarde van alle gegevens.
- Zet de fluorescentie als functie van de perfusie tijd voor zowel de groene (bloedplaatjes) en de violette (fibrine) kleurstoffen.
LET OP: Houd rekening met de tijd tussen de pomp initialisatie en de daadwerkelijke beginpunt van het beeld acquisitie. Trombusvorming algemeen een twee-stappen in dit model: (1) "langzaam" bloedplaatjesadhesie (dwz adhesie) aan geïmmobiliseerd collageen gevolgd door (2)-coagulatie aangedreven trombus groei met een "snelle" toename van zowel bloedplaatjesbinding ( dwz accumulatie) en fibrine depositie (dwz coagulatie) (figuur 1). - Bereken de helling van bloedplaatjesadhesie en accumulatie door lineaire regressie; deze helling geeft bloedplaatjes thrombus groeikinetiek in elke fase van zijn vorming.
- Bereken de helling van fibrine coagulatie en extrapoleren deze lijn aan de X-as onderscheppen, bepalen het moment van aanvang.
Representative Results
De analyse van real-time door data is beschreven in figuur 1. Eerst, bloedplaatjes zich aan het reactieve oppervlak, waardoor een gestage toename geregistreerd groene fluorescentie (Figuur 1A, i), genoemd hechting. Tijdens deze fase is er weinig violet fluorescentie, wat aangeeft dat fibrine niet of slechts marginaal gevormd (Figuur 1B). Na het instellen van coagulatie, violet oplichtende fibrine afzettingen snel (iii), en in die tijd, bloedplaatjes groene fluorescentie verhoogd op ongeveer dezelfde snelheid, hier aangeduid als bloedplaatjes accumulatie (ii). Een enkel experiment dus terugkeert drie tarieven van de fluorescentie verhoging (i, ii, en iii) als een surrogaat marker voor de snelheid waarmee de bloedplaatjes en fibrine depositie vindt plaats in dit model. Verder wordt een moment van coagulatie aanzet (schip-of-onset (iv)) geëxtrapoleerd, hetgeen een determinant van bloedplaatjesprocoagulante potentieel.
Aangezien TF, coagulatie initiatie traag en vooral loopt via het contact pad waar de intrinsieke TENase complex activeert FX via directe activatie van FIX 6 door FXI en / of FXII. Om FXII afhankelijkheid tonen, 4 uM maïs trypsineremmer (CTI) werd toegevoegd aan geactiveerde FXII remmen (FXIIa) 7. Deze remming heeft geen invloed op bloedplaatjesadhesie (figuur 2A), maar coagulatie niet begonnen voor willekeurig gedefinieerd totale duur van de perfusie experiment (figuur 2B en aanvullende Video 1).
In vitro, kan de contactpersoon route worden gestart door vreemde materialen zoals glas, of in de klinische testen met behulp van een mineraal materiaal zoals kaolien. In vivo geactiveerde plaatjes over een negatieve lading 8 </ sup> door het membraan blootgesteld zure fosfolipiden 9, zoals fosfatidylserine en / of door het vrijkomen van polyfosfaten (poliep) 10, 11. De microfluïdische real-time test bootst de laatste omdat, in verschillende concentraties bloedplaatjes, de hemostatische reactie afhankelijk van de bloedplaatjestelling (figuur 3). Door het aantal bloedplaatjes in het gereconstitueerde monster, de snelheid van hechting (figuur 3A), accumulatie (Figuur 3B, groen) en coagulatie (figuur 3B, violet) lineair toe. Het moment-of-onset aanzienlijk verkort (figuur 3C) van toenemende concentratie van bloedplaatjes, wat suggereert dat een drempelwaarde aantal (geactiveerd) afgezette bloedplaatjes nodig om coagulatie te activeren.
Bij weefselschade in vivo echter, TF-dragende cellen zal initiate het stollen van bloed via de FVIIa-TF extrinsieke TENase complex in de aanwezigheid van Ca2 +. Dit wordt nagebootst in onze experimentele opstelling door post-bekleden van de collageen-bevattende perfusie kamers met gelipideerd rhTF. In een gepaarde analyse kanalen bekleed met alleen of in combinatie met rhTF collageen, coagulatie begin significant sneller (Figuur 4A). De snelheid van bloedplaatjesadhesie niet lineair, dus geen lineaire regressie kunnen worden uitgevoerd (data niet getoond). Zowel de snelheid van de stolling en bloedplaatjes accumulatie waren niet verschillend tussen de omstandigheden (figuur 4B-4C, Aanvullende Video 2).
Figuur 1: Regressie analyse van bloedplaatjesadhesie en coagulatie in microfluïdische perfusiekamers. Deze figuur verduidelijkt de parameters afgeleid van real-time fluorescentie ruwe data opgedaan tijdens recalcified bloedstroom over een reactief oppervlak. (A) gemiddelde intensiteit van groene fluorescentie toont bloedplaatjes afzetting als functie van de tijd perfusie. De curve beschrijft een bimodale proces begint met (i) langzaam toenemende lineaire bloedplaatjesadhesie gevolgd door (ii) snelgroeiende lineaire accumulatie. Zowel lineaire delen van de curve worden regressie en de helling van deze beschrijft de twee tarieven van trombusvorming door bloedplaatjes fluorescentie; (I) hechting en (ii) accumulatie. (B) De gemiddelde fluorescentie-intensiteit van violet toont afzetting van fibrine als functie van de tijd. Tijdens de hechting van bloedplaatjes, violet fluorescentie is in wezen afwezig is, terwijl het snel ontwikkelt volgende start van de coagulatie. De (iv) schip-of-onset is gedefinieerd als het snijpunt met de x-as van de geëxtrapoleerde lineaire regressie van (iii) de tweede fase van trombusvorming door hier aangeduid als coagulatie fibrine fluorescentie.ef = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55351/55351fig1large.jpg" target = "_ blank"> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Aangezien TF, coagulatie in met collageen beklede perfusie stroomkamers afhankelijk FXIIa. Microfluïdische perfusie van geregenereerde bloed met CTI of controle buffer (controle) werd uitgevoerd bij een afschuifsnelheid van 1000 s-1 gedurende in totaal 30 min. (A) De snelheid van de hechting van bloedplaatjes (s -1) was niet afhankelijk van CTI. (B) Het moment-of-onset voor CTI-behandelde monsters was boven de 30 min grens van het experiment (getoond als een stippellijn), waaruit de afhankelijkheid FXIIa van deze parameter. Bars en stippen zijn gemiddelde waarden, snorharen zijn standaarddeviatie. Statistische analyse werd met gepaarde t-test. (NS = niet significant, n ≥3). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Coagulatie onderbroken wordt afhankelijk van het aantal plaatjes. Microfluïdische perfusie experimenten werden uitgevoerd in met collageen beklede kamers met gereconstitueerde bloed in de aanwezigheid van Ca2 + en variërende concentraties van bloedplaatjes (n ≥3). (A) Waardering van bloedplaatjesadhesie (B) percentage bloedplaatjes accumulatie (groen) en coagulatie (violet) en (C) schip-of-onset getoond als functies van bloedplaatjes concentraties in bloed gereconstitueerd. Dots zijn gemiddelde waarden, snorharen zijn standaarddeviaties. Klik hier om een grotere versi bekijkenop van dit cijfer.
Figuur 4: Activering van zowel TF en contact route coagulatie verkort aanzienlijk het moment-of-onset van de bloedstolling. Gereconstitueerd bloed in aanwezigheid van Ca2 + werd geperfuseerd via de kamers bekleed met alleen of met collageen en rhTF het contact pad alleen of een combinatie van het contact en TF paden bestuderen collageen. (A) Het moment-of-onset stolling aanzienlijk verkort TF-bevattende stromingskamers. (B) De snelheid van de ophoping van bloedplaatjes tijdens stolling en (C) de snelheid van de bloedstolling zijn niet significant verschillend tussen collageen alleen of collageen en rhTF-gecoate stroom kamers. Bars en stippen zijn gemiddelde waarden; snorharen zijn standaarddeviaties. Statistische analyse werd met gepaarde t-test. (NS = niet significant, * P < 0,05, n ≥3). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende Video 1: Aangezien TF, coagulatie in met collageen beklede perfusie stroomkamers afhankelijk FXIIa. De rol van het contact route wordt bepaald met collageen beklede perfusie flow cellen. (A) Overlaid beeld fluorescentie sequentie van bloedplaatjes (groen) en fibrine (fibrinogeen) (violet) depositie in afwezigheid van CTI. (B) dezelfde sequentie als paneel A maar met het groene kanaal uitgeschakeld. (C) Overlay image fluorescentie sequentie van bloedplaatjes (groen) en fibrine (fibrinogeen) (violet) depositie in de aanwezigheid van CTI. (D) dezelfde sequentie als panel C maar met het groene kanaal uitgeschakeld.ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55351/Supplementary_video_1.avi "target =" _ blank "> Klik hier om deze video te downloaden.
Aanvullende Video 2: Activering van zowel TF en het contact route verkort aanzienlijk de coagulatie ogenblik-of-onset. Om de rol van TF te bestuderen, werden stroomkamers bekleed met alleen of met collageen en collageen rhTF gebruikt. (A) Overlaid beeld fluorescentie sequentie van bloedplaatjes (groen) en fibrine (fibrinogeen) (violet) depositie in flow kamers alleen bekleed met collageen. (B) dezelfde sequentie als paneel A maar met het groene kanaal uitgeschakeld. (C) Overlay image fluorescentie sequentie van bloedplaatjes (groen) en fibrine (fibrinogeen) (violet) depositie in flow kamers bekleed met zowel collageen en rhTF. (D) dezelfde sequentie als panel C maar met het groene kanaal switched off. Klik hier om deze video te downloaden.
Discussion
Transfusie van bloedplaatjes concentraten wordt voorgeschreven voor de trombocytopenische patiënt te voorkomen of te stoppen met bloeden. De klinische impact werd onlangs benadrukt in een historisch overzicht van acute leukemie 12, eraan herinnerend dat verhoogde overlevingskansen van pediatrische patiënten in de jaren zestig en zeventig waren grotendeels toe te schrijven aan de verbetering van (trombocyten) transfusiegeneeskunde. Bloedplaatjes concentraten worden ook gebruikt om stam bloeden in acuut trauma of tijdens de operatie. Onder deze omstandigheden worden plaatjes met uitstekende stollingsbevorderende eigenschappen die snel hemostase initiëren voorkeur, maar bloedplaatjes concentraten worden bereid uit donaties van vrijwillige donors en, in tegenstelling farmacologische medicatie, zijn gestandaardiseerd door voorbereidende, niet door (chemische) samenstelling. Daarom is een aantal vragen op het gebied van bloed bankieren zijn onbeantwoord, waaronder die op een optimale donatie modaliteiten, de bewaarcondities en de transfusie praktijken. Op het gebied van platelet (transfusie) biologie, veel vragen op mobiele klaring uit de circulatie, de bijdrage van transfusie bloedplaatjes aan hemostase, of hun immunologie ook blijven onbeantwoord.
Tal van laboratoriumtechnieken voor de bloedplaatjes functie analyse beschikbaar zijn, maar deze zijn vooral bestemd voor een bijzonder aspect van de functie van de bloedplaatjes, zoals aggregatie of degranulatie 13. In grote lijnen bloedplaatjes en bloedplaatjes concentraten te beoordelen, uitgebreide modellen van hemostase zijn onmisbaar, en deze moeten hydrodynamica bevatten. Bloedreologie cruciaal bloedplaatjes gedrag correct te interpreteren in hemostase 14, 15 of 16 trombose, zelfs als anticoagulatie verhindert Ca2 + en / of trombine te nemen in aanwezigheid van citraat of heparine respectievelijk 2. Om de wisselwerking tussen coagulatie en functie van de bloedplaatjes studeren onder stroom 17, 18, normale trombinevorming is vereist, en derhalve vrij Ca2 + ook. De experimentele opstelling voor het bestuderen hemostase onder deze omstandigheden is complex, omdat maatregelen "artefact" of ongecontroleerde activering van bloedstolling moet zoveel mogelijk worden voorkomen. Bovendien hebben veel gespecialiseerde onderzoeksgroepen gebruiken op maat gemaakte hardware 19, 20, die een aanzienlijke inter-laboratorium variabiliteit veroorzaakt 5. Typische beperkingen van deze benadering is het gebruik van rechthoekige vorm, niet-pulserende stromingsprofielen en niet-humane oppervlaktebekledingen 5. De test hier beschreven gebruikt handel verkrijgbare gereedschappen en derhalve geschikt zijn voor normalisatie.
Omdat de stollingscascade reactie gemakkelijk wordt geactiveerd zodra bloed niet is opgenomen in het menselijk lichaam, bestuurd recalcificatietijd is een cruciale stap. To dit te bereiken, de toevoeging van Ca 2+ moet worden uitgesteld tot vlak voor perfusie over de reactieve collageen oppervlak, want als de Ca 2+ buffer wordt geleverd in bulk aan statische bloed, stolling vindt onvermijdelijk plaats, uiteindelijk verstopping van de slang en vertekenende data interpretatie (gegevens niet getoond). De oplossing voor dit probleem is om de Ca2 + buffer en het bloed afzonderlijk te pompen, waardoor het mengen van convectie en diffuse krachten tijdens perfusie op weg naar de analysekamer. Volledige menging wordt bereikt in een 46-cm slangsegment tussen de meng- en analyse kamers. Deze lengte werd berekend voor de optimale verblijftijd van de reagentia te mengen op basis van fundamentele wetten van massa- en convectief transport 21 tijdens perfusie met een debiet gebruikt (1000 s-1). Deze aanpak bleek controleerbaar en reproduceerbaar.
Contactactivering van coagulatie wordt soms gezien als een artefact van eenvoudigebemonstering en bloed te vermijden bij de interpretatie van stollingstijden. Daarom hebben we aangetoond dat, in afwezigheid van remmers, contact-geïnduceerde coagulatie begint bij 16,7 min (± 3,7 min) van perfusie. In aanwezigheid van CTI tot FXIIa gemedieerde contact activatie remt, wordt in de coagulatie niet willekeurig gedefinieerd verloop van het experiment (30 min) ingeleid. Dit venster van experimenteren is voldoende lang om monsters die pro- of anti-trombose zijn te onderscheiden. Hoewel coagulatie bij contact met de activering van een ongewenst gevolg van het bloed in contact brengen kunstgras kan zijn, onze gegevens tonen een duidelijke biologische dosis effect van bloedplaatjes. Dit kan van belang zijn voor transfusie geneeskunde, omdat recente bevindingen op FXII, bloedplaatjes polyfosfaten 10, fosfatidylserine distributie 22 en bloedplaatjes micropartikels 23 daadwerkelijk geherwaardeerd contact route coagulatie als een belangrijke bijdrage aan de hemostase, evooral in de context van trombose 24. Bijvoorbeeld kan de variabele opbrengst aan bloedplaatjes bij patienten of variabele phosphatidylserine expressie van opgeslagen bloedplaatjes aldus variabiliteit induceren therapeutische werking indien succesvol coagulatie wordt getoond afhankelijk van deze factoren.
Door co-immobilisatie gelipideerde rhTF met collageen, de extrinsieke coagulatie route of TF route wordt geactiveerd tijdens afzetting van bloedplaatjes op collageen. Hierdoor wordt de bepaling om de meest uitgebreide modus als voorbeeld voor verwondingen die bloed in contact brengen met TF-dragende cellen en weefsels. Onze gegevens tonen aan dat co-immobilisatie van collageen en TF vermindert het moment van coagulatie optreden, maar niet de snelheid van de bloedstolling niet. Van belang is de hoeveelheid rhTF geïmmobiliseerd aan het oppervlak is een belangrijke variabele in het model 25, 26 en gelijk te trekken binnen een gegeven onderzoek. In de presence CTI, kan het TF pathway uitsluitend bestudeerd (niet getoond) omdat contactactivering voorkomen.
Concluderend onze experimentele opstelling combineert een model van transfusie door reconstitutie van trombocytopenische bloed met dwarshelling bloedplaatjes en een model van hemostase door calcium-afhankelijke afzetting van trombocyten en fibrinevorming onder hydrodynamische stroming. Deze test wordt gebruikt om vragen over de procoagulant aard van opgeslagen bloedplaatjes beantwoorden en de effecten bloedplaatjesconcentraat bereidingstechnieken hebben op deze.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd gesteund door de Stichting voor Onderzoek en Ontwikkeling van het Belgische Rode Kruis-Vlaanderen Dienst voor het Bloed. Wij erkennen financiële steun van "Bijzonder onderzoeksfond" (BOF - BOF) aan de Universiteit Gent voor het project met een contract nummer BOF30290744.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Syringe | BD | A00434 | |
| 10 mL Syringe | BD | 309604 | |
| 2 mL Syringe | BD | 307727 | |
| Alexa Fluor 405 | Life Technologies | A30100 | The manufacturer's manual was followed for labeling of fibrinogen |
| BD vacutainer Eclipse | Becton, Dickinson and Company | 368650 | Blood collection needle with preattached holder |
| BD vacutainer tube with EDTA | Becton, Dickinson and Company | 368856 | |
| BD vacutainer tube with Sodium Citrate | Becton, Dickinson and Company | 366575 | |
| Blocking buffer | in house preparation | in house preparation | 1.0% (w/v) bovine serum albumin and 0.1% (w/v) glucose in HBS |
| Calcein AM | Molecular probes | C1430 | |
| Coagulation buffer | in house preparation | in house preparation | 10 mM CaCl2 and 3.75 mM MgCl2 in HBS |
| Conical tube 15 mL | Greiner bio-one | 1888271 | |
| Conical tube 50 mL | Greiner bio-one | 227261 | |
| Corn trypsin inhibitor (CTI) | Enzyme Research Laboratories | CTI | |
| Denaturated alcohol | Fiers | T0011.5 | |
| DiOC6 | Sigma-Aldrich | 318426 | 3,3′-Dihexyloxacarbocyanine iodide - 1 mM solution in DMSO |
| Exigo microfluidic pump | Cellix | EXIGO-PC-FS7.0-MF | |
| Fibrinogen | Sigma-Aldrich | F3879 | Labelled in house with AF 405 - stock concentration 10.7 mg/mL |
| Hematology analyzer | Sysmex | pocH-100i | |
| HEPES buffered saline (HBS) | in house preparation | in house preparation | 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) buffered saline (0.9% (w/v) NaCl), pH 7.4 |
| Horm Collagen | Takeda/Nycomed | 1130630 | Native equine tendon collagen (type I) Isotonic glucose solution to dilute collagen is supplemented |
| Humidified box | Cellix | HUMID-BOX | |
| Incubation water bath | GFL | 1013 | |
| Microscope | Zeiss | Axio Observer Z1 | equipped with a colibri-LED and high resolution CCD camera |
| Mirus Evo Nanopump | Cellix | 188-MIRUS-PUMP-EVO | with Multiflow8 |
| Pipette | Brand | A03429 | |
| Pipette tips 100-1000 | Greiner bio-one | 740290 | |
| Pipette tips 1-10 | Eppendorf | A08928 | |
| Pipette tips 2-200 | Greiner bio-one | 739280 | |
| Platelet concentrate orbital shaker | Helmer | PF-48i | |
| Precision wipes | Kimtech | 5511 | |
| Pepsin solution | Hanna instrument | HI7073L | 2 g pepsin per 75 mL solution, Protein cleaning solution with pepsin |
| Recombinant Human Tissue Factor Innovin | Dade Berhing | B4212-40 | rhTF with synthetic phospholipids |
| Software microscope | Zeiss | N/A | ZEN 2012 |
| Sterile docking device | Terumo BCT | TSCD | |
| Table Top Centrifuge | Eppendorf | 521-0095 | |
| Tube Roller | Ratek | BTR5-12V | |
| Tubing Sealer | Terumo BCT | AC-155 | |
| Vena8 syringe connector pin | Cellix | CONNECTORS-B1IC-PACK100 | |
| Vena8 Fluoro+ Biochips | Cellix | 188V8CF-400-100-02P10 | Coated biochip |
| Vena8 Needles | Cellix | SS-P-B1IC-B1OC-PACK200 | |
| Vena8 Tubing | Cellix | TUBING-TYGON-B1IC-B1OC-ROLL 100F | |
| VenaDelta Y1 Biochips | Cellix | VDY1-400-100-01-02 | Mixing biochip |
| Vortex mixer | VWR | 58816-121 | |
| ZEN2012 software | Zeiss |
References
- Levi, M., Hunt, B. J. A critical appraisal of point-of-care coagulation testing in critically ill patients. J. Thromb. Haemost. 13 (11), 1960-1967 (2015).
- Van Aelst, B., Feys, H. B., Devloo, R., Vandekerckhove, P., Compernolle, V. Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro. J. Vis. Exp. (109), e53823 (2016).
- Witt, S. M., et al. Identification of platelet function defects by multi-parameter assessment of thrombus formation. Nat. Commun. 5, 4257 (2014).
- Cazenave, J. P., et al. Preparation of washed platelet suspensions from human and rodent blood. Methods Mol. Biol. 272, 13-28 (2004).
- Roest, M., et al. Flow chamber-based assays to measure thrombus formation in vitro: requirements for standardization. J. Thromb. Haemost. 9 (11), 2322-2324 (2011).
- Zwaal, R. F., Comfurius, P., Bevers, E. M.
- Dargaud, Y., Luddington, R., Baglin, T. P. Elimination of contact factor activation improves measurement of platelet-dependent thrombin generation by calibrated automated thrombography at low-concentration tissue factor. J. Thromb. Haemost. 4 (5), 1160-1161 (2006).
- Bevers, E. M., et al. Defective Ca(2+)-induced microvesiculation and deficient expression of procoagulant activity in erythrocytes from a patient with a bleeding disorder: a study of the red blood cells of Scott syndrome. Blood. 79 (2), 380-388 (1992).
- Bevers, E. M., Comfurius, P., van Rijn, J. L., Hemker, H. C., Zwaal, R. F. Generation of prothrombin-converting activity and the exposure of phosphatidylserine at the outer surface of platelets. Eur. J. Biochem. 122 (2), 429-436 (1982).
- Muller, F., et al. Platelet polyphosphates are proinflammatory and procoagulant mediators in vivo. Cell. 139 (6), 1143-1156 (2009).
- Smith, S. A., et al. Polyphosphate modulates blood coagulation and fibrinolysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (4), 903-908 (2006).
- Tiberghien, P., Follea, G., Muller, J. Y.
- Deckmyn, H., Feys, H. B. Assays for quality control of platelets for transfusion. ISBT Science Series. 8 (1), 221-224 (2013).
- Sakariassen, K. S., Bolhuis, P. A., Sixma, J. J. Human blood platelet adhesion to artery subendothelium is mediated by factor VIII-Von Willebrand factor bound to the subendothelium. Nature. 279 (5714), 636-638 (1979).
- Alevriadou, B. R., et al. Real-time analysis of shear-dependent thrombus formation and its blockade by inhibitors of von Willebrand factor binding to platelets. Blood. 81 (5), 1263-1276 (1993).
- Nesbitt, W. S., et al. A shear gradient-dependent platelet aggregation mechanism drives thrombus formation. Nat. Med. 15 (6), 665-673 (2009).
- Stalker, T. J., et al. Hierarchical organization in the hemostatic response and its relationship to the platelet-signaling network. Blood. 121 (10), 1875-1885 (2013).
- Swieringa, F., Kuijpers, M. J., Lamers, M. M., vander Meijden, P. E., Heemskerk, J. W. Rate-limiting roles of the tenase complex of factors VIII and IX in platelet procoagulant activity and formation of platelet-fibrin thrombi under flow. Haematologica. 100 (6), 748-756 (2015).
- McDonald, J. C., et al.
- Gutierrez, E., et al. Microfluidic devices for studies of shear-dependent platelet adhesion. Lab. Chip. 8 (9), 1486-1495 (2008).
- Hartman, R. L., McMullen, J. P., Jensen, K. F. Deciding whether to go with the flow: evaluating the merits of flow reactors for synthesis. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 50 (33), 7502-7519 (2011).
- Podoplelova, N. A., et al. Blood coagulation factors bound to procoagulant platelets are concentrated in their cap structures to promote clotting. , Blood. (2016).
- Der Meijden, P. E. V. an, et al. Platelet- and erythrocyte-derived microparticles trigger thrombin generation via factor XIIa. J. Thromb. Haemost. 10 (7), 1355-1362 (2012).
- Nickel, K. F., et al. The polyphosphate-factor XII pathway drives coagulation in prostate cancer-associated thrombosis. Blood. 126 (11), 1379-1389 (2015).
- Okorie, U. M., Denney, W. S., Chatterjee, M. S., Neeves, K. B., Diamond, S. L. Determination of surface tissue factor thresholds that trigger coagulation at venous and arterial shear rates: amplification of 100 fM circulating tissue factor requires flow. Blood. 111 (7), 3507-3513 (2008).
- Shen, F., Kastrup, C. J., Liu, Y., Ismagilov, R. F. Threshold response of initiation of blood coagulation by tissue factor in patterned microfluidic capillaries is controlled by shear rate. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 28 (11), 2035-2041 (2008).
