Dette notatet beskriver en eksperimentell modell av hemostase som samtidig måler blodplatefunksjon og koagulasjon. Blodplater og fibrin fluorescensen måles i sanntid, og blodplateadhesjon hastighet, koagulering hastighet, og begynnende koagulering blir bestemt. Modellen blir brukt til å bestemme blodplate prokoaguleringsbetingelser egenskaper under strømning i konsentrater for transfusjon.
Microfluidic modeller av hemostase vurdere platefunksjonen under forhold med hydrodynamisk skjær, men i nærvær av antikoagulantia, er denne analysen begrenset til blodplateavleiring bare. Den intrikate forholdet mellom Ca 2+ -avhengige koagulasjon og blodplatefunksjon krever forsiktig og kontrollert recalcification av blod før analyse. Vårt oppsett bruker en Y-formet blande kanal, som leverer konsentrert Ca 2+ / Mg 2+ buffer til å strømme blod rett før perfusjon, muliggjør rask recalcification uten prøve stasis. En ti-gangers forskjell i strømningshastighet mellom de to reservoarene minimaliserer fortynning. Den recalcified blod blir deretter perfusert i en kollagen-belagte analyse kammer, og differensial merking tillater sanntids avbildning av både blodplater og fibrin-avsetning ved hjelp av fluorescens videomikroskopi. Systemet bruker kun kommersielt tilgjengelige verktøy, øker sjansene for standardisering. Tilberedning av thrombocytopenic blod med blodplater fra banked konsentrerer seg dessuten modeller platetransfusjon, beviser dens bruk i denne forskningen domenet. Eksempler på data vist at koagulering angrep og fibrinavsetning var lineært avhengig av platekonsentrasjon, noe som bekrefter forholdet mellom primær og sekundær hemostase i vår modell. I en tidsramme på 16 perfusjon min, fikk kontakt aktiveringen ikke finne sted, til tross for recalcification til normal Ca 2+ og Mg 2+ nivåer. Når koagulasjonsfaktor Xlla ble inhibert med mais-trypsininhibitor, denne tidsrammen var enda lenger, noe som indikerer en betydelig dynamisk område hvor endringene i prokoagulerende arten av blodplatene kan vurderes. Co-immobilisering av vev faktor med kollagen betydelig redusert tid til utvikling av koagulering, men ikke dens hastighet. Alternativet for å studere vevsfaktor og / eller kontaktveien øker allsidigheten og anvendeligheten av analysen.
Primær og sekundær hemostase ble opprinnelig begrepsfestet som to relativt separable biokjemiske prosesser. Primær hemostase ble sett på som en viktig bidragsyter i det arterielle strømningsforhold, med en nøkkelrolle for blodplater, mens sekundær hemostase ble sett å dominere koagulasjon etter venøs blodstrøm, slik at protease kaskade å danne uløselig fibrin. De siste tiårene har omformet dette tradisjonelle synet betydelig, erkjenne at plateaktivering og koagulasjon er avhengige av hverandre og er like viktige prosesser i løpet av fysiologisk og patologisk hemostase i alle (ikke-ekstreme) hydrodynamiske miljøer. Dette synet har blitt oversatt til klinikken, der analyser utviklet omfattende måle fullblods koagulasjon brukes stadig mer, men med mange gjenværende spørsmål om relevans, anvendbarhet og nytte en.
Vi har nylig publisert en funksjonell analyse av blodplatekonsentrater ved hjelp av microfluidic strømningskamrene er belagt med fibrillær kollagen i en in vitro modell for transfusjon 2, med prøver som inneholder normale mengder av røde blodlegemer, plasma og blodplater. Denne metoden benytter heparin eller hirudin antikoagulert blod, noe som tyder på ingen eller begrenset involvering av sekundær hemostase, som er avhengig av trombindannelsen og ionisert kalsium (Ca2 +). For å støtte trombin formasjon og dermed til å omfatte alle aspekter av hemostase etter mikrofluidstrømning, utviklet vi en komplementær metode på samme tekniske plattform, nå inkludert gratis Ca 2+. På denne måte kan blodplateavleiring og fibrindannelse studeres, igjen i en modell av blodplatetransfusjon, for å vurdere blodplatekonsentrat kvalitet.
I denne metoden, blir blodplater og fibrinogen merket med fluoroforer som har fullt adskilt emisjonsspektra. Dual farge, tillater real-time video mikroskopi da analysen avprimære blodplateadhesjon, samt koagulering initiering og fibrinavsetning. En viktig variabel i denne type analyse er recalcification, fordi tilsetningen av Ca 2+ til statisk blod, før perfusjon, vil uunngåelig føre til at kontakt-initiert koagulering i beholderen. Denne innvielsen vil skjevhet avlesning på grunn av tilstopping av rør og biochip viker før perfusjon. Derfor, i vår fremgangsmåte, citrat antikoagulert blod og en Ca2 + -holdig buffer pumpes separat gjennom de øvre ben av et Y-formet innløpskammer. Komponentene blandes i løpet av perfusjon før de går inn et analysekammer belagt med kollagen alene eller i kombinasjon med rekombinant human vevsfaktor (rhTF). Ved å tilpasse strømningshastigheter av de separate pumper og konsentrasjonen av Ca 2+ i bufferen, tar en 10% fortynning av den endelige blodprøven sted.
Ved hjelp av denne utvidede protokollen, viser vi bidraget fra coagulasjon faktor XII (FXII) og blodplatekonsentrasjonen å kontakte pathway koagulering start i henhold flyt. Våre data viser også at ved å belegge rhTF sammen med kollagen, det vevsfaktor pathway måles samtidig.
Transfusjon av blodplatekonsentrater er foreskrevet for trombocytopenisk pasienten for å hindre eller stoppe blødninger. Dens klinisk effekt ble nylig markert i en historisk gjennomgang av akutt leukemi 12, minner om at økt overlevelse av pediatriske pasienter i sekstitallet og syttitallet var stort sett tilskrives forbedringer i (trombocytter) transfusjonsmedisin. Trombocyttkonsentrater brukes også til å demme blødning i akutt traume eller under operasjonen. Under disse forholdene, er blodplater med gode prokoaguleringsbetingelser egenskaper som hurtig initiere hemostase foretrukket, men blodplatekonsentratene blir fremstilt fra donasjoner av frivillige givere, og i motsetning farmakologiske medikamenter, er standardisert ved fremstillingen, ikke ved (kjemisk) masse. Derfor flere spørsmål innen blod banktjenester er ubesvart, inkludert de på optimale donasjon modaliteter, lagringsforhold og transfusjonspraksis. I feltet av platelet (blodoverføring) biologi, mange spørsmål på celle klaring fra sirkulasjon, bidrag transfundert blodplater til hemostase, eller deres immunologi også forbli ubesvart.
Tallrike laboratorieteknikker for platefunksjon analyse er tilgjengelige, men disse stort sett løse et entall aspekt av platefunksjon, som aggregering eller degranulation 13. For å vurdere blodplater og plate konsentrater bredt, omfattende modeller av hemostase er uunnværlig, og disse må inkludere hydrodynamikk. Blod reologi er avgjørende for å tolke blodplate oppførsel under hemostase 14, 15 eller 16 trombose, selv om antikoagulasjon hindrer Ca2 + og / eller trombin for å delta i nærvær av henholdsvis 2-citrat eller heparin,. For å studere samspillet mellom koagulasjon og blodplatefunksjon i henhold flyt 17, 18, normal trombindannelsen er nødvendig, og derfor fri Ca2 + i tillegg. Det eksperimentelle oppsettet for å studere hemostase under disse betingelser er komplisert, fordi tiltak for å hindre "gjenstand" eller ukontrollert aktivering av koagulering skal tas så mye som mulig. Videre mange spesialiserte forskningsgrupper bruker skreddersydde maskinvare 19, 20, noe som fører til betydelig inter-laboratoriet variabilitet 5. Typiske begrensninger av denne tilnærmingen er bruk av rektangulære beholdere, ikke-pulserende strømning profiler, og ikke-humane overflatebelegg 5. Analysen vi beskriver her bruker kommersielt tilgjengelige verktøy og kan derfor være egnet for standardisering.
Fordi koagulasjonskaskaden reaksjonen lett aktiveres når blod ikke er inneholdt i det menneskelige legeme, er kontrollert recalcification en dreietrinn. To oppnå dette, tilsetning av Ca 2+ som må utsettes til like før perfusjon, over det reaktive kollagen overflate, fordi når Ca 2 + buffer leveres i bulk til statisk blod, finner koagulering sted uunngåelig, etterhvert tetter igjen røret og biasing data tolkning (data ikke vist). Løsningen på dette problemet er å pumpe den Ca2 + buffer og blodet hver for seg, slik at for blanding av konvektive og diffusiv styrker under perfusjon på sin vei til analysekammeret. Fullstendig blanding er oppnådd i en 46-cm segment av produksjonsrøret mellom blandings- og analysekamrene. Denne lengden ble beregnet for optimal holdetid av reagenser til å blande basert på grunnleggende lover masse og konvektive transport 21 under perfusjon ved strømningshastighet benyttes (1000 s -1). Denne tilnærmingen viste seg kontrollerbar og reproduserbar.
Kontakt aktivering av koagulasjon er ofte sett på som et produkt av enkleblodprøvetaking og unngås ved tolkning av koaguleringstider. Derfor har vi demonstrert at, i fravær av inhibitorer, starter kontakt-indusert koagulasjon ved 16,7 min (± 3,7 min) av perfusjon. I nærvær av CTI å inhibere FXIIa-mediert kontakt aktivering, er koagulasjon ikke innledet under vilkårlig definert løpet av eksperimentet (30 min). Dette vinduet eksperimentering er tilstrekkelig lang til å skjelne prøver som er pro- eller antitrombotisk. Selv om koagulering ved kontakt aktivering kan være en uønsket konsekvens av blod i kontakt kunstige overflater, våre data viser en tydelig biologisk dose virkning av blodplater. Dette kan være viktig for transfusjonsmedisin, fordi nyere funn på FXII, polyfosfater plate 10, fosfatidylserin distribusjon 22, og platemikropartiklene 23 har faktisk revurdert kontakt sti koagulasjon som en viktig bidragsyter til hemostase, espesielt i sammenheng med trombose 24. For eksempel kan den variable utbyttet av blodplatetransfusjon i pasienter eller den variable fosfatidylserin ekspresjon av doserte blodplater og dermed fremkalle variasjoner i terapeutisk effektivitet hvis det lykkes koagulering er vist å være avhengig av disse faktorene.
Ved å co-immobilisere lipidert rhTF med kollagen, ytre koagulasjon rute, eller TF vei, aktiveres under plate avsetning på kollagen. Dette utvider analysen til sin mest omfattende modus, som en modell for skader som bringer blod i kontakt med TF-bærende celler og vev. Våre data viser at ko-immobilisering av kollagen og TF reduserer øyeblikk av koagulasjon utbruddet, men ikke forandre graden av koagulering. Av notatet, mengden av rhTF immobilisert til overflaten, er en viktig variabel i denne modellen 25, 26 og bør være standardisert innenfor en gitt studie. I gavece av CTI, kan TF veien skal studeres utelukkende (ikke vist) fordi kontaktaktivering blir forhindret.
Konklusjonen vår eksperimentelle oppsettet kombinerer en modell av transfusjon ved tilberedning av trombocytopenisk blod med banked blodplater og en modell av hemostase ved kalsiumavhengig blodplateavleiring og fibrin formasjon under hydrodynamisk flyt. Denne analysen vil bli brukt til å svare på spørsmål på den prokoagulerende arten av doserte blodplater og virkningene blodplatekonsentrat prepareringsteknikker har på denne.
The authors have nothing to disclose.
Denne forskningen ble støttet av Fondet for forskning og utvikling av den belgiske Røde Kors-Flandern Blood service. Vi erkjenner økonomisk støtte fra "Bijzonder onderzoeksfond" (BOF – spesiell forskningsfond) fra Ghent universitet bevilget til prosjektet med kontraktsnummer BOF30290744.
1 mL Syringe | BD | A00434 | |
10 mL Syringe | BD | 309604 | |
2 mL Syringe | BD | 307727 | |
Alexa Fluor 405 | Life Technologies | A30100 | The manufacturer's manual was followed for labeling of fibrinogen |
BD vacutainer Eclipse | Becton, Dickinson and Company | 368650 | Blood collection needle with preattached holder |
BD vacutainer tube with EDTA | Becton, Dickinson and Company | 368856 | |
BD vacutainer tube with Sodium Citrate | Becton, Dickinson and Company | 366575 | |
Blocking buffer | in house preparation | in house preparation | 1.0% (w/v) bovine serum albumin and 0.1% (w/v) glucose in HBS |
Calcein AM | Molecular probes | C1430 | |
Coagulation buffer | in house preparation | in house preparation | 10mM CaCl2 and 3.75 mM MgCl2 in HBS |
Conical tube 15mL | Greiner bio-one | 1888271 | |
Conical tube 50mL | Greiner bio-one | 227261 | |
Corn trypsin inhibitor (CTI) | Enzyme Research Laboratories | CTI | |
Denaturated alcohol | Fiers | T0011.5 | |
DiOC6 | Sigma-Aldrich | 318426 | 3,3′-Dihexyloxacarbocyanine iodide – 1mM solution in DMSO |
Exigo microfluidic pump | Cellix | EXIGO-PC-FS7.0-MF | |
Fibrinogen | Sigma-Aldrich | F3879 | Labelled in house with AF 405 – stock concentration 10.7 mg/mL |
Hematology analyzer | Sysmex | pocH-100i | |
HEPES buffered saline (HBS) | in house preparation | in house preparation | 10mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) buffered saline (0.9% (w/v) NaCl, pH 7.4 |
Horm Collagen | Takeda/Nycomed | 1130630 | Native equine tendon collagen (type I) Isotonic glucose solution to dilute collagen is supplemented |
Humidified box | Cellix | HUMID-BOX | |
Incubation water bath | GFL | 1013 | |
Microscope | Zeiss | Axio Observer Z1 | equipped with a colibri-LED and high resolution CCD camera |
Mirus Evo Nanopump | Cellix | 188-MIRUS-PUMP-EVO | with Multiflow8 |
Pipette | Brand | A03429 | |
Pipette tips 100-1000 | Greiner bio-one | 740290 | |
Pipette tips 1-10 | Eppendorf | A08928 | |
Pipette tips 2-200 | Greiner bio-one | 739280 | |
Platelet concentrate orbital shaker | Helmer | PF-48i | |
Precision wipes | Kimtech | 5511 | |
Pepsin solution | Hanna instrument | HI7073L | 2g pepsin per 75 ml solution, Protein cleaning solution with pepsin |
Recombinant Human Tissue Factor Innovin | Dade Berhing | B4212-40 | rhTF with synthetic phospholipids |
Software microscope | Zeiss | N/A | ZEN 2012 |
Sterile docking device | Terumo BCT | TSCD | |
Table Top Centrifuge | Eppendorf | 521-0095 | |
Tube Roller | Ratek | BTR5-12V | |
Tubing Sealer | Terumo BCT | AC-155 | |
Vena8 syringe connector pin | Cellix | CONNECTORS-B1IC-PACK100 | |
Vena8 Fluoro+ Biochips | Cellix | 188V8CF-400-100-02P10 | Coated biochip |
Vena8 Needles | Cellix | SS-P-B1IC-B1OC-PACK200 | |
Vena8 Tubing | Cellix | TUBING-TYGON-B1IC-B1OC-ROLL 100F | |
VenaDelta Y1 Biochips | Cellix | VDY1-400-100-01-02 | Mixing biochip |
Vortex mixer | VWR | 58816-121 | |
ZEN2012 software | Zeiss |