Este trabalho descreve um modelo experimental de hemostasia que mede simultaneamente a função plaquetária e coagulação. Plaquetas e fibrina de fluorescência é medida em tempo real, e taxa de adesão de plaquetas, taxa de coagulação, e o início da coagulação são determinados. O modelo é usado para determinar as propriedades pró-coagulantes de plaquetas sob fluxo em concentrados para transfusão.
modelos de microfluidos de hemostasia avaliar a função das plaquetas em condições de cisalhamento hidrodinâmico, mas na presença de anticoagulantes, esta análise é restrita apenas a deposição de plaquetas. A intrincada relação entre o Ca 2+ função de coagulação e plaquetas dependente requer recalcificação cuidadosa e controlada de sangue antes da análise. A nossa configuração usa um canal de mistura em forma de Y, que fornece Ca 2+ / Mg 2+ tampão concentrado para fluir sangue imediatamente antes da perfusão, permitindo recalcificação rápida sem estase amostra. Uma diferença de dez vezes na velocidade de fluxo entre ambos os reservatórios minimiza a diluição. O sangue é então perfundido recalcified em uma câmara de análise revestidos com colagénio, e rotulagem diferencial permite a imagem em tempo real, de ambas a deposição de plaquetas e de fibrina através de microscopia de fluorescência de vídeo. O sistema utiliza apenas ferramentas disponíveis comercialmente, aumentando as chances de padronização. Reconstituição do throsangue mbocytopenic com plaquetas de bancarizada concentra, além disso, os modelos transfusão de plaquetas, provando o seu uso neste domínio de investigação. Exemplos de dados demonstraram que o início da coagulação e deposição de fibrina foram linearmente dependente da concentração de plaquetas, confirmando a relação entre a hemostase primária e secundária no nosso modelo. Em um prazo de 16 perfusão min, a ativação de contas não ocorreu, apesar recalcificação para Ca normais 2+ e Mg 2+ níveis. Quando o factor de coagulação XII foi inibida pelo inibidor de tripsina de milho, este período de tempo foi ainda mais longo, indicando uma considerável gama dinâmica na qual as mudanças na natureza pró-coagulante das plaquetas pode ser avaliado. Co-imobilização do factor de tecido com colagénio reduziu significativamente o tempo de início da coagulação, mas não a sua taxa. A opção para estudar o factor de tecido e / ou a via de contacto aumenta a versatilidade e utilidade do ensaio.
hemostasia primária e secundária foram originalmente conceituado como dois processos bioquímicos relativamente separáveis. hemostasia primária era visto como um dos principais contribuintes em condições de fluxo arterial, com um papel fundamental para plaquetas, enquanto que a hemostasia secundária foi visto a dominar a coagulação sob fluxo de sangue venoso, permitindo que a cascata de protease para formar fibrina insolúvel. As últimas décadas têm remodelado essa visão tradicional substancialmente, reconhecendo que a ativação plaquetária e coagulação são interdependentes e são processos igualmente importantes durante a hemostasia fisiológico e patológico em todos (não-extremos) meios hidrodinâmicas. Este ponto de vista foi traduzida para a clínica, onde ensaios concebidos para medir de forma abrangente a coagulação do sangue total são cada vez mais utilizados, embora com muitas perguntas restantes sobre a relevância, aplicabilidade e utilidade 1.
Recentemente, publicou uma análise funcional das plaquetasconcentrados utilizando câmaras de fluxo de microfluidos revestidas com colagénio fibrilar num modelo in vitro de transfusão de 2, com amostras contendo quantidades normais de células vermelhas do sangue, plasma e plaquetas. Este método utiliza heparina ou hirudina sangue anticoagulado, implicando o envolvimento ou não limitada de hemóstase secundário, que é dependente da geração de trombina e cálcio ionizado (Ca 2+). Para apoiar a formação de trombina e, portanto, para incluir todos os aspectos da hemostasia sob fluxo microfluídico, foi desenvolvido um método complementar na mesma plataforma técnica, incluindo agora livre de Ca2 +. Deste modo, a deposição de plaquetas e formação de fibrina pode ser estudada, novamente em um modelo de uma transfusão de plaquetas, para avaliar a qualidade do concentrado de plaquetas.
Neste método, as plaquetas e fibrinogénio são marcados com fluoróforos que totalmente separados espectros de emissão. cor dupla, microscopia de vídeo em tempo real, em seguida, permite a análise deadesão de plaquetas primária, bem como a iniciação da coagulação e deposição de fibrina. Uma variável importante neste tipo de ensaio é de recalcificação, porque a adição de Ca 2+ para sangue estático, antes da perfusão, inevitavelmente provocar a coagulação iniciada por contacto no recipiente. Esta iniciação vai polarizar a leitura, devido ao entupimento de tubagem e biochip entradas antes da perfusão. Portanto, no nosso método, citrato de sangue anticoagulado e um tampão molecular contendo Ca2 + separadamente são bombeados através da parte superior das pernas de uma câmara de entrada em forma de Y. Os componentes são misturados durante a perfusão antes de entrar numa câmara de análise revestidos com colagénio sozinho ou em combinação com o factor tecidular humano recombinante (rhTF). Ao adaptar as velocidades de fluxo das bombas separadas e a concentração de Ca 2+ no buffer, uma diluição de 10% da amostra de sangue final tem lugar.
Usando este protocolo estendido, que demonstram a contribuição de coágulosfator ção XII (FXII) e concentração de plaquetas entrar em contato com a iniciação via de coagulação sob fluxo. Os nossos dados também mostram que por revestimento rhTF ao lado de colagénio, a via do factor de tecido pode ser medida simultaneamente.
A transfusão de concentrados de plaquetas é prescrito para o paciente trombocitopênica para prevenir ou parar o sangramento. O seu impacto clínico foi recentemente destacado em uma revisão histórica da leucemia aguda 12, lembrando que o aumento das taxas de sobrevivência de pacientes pediátricos nos anos sessenta e setenta foram em grande parte atribuível a melhorias na (plaquetas) medicina transfusional. Os concentrados de plaquetas também são utilizados para limitar a hemorragia no trauma agudo ou durante a cirurgia. Nestas condições, as plaquetas com excelentes propriedades pró-coagulantes que iniciam rapidamente hemostasia são os preferidos, mas concentrados de plaquetas são preparadas a partir de doações de doadores voluntários e, ao contrário de medicação farmacológica, são padronizados pela preparação só, não pelo (química) composição. Portanto, várias questões no domínio dos bancos de sangue não são respondidas, incluindo aqueles sobre as modalidades ideais de doação, condições de armazenamento e práticas de transfusão. No campo de platelet (transfusão) biologia, muitas perguntas sobre a depuração da célula de circulação, a contribuição de plaquetas transfundidas para hemostasia, ou a sua imunologia também permanecem sem resposta.
Inúmeras técnicas de laboratório para análise de função plaquetária estão disponíveis, mas estes abordar principalmente um aspecto singular da função plaquetária, como agregação ou desgranulação 13. Para avaliar amplamente plaquetas e concentrados de plaquetas, modelos abrangentes de hemostasia são indispensáveis, e estes devem incluir hidrodinâmica. Reologia do sangue é crucial para interpretar correctamente o comportamento das plaquetas durante a hemostase 14, 15 ou 16, trombose, mesmo se a anticoagulação impede Ca2 + e / ou trombina para participar na presença de citrato ou heparina, respectivamente 2. Para estudar a interação entre coagulação e função das plaquetas sob fluxo de 17, 18, a geração de trombina normal é necessária, e por conseguinte, livre de Ca 2+, bem. A instalação experimental para o estudo da hemostasia sob estas condições é complexa, porque as medidas para evitar o "artefacto" ou de activação descontrolada da coagulação deve ser feita, tanto quanto possível. Além disso, muitos grupos de pesquisa especializados usar feito por hardware 19, 20, o que provoca substancial variabilidade inter-laboratorial 5. Limitações típicas desta abordagem, são o uso de recipientes rectangulares, perfis de fluxo não-pulsátil, e revestimentos de superfície não-humanos 5. O ensaio aqui descrito utiliza ferramentas disponíveis comercialmente e pode, portanto, ser adequado para a normalização.
Uma vez que a reacção da cascata da coagulação pode ser facilmente activada quando o sangue não está contido dentro do corpo humano, a recalcificação controlada é um passo essencial. TO conseguir isso, adição de Ca2 + deve ser adiada até imediatamente antes da perfusão sobre a superfície de colagénio reactivo, porque, quando o tampão de Ca2 + é fornecido em grandes quantidades de sangue estática, coagulação inevitavelmente toma lugar, eventualmente, o entupimento da tubagem e dados de polarização interpretação (dados não mostrados). A solução para este problema é a bombear o tampão de Ca2 + e o sangue separadamente, permitindo a mistura de forças de convecção e de difusão durante a perfusão no seu caminho para a câmara de análise. A mistura completa é conseguida num segmento de 46 cm de tubo entre as câmaras de mistura e de análise. Este comprimento foi calculado para o tempo de permanência óptimo de reagentes para misturar com base nas leis fundamentais de massa e transporte convectivo 21 durante a perfusão com o caudal utilizado (1.000 s -1). Esta abordagem mostrou controlável e reprodutível.
Contactar ativação da coagulação às vezes é visto como um artefato simplescoleta de sangue e deve ser evitado ao interpretar os tempos de coagulação. Portanto, foi demonstrado que, na ausência de inibidores, a coagulação induzida pelo contacto começa em 16,7 min (± 3,7 min) de perfusão. Na presença de CTI para inibir a activação de contacto FXIIa-mediada, coagulação não é iniciada durante o curso arbitrariamente definida da experiência (30 min). Esta janela de experimentação é suficientemente longo para discernir amostras que são pro- ou anti-trombótico. Apesar de coagulação através da activação de contacto pode ser uma consequência indesejada de sangue entrar em contato com superfícies artificiais, nossos dados demonstram um efeito da dose biológica clara de plaquetas. Isso pode ser importante para a medicina de transfusão, porque os resultados recentes sobre FXII, plaquetas polifosfatos 10, a distribuição fosfatidilserina 22 e micropartículas de plaquetas 23 têm realmente reavaliado contato via de coagulação como um importante contribuinte para a hemostasia, eespecialmente no contexto de trombose 24. Por exemplo, o rendimento variável de transfusões de plaquetas em pacientes ou a expressão fosfatidilserina variável de plaquetas inclinadas pode, assim, induzir a variabilidade na eficácia terapêutica de coagulação se bem sucedida é mostrado para depender destes factores.
Por co-imobilização rhTF lipidado com colagénio, a via de coagulação extrínseca, ou via TF, é activado durante a deposição de plaquetas em colagénio. Este estende-se o ensaio para o seu modo mais abrangente, como um modelo para ferimentos que trazem o sangue em contacto com as células e tecidos de suporte de TF. Os nossos dados mostram que a co-imobilização do colagénio e TF diminui o momento de início da coagulação, mas não altera a taxa de coagulação. É de notar que a quantidade de rhTF imobilizado à superfície é uma variável importante neste modelo 25, 26 e deve ser normalizada dentro de um determinado estudo. Na presenCE de CTI, a via de TF pode ser estudada exclusivamente (não mostrado) por activação de contacto é evitado.
Em conclusão, a nossa configuração experimental combina um modelo de transfusão por reconstituição de sangue trombocitopênica com plaquetas inclinadas e um modelo de hemostasia por deposição de plaquetas dependente de cálcio e formação de fibrina sob fluxo hidrodinâmico. Este ensaio será utilizado para responder a perguntas sobre a natureza pró-coagulante de plaquetas inclinadas e as técnicas de preparação de concentrado de plaquetas efeitos tem sobre este assunto.
The authors have nothing to disclose.
Esta pesquisa foi apoiada pela Fundação para a Investigação e Desenvolvimento do Serviço de Sangue da Cruz Vermelha-Flanders belga. Nós reconhecemos o apoio financeiro prestado por "Bijzonder onderzoeksfond" (BOF – fundo de investigação especial) da Universidade de Ghent concedida ao projecto com o número do contrato BOF30290744.
1 mL Syringe | BD | A00434 | |
10 mL Syringe | BD | 309604 | |
2 mL Syringe | BD | 307727 | |
Alexa Fluor 405 | Life Technologies | A30100 | The manufacturer's manual was followed for labeling of fibrinogen |
BD vacutainer Eclipse | Becton, Dickinson and Company | 368650 | Blood collection needle with preattached holder |
BD vacutainer tube with EDTA | Becton, Dickinson and Company | 368856 | |
BD vacutainer tube with Sodium Citrate | Becton, Dickinson and Company | 366575 | |
Blocking buffer | in house preparation | in house preparation | 1.0% (w/v) bovine serum albumin and 0.1% (w/v) glucose in HBS |
Calcein AM | Molecular probes | C1430 | |
Coagulation buffer | in house preparation | in house preparation | 10mM CaCl2 and 3.75 mM MgCl2 in HBS |
Conical tube 15mL | Greiner bio-one | 1888271 | |
Conical tube 50mL | Greiner bio-one | 227261 | |
Corn trypsin inhibitor (CTI) | Enzyme Research Laboratories | CTI | |
Denaturated alcohol | Fiers | T0011.5 | |
DiOC6 | Sigma-Aldrich | 318426 | 3,3′-Dihexyloxacarbocyanine iodide – 1mM solution in DMSO |
Exigo microfluidic pump | Cellix | EXIGO-PC-FS7.0-MF | |
Fibrinogen | Sigma-Aldrich | F3879 | Labelled in house with AF 405 – stock concentration 10.7 mg/mL |
Hematology analyzer | Sysmex | pocH-100i | |
HEPES buffered saline (HBS) | in house preparation | in house preparation | 10mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) buffered saline (0.9% (w/v) NaCl, pH 7.4 |
Horm Collagen | Takeda/Nycomed | 1130630 | Native equine tendon collagen (type I) Isotonic glucose solution to dilute collagen is supplemented |
Humidified box | Cellix | HUMID-BOX | |
Incubation water bath | GFL | 1013 | |
Microscope | Zeiss | Axio Observer Z1 | equipped with a colibri-LED and high resolution CCD camera |
Mirus Evo Nanopump | Cellix | 188-MIRUS-PUMP-EVO | with Multiflow8 |
Pipette | Brand | A03429 | |
Pipette tips 100-1000 | Greiner bio-one | 740290 | |
Pipette tips 1-10 | Eppendorf | A08928 | |
Pipette tips 2-200 | Greiner bio-one | 739280 | |
Platelet concentrate orbital shaker | Helmer | PF-48i | |
Precision wipes | Kimtech | 5511 | |
Pepsin solution | Hanna instrument | HI7073L | 2g pepsin per 75 ml solution, Protein cleaning solution with pepsin |
Recombinant Human Tissue Factor Innovin | Dade Berhing | B4212-40 | rhTF with synthetic phospholipids |
Software microscope | Zeiss | N/A | ZEN 2012 |
Sterile docking device | Terumo BCT | TSCD | |
Table Top Centrifuge | Eppendorf | 521-0095 | |
Tube Roller | Ratek | BTR5-12V | |
Tubing Sealer | Terumo BCT | AC-155 | |
Vena8 syringe connector pin | Cellix | CONNECTORS-B1IC-PACK100 | |
Vena8 Fluoro+ Biochips | Cellix | 188V8CF-400-100-02P10 | Coated biochip |
Vena8 Needles | Cellix | SS-P-B1IC-B1OC-PACK200 | |
Vena8 Tubing | Cellix | TUBING-TYGON-B1IC-B1OC-ROLL 100F | |
VenaDelta Y1 Biochips | Cellix | VDY1-400-100-01-02 | Mixing biochip |
Vortex mixer | VWR | 58816-121 | |
ZEN2012 software | Zeiss |