Questo articolo descrive un modello sperimentale di emostasi che misura contemporaneamente la funzione piastrinica e la coagulazione. Piastrine e di fibrina fluorescenza viene misurata in tempo reale, e il tasso di piastrine di adesione, il tasso di coagulazione, e l'inizio della coagulazione sono determinati. Il modello viene utilizzato per determinare le proprietà delle piastrine procoagulanti sotto flusso nei concentrati di trasfusione.
modelli microfluidica di emostasi valutare la funzione piastrinica in condizioni di taglio idrodinamica, ma in presenza di anticoagulanti, questa analisi è limitata al solo deposizione delle piastrine. Il rapporto intricato tra Ca 2+ funzione di coagulazione e delle piastrine-dipendente richiede un attento e controllato ricalcificazione di sangue prima dell'analisi. Il nostro programma di installazione utilizza un canale di miscelazione a forma di Y, che fornisce concentrato / Mg 2+ buffer di Ca 2+ al sangue che scorre appena prima di perfusione, consentendo una rapida ricalcificazione senza stasi campione. A differenza di dieci volte della velocità di flusso tra i due serbatoi minimizza diluizione. Il sangue ricalcificato viene perfuso in una camera di analisi collageno-rivestito ed etichettatura differenziale permette imaging in tempo reale sia deposizione di piastrine e di fibrina mediante fluorescenza microscopia video. Il sistema utilizza solo strumenti disponibili in commercio, aumentando le possibilità di standardizzazione. Ricostituzione di throsangue mbocytopenic con piastrine da sopraelevata si concentra, inoltre, modelli di una trasfusione di piastrine, dimostrando il suo impiego in questo settore di ricerca. dati esemplificativi dimostrato che la coagulazione insorgenza e deposizione di fibrina sono linearmente dipendente dalla concentrazione piastrinica, confermando il rapporto tra emostasi primaria e secondaria nel nostro modello. In un lasso di tempo di 16 min perfusione, attivazione contatto non ha avuto luogo, nonostante ricalcificazione alla normalità Ca 2+ e livelli di Mg 2+. Quando fattore di coagulazione XIIa stata inibita da inibitore della tripsina di mais, questo lasso di tempo era anche di più, indicando una gamma dinamica considerevole in cui le variazioni di natura procoagulante delle piastrine possono essere valutati. Co-immobilizzazione del fattore tissutale con il collagene ha ridotto significativamente il tempo di insorgenza della coagulazione, ma non il suo tasso. L'opzione per studiare il fattore tissutale e / o il percorso di contatto aumenta la versatilità e l'utilità del saggio.
emostasi primaria e secondaria sono stati originariamente concepita come due processi biochimici relativamente separabili. emostasi primaria è stato visto come un importante contributo in condizioni di flusso arterioso, con un ruolo chiave per le piastrine, mentre emostasi secondaria è stato visto a dominare la coagulazione sotto il flusso di sangue venoso, permettendo la cascata della proteasi per formare fibrina insolubile. Gli ultimi decenni hanno rimodellato questa visione tradizionale sostanzialmente, riconoscendo che l'attivazione piastrinica e la coagulazione sono interdipendenti e sono ugualmente importanti processi durante l'emostasi fisiologica e patologica in tutti i (non estremi) ambienti idrodinamici. Questo punto di vista è stato tradotto in clinica, dove sono sempre più utilizzati test ideati per misurare completo coagulazione del sangue intero, anche se con molte domande restanti rilevanza, l'applicabilità e l'utilità 1.
Abbiamo recentemente pubblicato una analisi funzionale di piastrineconcentrati usando camere di flusso microfluidica rivestite con collagene fibrillare in un modello in vitro di trasfusioni 2, con campioni contenenti livelli normali di globuli rossi, plasma e piastrine. Questo metodo utilizza l'eparina o irudina sangue anticoagulante, che non implica alcun o coinvolgimento limitato di emostasi secondaria, che dipende dalla produzione di trombina e calcio ionizzato (Ca 2+). Per sostenere la formazione di trombina e, quindi, per includere tutti gli aspetti della emostasi sotto flusso microfluidica, abbiamo sviluppato un metodo complementare sulla stessa piattaforma tecnica, tra cui la connessione ora Ca 2+. In questo modo, la deposizione piastrinica e la formazione di fibrina possono essere studiate, di nuovo in un modello di trasfusione di piastrine, di valutare la qualità concentrato piastrinico.
In questo metodo, le piastrine e fibrinogeno sono etichettati con fluorofori che sono completamente separati spettri di emissione. a due colori, il video microscopia in tempo reale quindi permette l'analisi diadesione piastrinica primario, nonché l'iniziazione coagulazione e deposizione di fibrina. Una variabile importante in questo tipo di saggio è ricalcificazione, perché l'aggiunta di Ca 2+ al sangue statico, prima perfusione, provoca inevitabilmente coagulazione contatto avviato nel contenitore. Questa iniziazione sarà pregiudizi la lettura a causa di intasamento dei tubi e biochip insenature prima di perfusione. Pertanto, nel nostro metodo, citrato sangue anticoagulato e un buffer -contenente Ca 2+ vengono pompati separatamente attraverso le cosce di una camera di ingresso a Y. I componenti sono miscelati durante la perfusione prima di entrare in camera di analisi rivestito con solo o in combinazione con il fattore tissutale umano ricombinante (rhTF) collagene. Adattando le velocità di flusso delle pompe separate e la concentrazione di Ca 2+ nel buffer, una diluizione 10% del campione di sangue finale avviene.
Usando questo protocollo esteso, dimostriamo il contributo di coagulifattore di XII (FXII) e la concentrazione delle piastrine di contattare via coagulazione iniziazione sotto flusso. I nostri dati mostrano anche che rivestendo rhTF fianco collagene, il fattore tissutale percorso può essere misurata in concomitanza.
La trasfusione di concentrati piastrinici è prescritto per il paziente trombocitopenica per prevenire o fermare l'emorragia. Il suo impatto clinico è stato recentemente evidenziato in una rassegna storica di leucemia acuta 12, ricordando che un aumento dei tassi di sopravvivenza dei pazienti pediatrici negli anni sessanta e settanta sono stati in gran parte attribuibile al miglioramento (piastrine) medicina trasfusionale. concentrati piastrinici sono utilizzati anche per arginare sanguinamento nel trauma acuto o durante l'intervento chirurgico. In queste condizioni, le piastrine con eccellenti proprietà procoagulanti che avviare rapidamente emostasi sono preferiti, ma concentrati piastrinici sono preparati da donazioni di donatori volontari e, a differenza farmaco farmacologico, standardizzati per la preparazione solo, non per la composizione (chimica). Pertanto, molte domande nel settore bancario sangue sono risposta, compresi quelli sulle modalità ottimali di donazione, condizioni di conservazione, e le pratiche trasfusionali. Nel campo della platelet (trasfusione) biologia, molte domande sulla clearance delle cellule dalla circolazione, il contributo delle piastrine trasfuse per emostasi, o la loro immunologia anche rimanere senza risposta.
Numerose tecniche di laboratorio per l'analisi della funzione piastrinica sono disponibili, ma questi lo più affrontare un aspetto singolare della funzione piastrinica, come aggregazione o degranulazione 13. Per valutare in generale piastrine e concentrati piastrinici, modelli completi di emostasi sono indispensabili, e queste devono includere idrodinamica. Reologia del sangue è essenziale per interpretare correttamente il comportamento delle piastrine durante emostasi 14, 15 o trombosi 16, anche se l'anticoagulazione impedisce Ca 2+ e / o trombina di partecipare in presenza di citrato o eparina, rispettivamente, 2. Per studiare l'interazione tra coagulazione e la funzione delle piastrine in condizioni di flusso 17, È necessario 18, normale produzione di trombina, e quindi senza Ca 2+ pure. La configurazione sperimentale per studiare l'emostasi in queste condizioni è complesso, perché le misure di prevenzione "manufatto" o l'attivazione incontrollata della coagulazione dovrebbe essere presa il più possibile. Inoltre, molti gruppi di ricerca specializzati utilizzano misura dell'hardware 19, 20, che causa notevole variabilità inter-laboratorio 5. Limiti tipici di questo approccio sono l'uso di recipienti di forma rettangolare, profili di flusso non pulsatile, e non umani rivestimenti superficiali 5. Il test che descriviamo qui utilizza strumenti disponibili in commercio e può quindi essere adatto per la standardizzazione.
Poiché la reazione cascata della coagulazione è facilmente attivabile volta sangue non è contenuto all'interno del corpo umano, ricalcificazione controllato è un passo fondamentale. To raggiungere questo obiettivo, l'aggiunta di Ca 2+ deve essere rinviata a poco prima della perfusione sulla superficie collagene reattiva, perché quando il buffer di 2+ Ca viene fornito sfuso al sangue statica, la coagulazione avviene inevitabilmente luogo, alla fine intasamento della tubazione e polarizzazione dei dati interpretazione (dati non mostrati). La soluzione a questo problema è di pompare il buffer Ca 2+ e il sangue separatamente, consentendo la miscelazione da forze convettivi e diffusivi durante la perfusione nel suo cammino verso la camera di analisi. miscelazione completa è raggiunto in un segmento di 46 cm di tubo fra le camere di miscelazione e di analisi. Questa lunghezza è stata calcolata per il tempo di permanenza ottimale dei reagenti per mescolare basato sulle leggi fondamentali della massa e il trasporto convettivo 21 durante la perfusione alla portata utilizzato (1.000 s -1). Questo approccio si è dimostrato controllabile e riproducibile.
Contatto attivazione della coagulazione è a volte visto come un artefatto di sempliceprelievo di sangue e da evitare quando si interpretano i tempi di coagulazione. Pertanto, abbiamo dimostrato che, in assenza di inibitori della coagulazione contatto indotta dalle ore 16.7 min (± 3,7 min) della perfusione. In presenza di CTI di inibire l'attivazione contatto FXIIa-mediata, coagulazione non è iniziata durante il corso arbitrariamente definito dell'esperimento (30 min). Questa finestra di sperimentazione è sufficientemente lungo per discernere i campioni che sono pro o antitrombotica. Anche se la coagulazione dall'attivazione contatto può essere una conseguenza indesiderata di sangue contatto con superfici artificiali, i nostri dati dimostrano un chiaro effetto dose biologica delle piastrine. Questo può essere importante per la medicina trasfusionale, perché recenti scoperte su FXII, piastrine polifosfati 10, la distribuzione fosfatidilserina 22, e microparticelle piastrine 23 sono in realtà rivalutato contatto via coagulazione come un importante contributo alla emostasi, especialmente nel contesto di trombosi 24. Per esempio, la resa variabile trasfusioni di piastrine nei pazienti o espressione fosfatidilserina variabile piastrine paraboliche possono quindi indurre variabilità dell'effetto terapeutico se coagulazione successo è mostrato a dipendere da questi fattori.
In co-immobilizzare lipidated rhTF con il collagene, il percorso di coagulazione estrinseca, o pathway TF, viene attivata durante la deposizione delle piastrine sul collagene. Questo si estende il saggio al suo modo più completo, come un modello per le lesioni che portano il sangue a contatto con le cellule TF-cuscinetto e tessuto. I nostri dati mostrano che co-immobilizzazione di collagene e TF diminuisce il momento della coagulazione insorgenza ma non modifica la velocità di coagulazione. Da notare, la quantità di rhTF immobilizzato sulla superficie è una variabile importante in questo modello 25, 26 e deve essere standardizzato entro un dato studio. Nel presence della CTI, il percorso TF può essere studiato esclusivamente (non mostrato) per l'attivazione contatto viene impedito.
In conclusione, il nostro apparato sperimentale combina un modello di trasfusioni per la ricostituzione del sangue trombocitopenica con le piastrine paraboliche e un modello di emostasi dalla deposizione delle piastrine calcio-dipendente e la formazione di fibrina sotto flusso idrodinamico. Questo test sarà utilizzato per rispondere a domande sulla natura procoagulante delle piastrine paraboliche e le tecniche di preparazione concentrato effetti piastrine avere su questo.
The authors have nothing to disclose.
Questa ricerca è stata sostenuta dalla Fondazione per la ricerca e sviluppo del servizio Blood Red Cross-Flanders belga. Noi riconosciamo il sostegno finanziario fornito da "Bijzonder onderzoeksfond" (BOF – Fondo di ricerca speciale) presso l'Università di Ghent concesso al progetto con numero di contratto BOF30290744.
1 mL Syringe | BD | A00434 | |
10 mL Syringe | BD | 309604 | |
2 mL Syringe | BD | 307727 | |
Alexa Fluor 405 | Life Technologies | A30100 | The manufacturer's manual was followed for labeling of fibrinogen |
BD vacutainer Eclipse | Becton, Dickinson and Company | 368650 | Blood collection needle with preattached holder |
BD vacutainer tube with EDTA | Becton, Dickinson and Company | 368856 | |
BD vacutainer tube with Sodium Citrate | Becton, Dickinson and Company | 366575 | |
Blocking buffer | in house preparation | in house preparation | 1.0% (w/v) bovine serum albumin and 0.1% (w/v) glucose in HBS |
Calcein AM | Molecular probes | C1430 | |
Coagulation buffer | in house preparation | in house preparation | 10mM CaCl2 and 3.75 mM MgCl2 in HBS |
Conical tube 15mL | Greiner bio-one | 1888271 | |
Conical tube 50mL | Greiner bio-one | 227261 | |
Corn trypsin inhibitor (CTI) | Enzyme Research Laboratories | CTI | |
Denaturated alcohol | Fiers | T0011.5 | |
DiOC6 | Sigma-Aldrich | 318426 | 3,3′-Dihexyloxacarbocyanine iodide – 1mM solution in DMSO |
Exigo microfluidic pump | Cellix | EXIGO-PC-FS7.0-MF | |
Fibrinogen | Sigma-Aldrich | F3879 | Labelled in house with AF 405 – stock concentration 10.7 mg/mL |
Hematology analyzer | Sysmex | pocH-100i | |
HEPES buffered saline (HBS) | in house preparation | in house preparation | 10mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) buffered saline (0.9% (w/v) NaCl, pH 7.4 |
Horm Collagen | Takeda/Nycomed | 1130630 | Native equine tendon collagen (type I) Isotonic glucose solution to dilute collagen is supplemented |
Humidified box | Cellix | HUMID-BOX | |
Incubation water bath | GFL | 1013 | |
Microscope | Zeiss | Axio Observer Z1 | equipped with a colibri-LED and high resolution CCD camera |
Mirus Evo Nanopump | Cellix | 188-MIRUS-PUMP-EVO | with Multiflow8 |
Pipette | Brand | A03429 | |
Pipette tips 100-1000 | Greiner bio-one | 740290 | |
Pipette tips 1-10 | Eppendorf | A08928 | |
Pipette tips 2-200 | Greiner bio-one | 739280 | |
Platelet concentrate orbital shaker | Helmer | PF-48i | |
Precision wipes | Kimtech | 5511 | |
Pepsin solution | Hanna instrument | HI7073L | 2g pepsin per 75 ml solution, Protein cleaning solution with pepsin |
Recombinant Human Tissue Factor Innovin | Dade Berhing | B4212-40 | rhTF with synthetic phospholipids |
Software microscope | Zeiss | N/A | ZEN 2012 |
Sterile docking device | Terumo BCT | TSCD | |
Table Top Centrifuge | Eppendorf | 521-0095 | |
Tube Roller | Ratek | BTR5-12V | |
Tubing Sealer | Terumo BCT | AC-155 | |
Vena8 syringe connector pin | Cellix | CONNECTORS-B1IC-PACK100 | |
Vena8 Fluoro+ Biochips | Cellix | 188V8CF-400-100-02P10 | Coated biochip |
Vena8 Needles | Cellix | SS-P-B1IC-B1OC-PACK200 | |
Vena8 Tubing | Cellix | TUBING-TYGON-B1IC-B1OC-ROLL 100F | |
VenaDelta Y1 Biochips | Cellix | VDY1-400-100-01-02 | Mixing biochip |
Vortex mixer | VWR | 58816-121 | |
ZEN2012 software | Zeiss |