Dieses Dokument beschreibt ein experimentelles Modell der Hämostase, die Thrombozytenfunktion und Koagulation gleichzeitig misst. Blutplättchen- und Fibrin- Fluoreszenz wird in Echtzeit gemessen und die Plättchenadhäsion Rate, Gerinnungsrate und Einsetzen der Gerinnung bestimmt. Das Modell wird verwendet, um die Thrombozyten Prokoagulanz-Eigenschaften unter Strömung in Konzentraten für Transfusions bestimmen.
Mikrofluidik-Modelle der Hämostase Beurteilung der Thrombozytenfunktion unter den Bedingungen der hydrodynamischen Scherung, aber in der Gegenwart von Antikoagulantien ist diese Analyse nur auf die Blutplättchenablagerung eingeschränkt. Die komplizierte Beziehung zwischen Ca 2+ -abhängigen Koagulation und Plättchenfunktion erfordert eine sorgfältige und Verkalkung von Blut vor der Analyse gesteuert. Unser Setup verwendet eine Y-förmige Mischkanal, der kurz vor der Perfusion Blut fließt konzentrierte Ca 2+ / Mg 2+ Puffer liefert, wodurch eine schnelle Recalcifizierung ohne Probe Stase. Eine zehnfache Differenz in der Strömungsgeschwindigkeit zwischen den beiden Reservoiren minimiert Verdünnung. Die rekalzifiziertem Blut wird dann in einem kollagenbeschichteten Analysekammer perfundiert, und differentielle Markierung ermöglicht Echtzeit-Bildgebung sowohl Blutplättchen- und Fibrinablagerung mittels Fluoreszenzvideomikroskopie. Das System verwendet nur kommerziell verfügbaren Tools, die Chancen der Standardisierung zu erhöhen. Rekonstitution von thrombocytopenic Blut mit Blutplättchen aus überhöhten konzentriert weiterhin Modelle Thrombozytentrans, die Anwendung in dieser Forschungsbereich unter Beweis. Beispielhafte Daten zeigten, dass die Koagulation Einsetzens und Fibrinablagerung auf der Plättchenkonzentration linear abhängig waren, das Verhältnis zwischen Primär- und Sekundär Hämostase in unserem Modell bestätigt. In einem Zeitraum von 16 min Perfusion, Kontaktaktivierung fand nicht statt, trotz Recalcifizierung zu normalen Ca 2+ und Mg 2+ Ebenen. Wenn Gerinnungsfaktor XIIa durch corn Trypsininhibitor inhibiert wurde, war dieser Zeitrahmen noch länger, einen beträchtlichen Dynamikbereich anzeigt, in dem die Änderungen in der prokoagulierenden Natur der Plättchen beurteilt werden kann. Co-Immobilisierung von Gewebefaktor mit Kollagen reduziert signifikant die Zeit der Koagulation zu Beginn, aber nicht seine Rate. Die Option, den Gewebefaktor und / oder des Kontaktweges zu untersuchen erhöht die Vielseitigkeit und Nützlichkeit des Assays.
Primäre und sekundäre Hämostase wurden ursprünglich als zwei relativ trennbaren biochemische Prozesse konzipiert. Primäre Hämostase wurde als wesentlicher Faktor bei der arteriellen Strömungsbedingungen mit einer Schlüsselrolle für Blutplättchen betrachtet, während sekundäre Hämostase Koagulation unter venösen Blutfluss zu beherrschen war zu sehen, so dass die Protease Kaskade unlösliche Fibrin zu bilden. In den letzten Jahrzehnten haben diese traditionelle Sicht wesentlich umgestaltet, der Erkenntnis, dass die Plättchenaktivierung und Koagulation sind voneinander abhängig und sind ebenso wichtige Prozesse bei der physiologischen und pathologischen Hämostase in allen (nicht extrem) hydrodynamischen Milieus. Diese Ansicht wurde in die Klinik übersetzt, wo Tests umfassend Voll Blutgerinnung entwickelt , zu messen sind zunehmend eingesetzt, wenn auch mit vielen noch offenen Fragen auf Relevanz, Anwendbarkeit und Nützlichkeit 1.
Wir veröffentlichten kürzlich eine funktionelle Analyse von PlättchenKonzentrate Kammern mikrofluidischen Strömungs beschichtet mit fibrillärem Kollagen in einem in vitro Modell der Transfusions 2 mit Proben , die normale Mengen von roten Blutkörperchen, Plasma und Blutplättchen verwendet wird . Diese Methode verwendet Heparin oder Hirudin antikoaguliertes Blut, keine oder geringe Beteiligung der sekundären Hämostase impliziert, die auf Thrombin – Erzeugung und ionisiertem Calcium (Ca 2+) abhängig ist. Zur Bildung von Thrombin unterstützen und somit alle Aspekte der Hämostase unter mikrofluidische Strömung aufzunehmen, entwickelten wir eine ergänzende Methode auf derselben technischen Plattform, jetzt mit freiem Ca 2+. Auf diese Weise wird die Blutplättchenablagerung und Fibrin-Bildung kann in einem Modell der Blutplättchentransfusion untersucht, wieder, um Plättchenkonzentratqualität beurteilen.
Bei diesem Verfahren werden die Blutplättchen und Fibrinogen mit Fluorophoren markiert, die vollständig Emissionsspektren getrennt haben. Dual-Farbe, Echtzeit-Video-Mikroskopie ermöglicht dann die Analyse vonprimäre Plättchenadhäsion sowie Koagulation Initiierung und Fibrinablagerung. Eine wichtige Variable in dieser Art von Assay ist Rekalzifizierung, da die Zugabe von Ca 2+ auf statische Blut, vor der Perfusion wird unweigerlich Kontakt initiierte Koagulation in dem Behälter führen. Diese Einweihung wird Bias das Auslesen aufgrund Verstopfung der Schläuche und Biochip Einlässe vor der Perfusion. Daher wird in unserem Verfahren antikoaguliertem Citratblut und eine Ca 2+ -haltigem Puffer getrennt durch die oberen Schenkel eines Y-förmigen Einlaßkammer gepumpt. Die Komponenten werden während der Perfusion vermischt, bevor eine Analysekammer mit Kollagen alleine oder in Kombination mit rekombinantem menschlichen Gewebefaktor (rhTF) beschichtet eintritt. Durch die Anpassung nimmt die Strömungsgeschwindigkeiten der getrennten Pumpen und die Konzentration von Ca 2+ in den Puffer, eine 10% ige Verdünnung der endgültigen Blutprobe Platz.
Mit diesem erweiterten Protokoll zeigen wir den Beitrag von CoagulatFaktors XII (FXII) und Blutplättchenkonzentration Weg Koagulation Initiierung unter Strömung zu kontaktieren. Unsere Daten zeigen auch, dass rhTF neben Kollagen kann der Gewebefaktor-Pathway gleichzeitig durch Beschichtung gemessen werden.
Die Transfusion von Thrombozytenkonzentraten ist für die Thrombozytopenie Patienten verschrieben, um zu verhindern oder zu stoppen Blutungen. Die klinische Wirkung wurde in einer historischen Überprüfung von akuter Leukämie 12, unter Hinweis darauf , dass eine erhöhte Überlebensraten von pädiatrischen Patienten in den sechziger und siebziger Jahren zu Verbesserungen weitgehend zurückzuführen waren in (Thrombozyten) Transfusionsmedizin kürzlich hervorgehoben. Platelet Konzentrate werden auch zur Eindämmung Blutungen bei akutem Trauma oder während der Operation eingesetzt. Unter diesen Bedingungen Plättchen mit ausgezeichneten Prokoagulanz-Eigenschaften, die schnell Hämostase initiieren werden bevorzugt, aber sind Thrombozytenkonzentrate aus Spenden von freiwilligen Spendern hergestellt und, anders als pharmakologische Medikamente, durch Herstellung nur standardisiert sind, nicht durch (chemische) Zusammensetzung. Daher sind mehrere Fragen im Bereich der Blutbanken unbeantwortet, auch die auf optimale Spende Modalitäten, die Lagerbedingungen und Transfusionspraktiken. Im Bereich der platelet (Transfusions) Biologie, viele Fragen auf Zell-Clearance aus dem Verkehr, der Beitrag der transfused Blutplättchen an der Hämostase, oder ihre Immunologie bleiben auch unbeantwortet.
Zahlreiche Labortechniken für Plättchenfunktionsanalyse zur Verfügung, aber diese meist eine singuläre Aspekt der Thrombozytenfunktion ansprechen, wie Aggregation oder Degranulation 13. Um im Großen und Ganzen bewerten Blutplättchen und Thrombozytenkonzentrate, umfassende Modelle der Hämostase unverzichtbar sind, und diese müssen Hydrodynamik umfassen. Blutrheologie ist entscheidend , um korrekt während 14 Hämostase Thrombozytenverhalten interpretieren, 15 oder 16 Thrombose, auch wenn Antikoagulation Ca 2+ verhindert und / oder Thrombin in Gegenwart von Citrat oder Heparin bzw. 2 zu beteiligen. Zur Untersuchung der Wechselwirkung zwischen Koagulation und Plättchenfunktion unter Fluss 17, 18, wird die normale Thrombinbildung erforderlich und daher auch freie Ca 2+. Der Versuchsaufbau Hämostase unter diesen Bedingungen für die Untersuchung ist komplex, weil measures "Artefakt" oder unkontrollierte Aktivierung der Koagulation zu verhindern, sollte so viel wie möglich gemacht werden. Darüber hinaus viele spezialisierte Forschungsgruppen nutzen maßgeschneiderte Hardware 19, 20, die 5 wesentliche Interlabor – Variabilität verursacht. Typische Grenzen dieses Ansatzes sind die Verwendung von rechteckigen Behälter, nichtpulsatilen Strömungsprofile und nicht-menschlichen Oberflächenbeschichtungen 5. Der Test, den wir hier beschreiben, nutzt handelsüblichem Werkzeug und kann daher für die Normung geeignet sein.
Weil die Gerinnungskaskade Reaktion leicht aktiviert wird, sobald Blut nicht innerhalb des menschlichen Körpers enthalten ist, gesteuert Rekalzifizierung ist ein entscheidender Schritt. To erreichen, Zugabe von Ca 2+ verschoben werden muss , um kurz vor der Perfusion über die reaktiven Kollagenoberfläche, weil , wenn das Ca 2+ Puffer in der Masse zu statischer Blut zugeführt wird, nimmt die Koagulation zwangsläufig statt schließlich den Schlauch verstopfen und Daten Vorspannen Interpretation (Daten nicht gezeigt). Die Lösung für dieses Problem ist die Ca 2+ Puffer und das Blut getrennt zu pumpen, so dass für durch Konvektions- und Diffusionskräfte während der Perfusion auf seinem Weg zu der Analysekammer zu mischen. Vollständiges Mischen wird in einem 46-cm-Segment des Schlauchs zwischen den Misch- und Analysekammern erreicht. Diese Länge wurde für die optimale Verweilzeit der Reagenzien berechnet bei der Fließgeschwindigkeit verwendet (1.000 s -1) , basierend auf fundamentalen Gesetze der Masse und konvektiven Transport 21 während der Perfusion zu mischen. Dieser Ansatz erwies sich als kontrollierbar und reproduzierbar.
Kontaktaktivierung der Blutgerinnung wird manchmal als ein Artefakt angesehen einfachenBlutentnahme und vermieden werden, wenn die Gerinnungszeiten zu interpretieren. Daher haben wir gezeigt, dass in der Abwesenheit von Inhibitoren, Kontakt-induzierte Koagulation bei 16,7 min beginnt (± 3,7 min) der Perfusion. In Gegenwart von CTI FXIIa-vermittelten Kontaktaktivierung zu hemmen, wird die Koagulation während der willkürlich definierten Verlauf des Experiments (30 min) eingeleitet. Dieses Fenster des Experimentierens ist ausreichend lang, Proben zu erkennen, die pro- oder antithrombotische sind. Auch wenn die Koagulation durch Kontaktaktivierung eine unerwünschte Folge von Blut in Kontakt künstlichen Oberflächen sein kann, zeigen unsere Daten eine klare biologische Dosis Wirkung der Blutplättchen. Dies kann für Transfusionsmedizin von Bedeutung sein, weil neuere Erkenntnisse auf FXII, Thrombozyten 10 Polyphosphate, Phosphatidylserin Verteilung 22 und Blutplättchen Mikropartikel 23 haben tatsächlich Kontakt Weg Koagulation als wichtigen Beitrag zur Hämostase, e neu bewertetspeziell im Zusammenhang mit Thrombose 24. Zum Beispiel induzieren die variable Ausbeute von Thrombozytentransfusionen bei Patienten oder die variable Phosphatidylserin Expression von überhöhten Blutplättchen somit Variabilität in der therapeutischen Wirksamkeit, wenn erfolgreiche Koagulation von diesen Faktoren gezeigt abhängen.
Durch Co-Immobilisierung lipidierter rhTF mit Kollagen, die extrinsische Gerinnungs Route oder TF Weg wird während der Plättchenablagerung auf Kollagen aktiviert. Dies verlängert die Assay seiner umfassendsten Modus als Modell für Verletzungen, die das Blut in Kontakt mit TF-tragenden Zellen und Gewebe zu bringen. Unsere Daten zeigen, dass die Co-Immobilisierung von Kollagen und TF im Moment des Gerinnungsbeginn verringert, aber die Rate der Koagulation nicht ändert. Bemerkenswert ist die Menge von rhTF an die Oberfläche immobilisiert eine wichtige Variable in diesem Modell 25, 26 und sollte innerhalb einer gegebenen Studie standardisiert werden. Im presence von CTI kann der TF Weg ausschließlich untersucht werden (nicht dargestellt), weil die Kontaktaktivierung verhindert wird.
Abschließend kombiniert unsere Versuchsaufbau ein Modell der Transfusions durch Rekonstitution von Thrombozytopenie Blut mit überhöhten Blutplättchen und ein Modell der Hämostase durch Kalzium-abhängige Blutplättchenablagerung und Fibrinbildung unter hydrodynamischen Fluss. Dieser Test wird verwendet, um Fragen über die Prokoagulanz-Natur von überhöhten Blutplättchen zu beantworten und die Auswirkungen Thrombozytenkonzentrat Präparationstechniken haben zu diesem Thema.
The authors have nothing to disclose.
Diese Forschung wurde von der Stiftung für Forschung und Entwicklung des Belgischen Roten Kreuz Sektion Flandern Blood Service unterstützt. Wir danken für die finanzielle Unterstützung durch die "Bijzonder onderzoeksfond" (BOF – Sonderforschungsfonds) von der Universität Gent mit Vertragsnummer BOF30290744 dem Projekt gewährt.
1 mL Syringe | BD | A00434 | |
10 mL Syringe | BD | 309604 | |
2 mL Syringe | BD | 307727 | |
Alexa Fluor 405 | Life Technologies | A30100 | The manufacturer's manual was followed for labeling of fibrinogen |
BD vacutainer Eclipse | Becton, Dickinson and Company | 368650 | Blood collection needle with preattached holder |
BD vacutainer tube with EDTA | Becton, Dickinson and Company | 368856 | |
BD vacutainer tube with Sodium Citrate | Becton, Dickinson and Company | 366575 | |
Blocking buffer | in house preparation | in house preparation | 1.0% (w/v) bovine serum albumin and 0.1% (w/v) glucose in HBS |
Calcein AM | Molecular probes | C1430 | |
Coagulation buffer | in house preparation | in house preparation | 10mM CaCl2 and 3.75 mM MgCl2 in HBS |
Conical tube 15mL | Greiner bio-one | 1888271 | |
Conical tube 50mL | Greiner bio-one | 227261 | |
Corn trypsin inhibitor (CTI) | Enzyme Research Laboratories | CTI | |
Denaturated alcohol | Fiers | T0011.5 | |
DiOC6 | Sigma-Aldrich | 318426 | 3,3′-Dihexyloxacarbocyanine iodide – 1mM solution in DMSO |
Exigo microfluidic pump | Cellix | EXIGO-PC-FS7.0-MF | |
Fibrinogen | Sigma-Aldrich | F3879 | Labelled in house with AF 405 – stock concentration 10.7 mg/mL |
Hematology analyzer | Sysmex | pocH-100i | |
HEPES buffered saline (HBS) | in house preparation | in house preparation | 10mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) buffered saline (0.9% (w/v) NaCl, pH 7.4 |
Horm Collagen | Takeda/Nycomed | 1130630 | Native equine tendon collagen (type I) Isotonic glucose solution to dilute collagen is supplemented |
Humidified box | Cellix | HUMID-BOX | |
Incubation water bath | GFL | 1013 | |
Microscope | Zeiss | Axio Observer Z1 | equipped with a colibri-LED and high resolution CCD camera |
Mirus Evo Nanopump | Cellix | 188-MIRUS-PUMP-EVO | with Multiflow8 |
Pipette | Brand | A03429 | |
Pipette tips 100-1000 | Greiner bio-one | 740290 | |
Pipette tips 1-10 | Eppendorf | A08928 | |
Pipette tips 2-200 | Greiner bio-one | 739280 | |
Platelet concentrate orbital shaker | Helmer | PF-48i | |
Precision wipes | Kimtech | 5511 | |
Pepsin solution | Hanna instrument | HI7073L | 2g pepsin per 75 ml solution, Protein cleaning solution with pepsin |
Recombinant Human Tissue Factor Innovin | Dade Berhing | B4212-40 | rhTF with synthetic phospholipids |
Software microscope | Zeiss | N/A | ZEN 2012 |
Sterile docking device | Terumo BCT | TSCD | |
Table Top Centrifuge | Eppendorf | 521-0095 | |
Tube Roller | Ratek | BTR5-12V | |
Tubing Sealer | Terumo BCT | AC-155 | |
Vena8 syringe connector pin | Cellix | CONNECTORS-B1IC-PACK100 | |
Vena8 Fluoro+ Biochips | Cellix | 188V8CF-400-100-02P10 | Coated biochip |
Vena8 Needles | Cellix | SS-P-B1IC-B1OC-PACK200 | |
Vena8 Tubing | Cellix | TUBING-TYGON-B1IC-B1OC-ROLL 100F | |
VenaDelta Y1 Biochips | Cellix | VDY1-400-100-01-02 | Mixing biochip |
Vortex mixer | VWR | 58816-121 | |
ZEN2012 software | Zeiss |