L'utilisation des dispositifs microfluidiques pour mesurer et cellulaire Lifespan dans Phenotypes simples cellules de levure de bourgeonnement
Summary
Cet article présente un protocole optimisé pour la production de puces microfluidiques et la mise en place d'expériences microfluidique pour mesurer la durée de vie et phénotypes cellulaires de cellules de levure unique.
Abstract
Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects on the lifespan across species. However, the molecular causes of aging and death remain elusive. To gain a systematic understanding of the molecular mechanisms underlying yeast aging, we need high-throughput methods to measure lifespan and to quantify various cellular and molecular phenotypes in single cells. Previously, we developed microfluidic devices to track budding yeast mother cells throughout their lifespan while flushing away newborn daughter cells. This article presents a method for preparing microfluidic chips and for setting up microfluidic experiments. Multiple channels can be used to simultaneously track cells under different conditions or from different yeast strains. A typical setup can track hundreds of cells per channel and allow for high-resolution microscope imaging throughout the lifespan of the cells. Our method also allows detailed characterization of the lifespan, molecular markers, cell morphology, and the cell cycle dynamics of single cells. In addition, our microfluidic device is able to trap a significant amount of fresh mother cells that can be identified by downstream image analysis, making it possible to measure the lifespan with higher accuracy.
Introduction
levure bourgeonnante est un organisme modèle puissant recherche sur le vieillissement. Cependant, un essai de durée de vie classique dans la levure repose sur microdissection, qui est non seulement de main – d'œuvre , mais aussi faible débit 1, 2. De plus, l'approche traditionnelle microdissection ne fournit pas une vue détaillée de diverses fonctions cellulaires et moléculaires dans les cellules mère seule à mesure qu'ils vieillissent. Le développement de dispositifs microfluidiques a permis une procédure automatisée pour mesurer la durée de vie de la levure ainsi que de suivre les marqueurs moléculaires et différents phénotypes cellulaires pendant toute la durée de vie des cellules mères 3, 4, 5, 6, 7, 8. Après que les cellules de levure sont chargés dans un dispositif microfluidique, ils peuvent être suivis au microscope en utilisant automatique Time-toursImagerie e. Avec l'aide d'outils de traitement d' imagerie, divers phénotypes cellulaires et moléculaires peuvent être extraits 3, 6, 8, y compris la durée de vie, la taille, le reporter fluorescent, la morphologie cellulaire, la dynamique du cycle cellulaire, etc., dont beaucoup sont difficiles ou impossibles à obtenir en utilisant la méthode de microdissection traditionnelle. Les dispositifs microfluidiques ont pris de l' importance dans la recherche sur le vieillissement de la levure depuis leur développement réussi il y a quelques années 3, 4, 6, 7. Plusieurs groupes ont ensuite publié sur les variations des conceptions antérieures 5, et de nombreux laboratoires de levure ont utilisé des dispositifs microfluidiques pour leur étude.
Dans une culture de cellules en croissance exponentielle, le nombre de cellules âgées mères qui sont disponibles pour l'observation est miniscule. Par conséquent, le principe de la conception générale du dispositif microfluidique pour les mesures de durée de vie est de conserver les cellules mères et pour éliminer les cellules filles. L'un de ces modèles utilise le fait que la levure subit la division cellulaire asymétrique. Les structures dans le piège de la volonté de l'appareil plus grandes cellules mères et permettre aux petites cellules filles à être éliminés par lavage. La puce microfluidique décrit dans cet article utilise un tampon doux polydiméthylsiloxane (PDMS) (colonnes verticales de Pensile) pour piéger des cellules mères (figure 1). Des dispositifs de conception similaire ont été signalés précédemment 3, 4, 6, 7. Ce protocole utilise une procédure plus simple pour fabriquer des dispositifs microfluidiques et un procédé de chargement de cellule simple qui est optimisé pour les expériences d'imagerie time-lapse. L'un des principaux paramètres du dispositif microfluidique est la largeur des plots PDMS utilisés à des cellules mères de piège. notre dériphérique utilise des tampons plus larges qui peuvent garder plus de cellules mères dans chaque tampon, y compris une fraction significative de cellules fraîches mères qui peuvent être suivis tout au long de leur durée de vie. En plus des mesures de durée de vie, ce protocole est utile pour des expériences d'imagerie time-lapse de cellule lorsque les cellules doivent être suivis pendant plusieurs générations ou quand une observation tout au long de la durée de vie entière est nécessaire.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le dispositif PDMS doit être fraîchement préparé. Sinon, les bulles d'air provoquées par l'insertion des tubes dans le dispositif sera difficile à enlever. Étape 3.4 est important d'améliorer l'efficacité de chargement des cellules en concentrant les cellules. Pour augmenter le débit de l'expérience, quatre à six modules sur la même puce de PDMS reliés à des pompes fonctionnant indépendamment sont généralement utilisés pour effectuer 4 à 6 expériences différentes (souches diffé…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by NIH Grant AG043080 and the National Natural Science Foundation of China (NSFC), No. 11434001. We thank Lucas Waldburger for proofreading the manuscript.
Materials
| 3'' <111> silicon wafer | Addison Engineering | ||
| SU-8 2000 and 3000 Series | MicroChem | ||
| SYLGARD® 184 SILICONE ELASTOMER KIT | ellsworth | 2065622 | Include Sylgard® silicone elastomer base and curing agent |
| Petri dishes | VWR | 391-1502 | |
| Harris Uni-core™ punch(I.D. 0.75 mm) | Sigma-Aldrich | 29002513 | |
| 24 mm x 40 mm SLIP-RITE® cover glass | Thermo Fisher Scientific | 102440 | |
| 3M Scotch Tape | ULINE | S-10223 | |
| VWR® Razor Blades | VWR | 55411-050 | |
| PURE ETHANOL, KOPTEC | VWR | 64-17-5 | |
| WHOOSH-DUSTER™ | VWR | 16650-027 | |
| 5mL BD Syringe (Luer-Lock™Tip) | Becton, Dickinson and Company. | 309646 | |
| PTFE Standard Wall Tubing (100ft, AWG Size:22, Nominal ID: 0.028) | COMPONENT SUPPLY COMPANY | SWTT-22 | |
| Needle Assortment | COMPONENT SUPPLY COMPANY | NEKIT-1 | |
| Desiccator | HACH | 2238300 | |
| Lab Oven | FISHER SCIENTIFIC | 13246516GAQ | |
| Nikon TE2000 microscope with 40x and 60x objective | Nikon | ||
| Zeiss Axio Observer Z1 with 40x and 60x objective | Zeiss | ||
| Syringe Pump | Longerpump | TS-1B |
References
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