El uso de dispositivos de microfluidos para Medir Lifespan y Celular fenotipos en células individuales levadura en ciernes
Summary
Este artículo presenta un protocolo optimizado para la producción de chips de microfluidos y la configuración de los experimentos de microfluidos para medir la vida útil y los fenotipos celulares de células de levadura individuales.
Abstract
Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects on the lifespan across species. However, the molecular causes of aging and death remain elusive. To gain a systematic understanding of the molecular mechanisms underlying yeast aging, we need high-throughput methods to measure lifespan and to quantify various cellular and molecular phenotypes in single cells. Previously, we developed microfluidic devices to track budding yeast mother cells throughout their lifespan while flushing away newborn daughter cells. This article presents a method for preparing microfluidic chips and for setting up microfluidic experiments. Multiple channels can be used to simultaneously track cells under different conditions or from different yeast strains. A typical setup can track hundreds of cells per channel and allow for high-resolution microscope imaging throughout the lifespan of the cells. Our method also allows detailed characterization of the lifespan, molecular markers, cell morphology, and the cell cycle dynamics of single cells. In addition, our microfluidic device is able to trap a significant amount of fresh mother cells that can be identified by downstream image analysis, making it possible to measure the lifespan with higher accuracy.
Introduction
La levadura en ciernes es un poderoso organismo modelo en la investigación del envejecimiento. Sin embargo, un ensayo de vida útil convencional en levaduras se basa en la microdisección, que no sólo es un trabajo intensivo sino también bajo rendimiento 1, 2. Además, el enfoque de microdisección tradicional no proporciona una vista detallada de diversas características celulares y moleculares en las células madre individuales a medida que envejecen. El desarrollo de dispositivos microfluídicos ha permitido un procedimiento automatizado para medir la vida útil de la levadura, así como de seguir los marcadores moleculares y diferentes fenotipos celulares a lo largo de la vida útil de las células madre 3, 4, 5, 6, 7, 8. Después de células de levadura se cargan en un dispositivo de microfluidos, pueden ser rastreados bajo un microscopio usando el tiempo-vueltas automáticase imágenes. Con la ayuda de la formación de imágenes herramientas de procesamiento, diferentes fenotipos celulares y moleculares se pueden extraer 3, 6, 8, incluyendo la vida útil, el tamaño, el reportero fluorescente, la morfología celular, la dinámica del ciclo celular, etc., muchos de los cuales son difíciles o imposibles de obtener mediante el método tradicional de microdisección. Dispositivos de microfluidos han ganado importancia en la investigación de levadura envejecimiento, ya que su desarrollo con éxito hace unos años, 3, 4, 6, 7. Varios grupos han publicado posteriormente en variaciones de los diseños anteriores 5, y muchos laboratorios de levadura han empleado dispositivos de microfluidos para su estudio.
En un cultivo de células sometidos a crecimiento exponencial, el número de células madre de edad que están disponibles para la observación es miniscuLe. Por lo tanto, el principio de diseño general del dispositivo de microfluidos para mediciones de vida útil es conservar las células madre y para eliminar las células hijas. Uno de estos diseños hace uso del hecho de que la levadura se somete a la división celular asimétrica. Las estructuras de las células madre de la trampa voluntad dispositivo más grandes y permitir que las células hijas más pequeñas para ser lavados. El chip microfluídico descrito en este artículo utiliza una almohadilla de polidimetilsiloxano suave (PDMS) (columnas Pensile verticales) a las células madre trampa (Figura 1). Dispositivos de diseño similar se ha informado anteriormente 3, 4, 6, 7. Este protocolo utiliza un procedimiento más sencillo para fabricar dispositivos microfluídicos y un método de la celda de carga sencilla que está optimizado para los experimentos de imagen de lapso de tiempo. Uno de los parámetros clave en el dispositivo de microfluidos es la anchura de las almohadillas de PDMS utilizados para células trampa madre. nuestra device utiliza almohadillas más amplios que pueden mantener más células madre en cada almohadilla, incluyendo una fracción significativa de células madre frescas que pueden rastrearse a lo largo de su vida útil. Además de las mediciones de vida útil, este protocolo es útil para los experimentos de imagen única célula de lapso de tiempo cuando las células necesitan ser rastreado por muchas generaciones o cuando una observación a lo largo de toda la vida útil es necesario.
Protocol
Representative Results
Discussion
El dispositivo de PDMS necesita ser recién hecho. De lo contrario, las burbujas de aire causadas por la inserción de tubos en el dispositivo serán difíciles de eliminar. Paso 3.4 es importante para mejorar la eficiencia de carga de células mediante la concentración de las células. Para aumentar el rendimiento del experimento, de 4 a 6 módulos en el mismo chip PDMS conectados a independiente bombas que operan normalmente se utilizan para realizar de 4 a 6 experimentos diferentes (diferentes cepas o composiciones …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by NIH Grant AG043080 and the National Natural Science Foundation of China (NSFC), No. 11434001. We thank Lucas Waldburger for proofreading the manuscript.
Materials
| 3'' <111> silicon wafer | Addison Engineering | ||
| SU-8 2000 and 3000 Series | MicroChem | ||
| SYLGARD® 184 SILICONE ELASTOMER KIT | ellsworth | 2065622 | Include Sylgard® silicone elastomer base and curing agent |
| Petri dishes | VWR | 391-1502 | |
| Harris Uni-core™ punch(I.D. 0.75 mm) | Sigma-Aldrich | 29002513 | |
| 24 mm x 40 mm SLIP-RITE® cover glass | Thermo Fisher Scientific | 102440 | |
| 3M Scotch Tape | ULINE | S-10223 | |
| VWR® Razor Blades | VWR | 55411-050 | |
| PURE ETHANOL, KOPTEC | VWR | 64-17-5 | |
| WHOOSH-DUSTER™ | VWR | 16650-027 | |
| 5mL BD Syringe (Luer-Lock™Tip) | Becton, Dickinson and Company. | 309646 | |
| PTFE Standard Wall Tubing (100ft, AWG Size:22, Nominal ID: 0.028) | COMPONENT SUPPLY COMPANY | SWTT-22 | |
| Needle Assortment | COMPONENT SUPPLY COMPANY | NEKIT-1 | |
| Desiccator | HACH | 2238300 | |
| Lab Oven | FISHER SCIENTIFIC | 13246516GAQ | |
| Nikon TE2000 microscope with 40x and 60x objective | Nikon | ||
| Zeiss Axio Observer Z1 with 40x and 60x objective | Zeiss | ||
| Syringe Pump | Longerpump | TS-1B |
References
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