Usando dispositivos microfluídicos medir Longevidade e Celular fenótipos em células individuais levedura de brotamento
Summary
Este artigo apresenta um protocolo optimizado para a produção de batatas fritas de microfluidos e a configuração de experiências de microfluidos para medir o tempo de vida e fenótipos celulares de células de levedura individuais.
Abstract
Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects on the lifespan across species. However, the molecular causes of aging and death remain elusive. To gain a systematic understanding of the molecular mechanisms underlying yeast aging, we need high-throughput methods to measure lifespan and to quantify various cellular and molecular phenotypes in single cells. Previously, we developed microfluidic devices to track budding yeast mother cells throughout their lifespan while flushing away newborn daughter cells. This article presents a method for preparing microfluidic chips and for setting up microfluidic experiments. Multiple channels can be used to simultaneously track cells under different conditions or from different yeast strains. A typical setup can track hundreds of cells per channel and allow for high-resolution microscope imaging throughout the lifespan of the cells. Our method also allows detailed characterization of the lifespan, molecular markers, cell morphology, and the cell cycle dynamics of single cells. In addition, our microfluidic device is able to trap a significant amount of fresh mother cells that can be identified by downstream image analysis, making it possible to measure the lifespan with higher accuracy.
Introduction
Brotamento levedura é um poderoso organismo modelo na pesquisa de envelhecimento. No entanto, num ensaio de tempo de vida convencional em leveduras depende de microdissecação, que não só é de trabalho intensivo, mas também baixa taxa de transferência 1, 2. Além disso, a abordagem tradicional microdissecação não fornece uma vista detalhada de várias características celulares e moleculares nas células-mãe individuais à medida que envelhecem. O desenvolvimento de dispositivos de microfluidos tem possibilitado um procedimento automatizado para medir o tempo de vida de levedura, bem como para seguir marcadores moleculares e vários fenótipos celulares ao longo do tempo de vida das células-mãe de 3, 4, 5, 6, 7, 8. Após as células de levedura são carregados para um dispositivo de microfluidos, que pode ser rastreado sob um microscópio usando tempos voltas automáticase de imagem. Com a ajuda de ferramentas de processamento de imagem latente, vários fenótipos celulares e moleculares podem ser extraídos 3, 6, 8, incluindo o tempo de vida, tamanho, repórter fluorescente, a morfologia celular, a dinâmica do ciclo celular, etc, muitos dos quais são difíceis ou impossíveis de obter usando o método tradicional microdissecação. Dispositivos microfluídicos ganharam destaque na pesquisa do envelhecimento levedura desde o seu desenvolvimento bem sucedido de alguns anos atrás 3, 4, 6, 7. Vários grupos posteriormente publicado em variações dos projetos anteriores 5, e muitos laboratórios levedura empregaram dispositivos microfluídicos para o seu estudo.
Em uma cultura de células em crescimento exponencial, o número de células mãe com idades que estão disponíveis para a observação é miniscule. Portanto, o princípio de design geral do dispositivo microfluídico para medições de tempo de vida é para reter células-mãe e remover células filhas. Um desses desenhos faz uso do fato de que o fermento sofre divisão celular assimétrica. As estruturas em células-mãe a armadilha dispositivo vontade maiores e permitem que as células filhas mais pequenas a serem lavados. O chip de microfluidos descrito neste artigo utiliza uma almofada macia polidimetilsiloxano (PDMS) (colunas verticais Pensile) para células-mãe armadilha (Figura 1). Dispositivos de desenho semelhante têm sido relatados anteriormente 3, 4, 6, 7. Este protocolo utiliza um processo mais simples para fabricar dispositivos microfluidicos e um método de célula de carga simples que é optimizado para as experiências de imagiologia de intervalo de tempo. Um dos parâmetros chave no dispositivo de microfluidos é a largura das pastilhas de PDMS usados para células mãe armadilha. nossa dispositivo usa almofadas mais amplas que podem manter mais células-mãe em cada bloco, incluindo uma fração significativa de células-mãe frescas que podem ser rastreados ao longo da sua vida útil. Para além das medições vida útil, este protocolo é útil para experiências de imagiologia única célula de intervalo de tempo quando as células necessitam de ser rastreados por muitas gerações ou quando uma observação ao longo de todo o tempo de vida é necessário.
Protocol
Representative Results
Discussion
O dispositivo PDMS precisa ser feitos na hora. De outro modo, as bolhas de ar causadas pela inserção de tubos para o dispositivo irá ser difícil de remover. Etapa 3.4 é importante para melhorar a eficiência de carregamento de células por concentração das células. Para aumentar o rendimento da experiência, de 4 a 6 módulos no mesmo chip PDMS ligado a bombas que operam independentemente são normalmente utilizados para efectuar 4 a 6 experiências diferentes (diferentes estirpes ou composições de meio) simul…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by NIH Grant AG043080 and the National Natural Science Foundation of China (NSFC), No. 11434001. We thank Lucas Waldburger for proofreading the manuscript.
Materials
| 3'' <111> silicon wafer | Addison Engineering | ||
| SU-8 2000 and 3000 Series | MicroChem | ||
| SYLGARD® 184 SILICONE ELASTOMER KIT | ellsworth | 2065622 | Include Sylgard® silicone elastomer base and curing agent |
| Petri dishes | VWR | 391-1502 | |
| Harris Uni-core™ punch(I.D. 0.75 mm) | Sigma-Aldrich | 29002513 | |
| 24 mm x 40 mm SLIP-RITE® cover glass | Thermo Fisher Scientific | 102440 | |
| 3M Scotch Tape | ULINE | S-10223 | |
| VWR® Razor Blades | VWR | 55411-050 | |
| PURE ETHANOL, KOPTEC | VWR | 64-17-5 | |
| WHOOSH-DUSTER™ | VWR | 16650-027 | |
| 5mL BD Syringe (Luer-Lock™Tip) | Becton, Dickinson and Company. | 309646 | |
| PTFE Standard Wall Tubing (100ft, AWG Size:22, Nominal ID: 0.028) | COMPONENT SUPPLY COMPANY | SWTT-22 | |
| Needle Assortment | COMPONENT SUPPLY COMPANY | NEKIT-1 | |
| Desiccator | HACH | 2238300 | |
| Lab Oven | FISHER SCIENTIFIC | 13246516GAQ | |
| Nikon TE2000 microscope with 40x and 60x objective | Nikon | ||
| Zeiss Axio Observer Z1 with 40x and 60x objective | Zeiss | ||
| Syringe Pump | Longerpump | TS-1B |
References
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