Использование микрофлюидальных устройств для измерения срок службы и сотовых фенотипов в одиночных дрожжевых клетках почкования
Summary
Данная статья представляет собой протокол, оптимизированный для производства чипов микрофлюидальных и настроек микрофлюидальных экспериментов для измерения продолжительности жизни и клеточных фенотипов одиночных дрожжевых клеток.
Abstract
Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects on the lifespan across species. However, the molecular causes of aging and death remain elusive. To gain a systematic understanding of the molecular mechanisms underlying yeast aging, we need high-throughput methods to measure lifespan and to quantify various cellular and molecular phenotypes in single cells. Previously, we developed microfluidic devices to track budding yeast mother cells throughout their lifespan while flushing away newborn daughter cells. This article presents a method for preparing microfluidic chips and for setting up microfluidic experiments. Multiple channels can be used to simultaneously track cells under different conditions or from different yeast strains. A typical setup can track hundreds of cells per channel and allow for high-resolution microscope imaging throughout the lifespan of the cells. Our method also allows detailed characterization of the lifespan, molecular markers, cell morphology, and the cell cycle dynamics of single cells. In addition, our microfluidic device is able to trap a significant amount of fresh mother cells that can be identified by downstream image analysis, making it possible to measure the lifespan with higher accuracy.
Introduction
Баддинги дрожжей является мощной моделью организмом в исследовании старения. Однако традиционный анализ продолжительности жизни дрожжей зависит от микродиссекции, который является не только трудоемкий , но и низкой пропускной способностью 1, 2. Кроме того, традиционная микродиссекция подход не дает детальное представление о различных клеточных и молекулярных особенностях в отдельных материнские клетках, поскольку они стареют. Развитие микрофлюидальных устройств позволило автоматизированную процедуру для измерения дрожжей срока службы, а также , чтобы следовать молекулярным маркерам и различные клеточные фенотипам в течение всего срока службы материнских клеток 3, 4, 5, 6, 7, 8. После того, как клетки дрожжей загружаются в микрожидкое устройство, они могут быть отслежены под микроскопом с помощью автоматических временных кругове изображений. С помощью визуализации инструменты обработки, различные клеточные и молекулярные фенотипы могут быть извлечены 3, 6, 8, в том числе срока службы, размера, флуоресцентный репортера, клеточной морфологии, динамики клеточного цикла, и т.д., многие из которых трудно или невозможно получить , используя традиционный метод микродиссекции. Микрофлюидальные устройства приобрели широкую известность в научных исследованиях дрожжей старения , так как их успешного развития несколько лет назад 3, 4, 6, 7. Несколько группы впоследствии опубликованы на вариации предыдущих конструкций 5, и многие дрожжевые лаборатории использовали микрожидкостные устройства для их изучения.
В культуре клеток, подвергающейся экспоненциальный рост, число пожилых материнских клеток, которые доступны для наблюдения miniscuле. Таким образом, общий принцип конструкции микрожидкостных устройства для измерения продолжительности жизни является сохранением материнских клеток и удалить дочерние клетки. Одним из таких конструкций используют тот факт, что дрожжи подвергается асимметричному делению клеток. Структуры в устройстве поглотит крупные материнские клетки и позволяют более мелкие дочерние клетки должны быть смыты. Микрожидкостный чип описан в этой статье используется мягкая полидиметилсилоксан (PDMS) подкладки (вертикальные столбцы Pensile) для улавливания материнских клеток (рис 1). Устройства аналогичной конструкции были ранее сообщалось 3, 4, 6, 7. Этот протокол использует более простую процедуру для изготовления микрожидкостных устройств и простого метода клеточной загрузки, который оптимизирован для экспериментов визуализации покадровых. Одним из ключевых параметров в микрофлюидальном устройстве ширин PDMS прокладок, используемых для ловушки материнских клеток. Наш device использует более широкие подушечки, которые могут держать больше маточных клеток в каждой площадке, в том числе значительной части свежих материнских клеток, которые можно отслеживать на протяжении всей их жизни. В дополнении к измерениям продолжительности жизни, этот протокол является полезным для экспериментов визуализации одной клетки покадровых когда клетки должны быть отслежены в течение многих поколений, или когда наблюдение в течение всего срока службы необходимо.
Protocol
Representative Results
Discussion
Устройство ПДМСА должно быть свежеприготовленным. В противном случае, пузырьки воздуха, вызванные вставки трубы в устройство будет трудно удалить. Шаг 3.4 имеет важное значение для повышения эффективности нагрузки сотовой ячейки путем концентрации клеток. Для того, чтобы увеличить про…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by NIH Grant AG043080 and the National Natural Science Foundation of China (NSFC), No. 11434001. We thank Lucas Waldburger for proofreading the manuscript.
Materials
| 3'' <111> silicon wafer | Addison Engineering | ||
| SU-8 2000 and 3000 Series | MicroChem | ||
| SYLGARD® 184 SILICONE ELASTOMER KIT | ellsworth | 2065622 | Include Sylgard® silicone elastomer base and curing agent |
| Petri dishes | VWR | 391-1502 | |
| Harris Uni-core™ punch(I.D. 0.75 mm) | Sigma-Aldrich | 29002513 | |
| 24 mm x 40 mm SLIP-RITE® cover glass | Thermo Fisher Scientific | 102440 | |
| 3M Scotch Tape | ULINE | S-10223 | |
| VWR® Razor Blades | VWR | 55411-050 | |
| PURE ETHANOL, KOPTEC | VWR | 64-17-5 | |
| WHOOSH-DUSTER™ | VWR | 16650-027 | |
| 5mL BD Syringe (Luer-Lock™Tip) | Becton, Dickinson and Company. | 309646 | |
| PTFE Standard Wall Tubing (100ft, AWG Size:22, Nominal ID: 0.028) | COMPONENT SUPPLY COMPANY | SWTT-22 | |
| Needle Assortment | COMPONENT SUPPLY COMPANY | NEKIT-1 | |
| Desiccator | HACH | 2238300 | |
| Lab Oven | FISHER SCIENTIFIC | 13246516GAQ | |
| Nikon TE2000 microscope with 40x and 60x objective | Nikon | ||
| Zeiss Axio Observer Z1 with 40x and 60x objective | Zeiss | ||
| Syringe Pump | Longerpump | TS-1B |
References
- Mortimer, R. K., Johnston, J. R. Life span of individual yeast cells. Nature. 183 (4677), 1751-1752 (1959).
- Polymenis, M., Kennedy, B. K. Cell biology: High-tech yeast ageing. Nature. 486 (7401), 37-38 (2012).
- Xie, Z., et al. Molecular phenotyping of aging in single yeast cells using a novel microfluidic device. Aging Cell. 11 (4), 599-606 (2012).
- Zhang, Y., et al. Single cell analysis of yeast replicative aging using a new generation of microfluidic device. PLoS One. 7 (11), e48275 (2012).
- Chen, K. L., Crane, M. M., Kaeberlein, M. Microfluidic technologies for yeast replicative lifespan studies. Mech Ageing Dev. , (2016).
- Lee, S. S., Avalos Vizcarra, ., Huberts, I., H, D., Lee, L. P., Heinemann, M. Whole lifespan microscopic observation of budding yeast aging through a microfluidic dissection platform. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (13), 4916-4920 (2012).
- Huberts, D. H., Janssens, G. E., Lee, S. S., Vizcarra, I. A., Heinemann, M. Continuous high-resolution microscopic observation of replicative aging in budding yeast. J Vis Exp. (78), e50143 (2013).
- Jo, M. C., Liu, W., Gu, L., Dang, W., Qin, L. High-throughput analysis of yeast replicative aging using a microfluidic system. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (30), 9364-9369 (2015).
- Mata, A., Fleischman, A. J., Roy, S. Fabrication of multi-layer SU-8 microstructures. Journal of Micromechanics and Microengineering. 16 (2), 276-284 (2006).
- Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Soft lithography. Angewandte Chemie-International Edition. 37 (5), 550-575 (1998).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Xie, Z., et al. Early telomerase inactivation accelerates aging independently of telomere length. Cell. 160 (5), 928-939 (2015).
- Boy-Marcotte, E., et al. The heat shock response in yeast: differential regulations and contributions of the Msn2p/Msn4p and Hsf1p regulons. Mol Microbiol. 33 (2), 274-283 (1999).
- Yang, X., Lau, K. Y., Sevim, V., Tang, C. Design principles of the yeast G1/S switch. PLoS Biol. 11 (10), e1001673 (2013).
