באמצעות מכשירים microfluidic למדוד פנוטיפים תוחלת החיים סלולר בתאי שמרים ניצני יחיד
Summary
מאמר זה מציג פרוטוקול מותאם לייצור שבבי microfluidic ואת ההתקנה של ניסויים microfluidic כדי למדוד את אורך החיים פנוטיפים הסלולר של תאי שמרים בודד.
Abstract
Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects on the lifespan across species. However, the molecular causes of aging and death remain elusive. To gain a systematic understanding of the molecular mechanisms underlying yeast aging, we need high-throughput methods to measure lifespan and to quantify various cellular and molecular phenotypes in single cells. Previously, we developed microfluidic devices to track budding yeast mother cells throughout their lifespan while flushing away newborn daughter cells. This article presents a method for preparing microfluidic chips and for setting up microfluidic experiments. Multiple channels can be used to simultaneously track cells under different conditions or from different yeast strains. A typical setup can track hundreds of cells per channel and allow for high-resolution microscope imaging throughout the lifespan of the cells. Our method also allows detailed characterization of the lifespan, molecular markers, cell morphology, and the cell cycle dynamics of single cells. In addition, our microfluidic device is able to trap a significant amount of fresh mother cells that can be identified by downstream image analysis, making it possible to measure the lifespan with higher accuracy.
Introduction
ניצני שמרים הוא אורגניזם מודל עצמת הזדקנות מחקר. עם זאת, assay תוחלת חיים מקובל בשמרים מסתמך על microdissection, וזה לא רק עבודה אינטנסיבית אך גם נמוכה תפוקה 1, 2. בנוסף, הגישה המסורתית microdissection אינה מספקת תצוגה מפורטת של תכונות תאיות ומולקולריות שונות בתאים אם חד ההוריים ככל שהם מזדקנים. הפיתוח של מכשירי microfluidic אפשר הליך אוטומטי למדידת אורך חיי שמרים, כמו גם לעקוב סמנים מולקולריים פנוטיפים הסלולר שונים לאורך חיי תאי אמא 3, 4, 5, 6, 7, 8. אחרי תאי שמרים נטענים לתוך מכשיר microfluidic, הם יכולים להיות במעקב תחת מיקרוסקופ אלקטרוני-הקפות זמן אוטומטיותהדמית דואר. בעזרת הדמית כלים לעיבוד, פנוטיפים תאיים ומולקולריים שונים ניתן לחלץ 3, 6, 8, כולל תוחלת חיים, גודל, כתב ניאון, מורפולוגיה תא, דינמיקת מחזור התא, וכו ', שרבים מהם קשים או בלתי אפשריים להשיג באמצעות שיטת microdissection המסורתית. מכשירים microfluidic שזכו להבלטה מחקר הזדקנות בשמרים מאז הפיתוח המוצלח שלהם 3 לפני כמה שנים, 4, 6, 7. מספר קבוצות מכן פרסמו על וריאציות של העיצובים הקודמים 5, ומעבדות שמרים רבות מועסקות התקני microfluidic המחקר שלהם.
בתרבות תא עוברת גידול מעריכי, מספר תאי אמו ישישה זמינים עבור תצפית הוא miniscule. לכן, עיקרון העיצוב הכללי של מכשיר microfluidic למדידות תוחלת חיים הוא לשמר תאי אמא ולהסיר תאים הבת. עיצובים אחד כזה עושה שימוש בעובדה שמרים עובר חלוקת התא אסימטרי. המבנים במלכודת המכשיר תאי אמא גדולים ולאפשר לתאי בת קטנים ייסחפו. שבב microfluidic המתואר במאמר זה משתמש polydimethylsiloxane רך (PDMS) כרית (עמודות pensile אנכיות) לתאי אמא מלכודת (איור 1). התקנים של עיצוב דומה דווחו 3 בעבר, 4, 6, 7. פרוטוקול זה משתמש הליך פשוט לפברק מכשירי microfluidic ו שיטת תא-טעינה פשוטה כי הוא אופטימיזציה עבור ניסויי הדמית הזמן לשגות. אחד הפרמטרים העיקריים במכשיר microfluidic הוא הרוחב של רפידות PDMS המשמשות תאי אמא מלכודת. ד שלנוevice משתמשת רפידות רחבות שיכול לשמור תאי אמא יותר תחת כל כרית, כולל חלק משמעותי של תאי אמא טרייה, שניתן לעקוב אחריהם לאורך כל תוחלת החיים שלהם. בנוסף מדידות אורך חיים, פרוטוקול זה הוא שימושי עבור ניסויי הדמית תא בודד זמן לשגות כאשר התאים צריכים להיות במעקב במשך דורות רבים או כאשר תצפית לאורך טווח החיים היא הכרחית.
Protocol
Representative Results
Discussion
מכשיר PDMS צריך להיעשות טרי. אחרת, את בועות האוויר הנגרם על ידי החדרת צינורות לתוך המכשיר תהיינה קשות להסיר. שלב 3.4 חשוב כדי לשפר את יעילות טעינת תא על ידי ריכוז התאים. כדי להגדיל את התפוקה של הניסוי, 4 עד 6 מודולים באותו השבב PDMS מחוברים משאבות הפועלות באופן עצמאי משמשות בד…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by NIH Grant AG043080 and the National Natural Science Foundation of China (NSFC), No. 11434001. We thank Lucas Waldburger for proofreading the manuscript.
Materials
| 3'' <111> silicon wafer | Addison Engineering | ||
| SU-8 2000 and 3000 Series | MicroChem | ||
| SYLGARD® 184 SILICONE ELASTOMER KIT | ellsworth | 2065622 | Include Sylgard® silicone elastomer base and curing agent |
| Petri dishes | VWR | 391-1502 | |
| Harris Uni-core™ punch(I.D. 0.75 mm) | Sigma-Aldrich | 29002513 | |
| 24 mm x 40 mm SLIP-RITE® cover glass | Thermo Fisher Scientific | 102440 | |
| 3M Scotch Tape | ULINE | S-10223 | |
| VWR® Razor Blades | VWR | 55411-050 | |
| PURE ETHANOL, KOPTEC | VWR | 64-17-5 | |
| WHOOSH-DUSTER™ | VWR | 16650-027 | |
| 5mL BD Syringe (Luer-Lock™Tip) | Becton, Dickinson and Company. | 309646 | |
| PTFE Standard Wall Tubing (100ft, AWG Size:22, Nominal ID: 0.028) | COMPONENT SUPPLY COMPANY | SWTT-22 | |
| Needle Assortment | COMPONENT SUPPLY COMPANY | NEKIT-1 | |
| Desiccator | HACH | 2238300 | |
| Lab Oven | FISHER SCIENTIFIC | 13246516GAQ | |
| Nikon TE2000 microscope with 40x and 60x objective | Nikon | ||
| Zeiss Axio Observer Z1 with 40x and 60x objective | Zeiss | ||
| Syringe Pump | Longerpump | TS-1B |
References
- Mortimer, R. K., Johnston, J. R. Life span of individual yeast cells. Nature. 183 (4677), 1751-1752 (1959).
- Polymenis, M., Kennedy, B. K. Cell biology: High-tech yeast ageing. Nature. 486 (7401), 37-38 (2012).
- Xie, Z., et al. Molecular phenotyping of aging in single yeast cells using a novel microfluidic device. Aging Cell. 11 (4), 599-606 (2012).
- Zhang, Y., et al. Single cell analysis of yeast replicative aging using a new generation of microfluidic device. PLoS One. 7 (11), e48275 (2012).
- Chen, K. L., Crane, M. M., Kaeberlein, M. Microfluidic technologies for yeast replicative lifespan studies. Mech Ageing Dev. , (2016).
- Lee, S. S., Avalos Vizcarra, ., Huberts, I., H, D., Lee, L. P., Heinemann, M. Whole lifespan microscopic observation of budding yeast aging through a microfluidic dissection platform. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (13), 4916-4920 (2012).
- Huberts, D. H., Janssens, G. E., Lee, S. S., Vizcarra, I. A., Heinemann, M. Continuous high-resolution microscopic observation of replicative aging in budding yeast. J Vis Exp. (78), e50143 (2013).
- Jo, M. C., Liu, W., Gu, L., Dang, W., Qin, L. High-throughput analysis of yeast replicative aging using a microfluidic system. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (30), 9364-9369 (2015).
- Mata, A., Fleischman, A. J., Roy, S. Fabrication of multi-layer SU-8 microstructures. Journal of Micromechanics and Microengineering. 16 (2), 276-284 (2006).
- Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Soft lithography. Angewandte Chemie-International Edition. 37 (5), 550-575 (1998).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Xie, Z., et al. Early telomerase inactivation accelerates aging independently of telomere length. Cell. 160 (5), 928-939 (2015).
- Boy-Marcotte, E., et al. The heat shock response in yeast: differential regulations and contributions of the Msn2p/Msn4p and Hsf1p regulons. Mol Microbiol. 33 (2), 274-283 (1999).
- Yang, X., Lau, K. Y., Sevim, V., Tang, C. Design principles of the yeast G1/S switch. PLoS Biol. 11 (10), e1001673 (2013).
