Uso di dispositivi microfluidici misurare la durata della vita e cellulare fenotipi in singole cellule di lievito in erba
Summary
Questo articolo presenta un protocollo ottimizzato per la produzione di chip microfluidici e la configurazione degli esperimenti microfluidici per misurare la durata di vita e fenotipi cellulari delle singole cellule di lievito.
Abstract
Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects on the lifespan across species. However, the molecular causes of aging and death remain elusive. To gain a systematic understanding of the molecular mechanisms underlying yeast aging, we need high-throughput methods to measure lifespan and to quantify various cellular and molecular phenotypes in single cells. Previously, we developed microfluidic devices to track budding yeast mother cells throughout their lifespan while flushing away newborn daughter cells. This article presents a method for preparing microfluidic chips and for setting up microfluidic experiments. Multiple channels can be used to simultaneously track cells under different conditions or from different yeast strains. A typical setup can track hundreds of cells per channel and allow for high-resolution microscope imaging throughout the lifespan of the cells. Our method also allows detailed characterization of the lifespan, molecular markers, cell morphology, and the cell cycle dynamics of single cells. In addition, our microfluidic device is able to trap a significant amount of fresh mother cells that can be identified by downstream image analysis, making it possible to measure the lifespan with higher accuracy.
Introduction
Erba lievito è un potente organismo modello nella ricerca sull'invecchiamento. Tuttavia, un test di durata della vita convenzionale nel lievito si basa su microdissezione, che non è solo lavoro intensivo, ma anche a basso throughput di 1, 2. Inoltre, l'approccio tradizionale microdissezione non fornisce una vista dettagliata di varie caratteristiche cellulari e molecolari nelle cellule madri singole che invecchiano. Lo sviluppo di dispositivi microfluidici ha permesso una procedura automatizzata per misurare durata lievito nonché a seguire marcatori molecolari e diversi fenotipi cellulari per tutta la durata delle cellule madri 3, 4, 5, 6, 7, 8. Dopo che le cellule di lievito vengono caricati in un dispositivo microfluidico, possono essere monitorati sotto un microscopio utilizzando temporali giri automaticie di imaging. Con l'aiuto di strumenti di elaborazione di imaging, diversi fenotipi cellulari e molecolari possono essere estratti 3, 6, 8, compresa durata, dimensioni, reporter fluorescente, morfologia cellulare, le dinamiche del ciclo cellulare, ecc, molti dei quali sono difficili o impossibili da ottenere utilizzando il metodo microdissezione tradizionale. Dispositivi microfluidici hanno assunto un rilievo nella ricerca affinamento sui lieviti in quanto il loro sviluppo di successo di qualche anno fa 3, 4, 6, 7. Diversi gruppi hanno pubblicato successivamente sulle variazioni dei disegni precedenti 5, e molti laboratori di lievito hanno impiegato dispositivi microfluidici per il loro studio.
In una cultura di cellule in fase di crescita esponenziale, il numero di cellule madri di età compresa tra che sono disponibili per l'osservazione è miniscule. Pertanto, il principio di progettazione generale del dispositivo microfluidica per le misure di durata della vita è quello di mantenere le cellule madre e per rimuovere le cellule figlie. Uno di questi disegni si avvale del fatto che il lievito subisce divisione cellulare asimmetrica. Le strutture a cellule madri trappola dispositivo volontà grandi e permettono cellule figlie piccole per essere lavato via. Il chip microfluidico descritto in questo articolo utilizza un tampone morbido polidimetilsilossano (PDMS) (colonne pensili verticali) per intrappolare cellule madri (Figura 1). Dispositivi di tipo analogo sono stati riportati precedentemente 3, 4, 6, 7. Questo protocollo utilizza una procedura semplice da fabbricare dispositivi microfluidici e un metodo cella di carico semplice che è ottimizzato per gli esperimenti time-lapse imaging. Uno dei parametri chiave del dispositivo microfluidico è la larghezza delle pastiglie PDMS utilizzati per cellule madri trappola. Il nostro device usa pastiglie più ampi che possono tenere più cellule madri sotto ogni pad, tra cui una frazione significativa di cellule madri fresche che possono essere monitorati per tutta la loro durata di vita. Oltre alle misurazioni durata della vita, questo protocollo è utile per esperimenti di imaging singola cellula time lapse quando le cellule devono essere monitorati per molte generazioni o quando un'osservazione tutta la durata della vita è necessaria.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il dispositivo PDMS deve essere preparata. Altrimenti, le bolle d'aria causate inserendo tubi nel dispositivo saranno difficili da rimuovere. Fase 3.4 è importante per migliorare l'efficienza di carico delle cellule concentrando le cellule. Per aumentare la velocità dell'esperimento, da 4 a 6 moduli sullo stesso chip PDMS collegati a pompe indipendentemente operativi sono tipicamente utilizzati per eseguire 4 a 6 diversi esperimenti (ceppi diversi o composizioni media) simultaneamente.
<p class="jove_c…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by NIH Grant AG043080 and the National Natural Science Foundation of China (NSFC), No. 11434001. We thank Lucas Waldburger for proofreading the manuscript.
Materials
| 3'' <111> silicon wafer | Addison Engineering | ||
| SU-8 2000 and 3000 Series | MicroChem | ||
| SYLGARD® 184 SILICONE ELASTOMER KIT | ellsworth | 2065622 | Include Sylgard® silicone elastomer base and curing agent |
| Petri dishes | VWR | 391-1502 | |
| Harris Uni-core™ punch(I.D. 0.75 mm) | Sigma-Aldrich | 29002513 | |
| 24 mm x 40 mm SLIP-RITE® cover glass | Thermo Fisher Scientific | 102440 | |
| 3M Scotch Tape | ULINE | S-10223 | |
| VWR® Razor Blades | VWR | 55411-050 | |
| PURE ETHANOL, KOPTEC | VWR | 64-17-5 | |
| WHOOSH-DUSTER™ | VWR | 16650-027 | |
| 5mL BD Syringe (Luer-Lock™Tip) | Becton, Dickinson and Company. | 309646 | |
| PTFE Standard Wall Tubing (100ft, AWG Size:22, Nominal ID: 0.028) | COMPONENT SUPPLY COMPANY | SWTT-22 | |
| Needle Assortment | COMPONENT SUPPLY COMPANY | NEKIT-1 | |
| Desiccator | HACH | 2238300 | |
| Lab Oven | FISHER SCIENTIFIC | 13246516GAQ | |
| Nikon TE2000 microscope with 40x and 60x objective | Nikon | ||
| Zeiss Axio Observer Z1 with 40x and 60x objective | Zeiss | ||
| Syringe Pump | Longerpump | TS-1B |
References
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