Ved hjelp av mikrofluid enheter for å måle levetid og Cellular fenotyper i enkelt spirende gjærceller

Summary

Denne artikkelen presenterer en protokoll som er optimalisert for fremstilling av microfluidic chips og oppsettet av microfluidic eksperimenter for å måle levetiden og cellulære fenotyper av enkelt gjærceller.

Abstract

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects on the lifespan across species. However, the molecular causes of aging and death remain elusive. To gain a systematic understanding of the molecular mechanisms underlying yeast aging, we need high-throughput methods to measure lifespan and to quantify various cellular and molecular phenotypes in single cells. Previously, we developed microfluidic devices to track budding yeast mother cells throughout their lifespan while flushing away newborn daughter cells. This article presents a method for preparing microfluidic chips and for setting up microfluidic experiments. Multiple channels can be used to simultaneously track cells under different conditions or from different yeast strains. A typical setup can track hundreds of cells per channel and allow for high-resolution microscope imaging throughout the lifespan of the cells. Our method also allows detailed characterization of the lifespan, molecular markers, cell morphology, and the cell cycle dynamics of single cells. In addition, our microfluidic device is able to trap a significant amount of fresh mother cells that can be identified by downstream image analysis, making it possible to measure the lifespan with higher accuracy.

Introduction

Spirende gjær er en kraftig modellorganisme i aldring forskning. Imidlertid kan en konvensjonell levetid analyse i gjær er avhengig av microdissection, som ikke bare er arbeidskrevende, men også lav gjennomstrømning ^{1, 2.} I tillegg vil den tradisjonelle mikrodisseksjon tilnærmingen ikke gi en detaljert oversikt over ulike cellulære og molekylære funksjoner i alenemor celler som de gamle. Utviklingen av microfluidic anordninger har muliggjort en automatisk fremgangsmåte for å måle gjær levetid, så vel som for å følge molekylære markører og forskjellige cellulære fenotyper gjennom hele levetiden av moder cellene ^{3, 4, 5, 6, 7, 8.} Etter at gjærcellene er lastet inn i et mikrofluidteknisk enhet, kan de bli sporet under et mikroskop ved hjelp av automatiske tids rundere avbildning. Med hjelp av bildebehandlings verktøy, kan forskjellige cellulære og molekylære fenotyper ekstraheres ^{3, 6, 8,} herunder levetid, størrelse, fluorescerende rapportør, cellemorfologi, cellesyklus dynamikk, etc., hvorav mange er vanskelige eller umulige å oppnå ved hjelp den tradisjonelle mikrodisseksjon metoden. Microfluidic enheter har fått fremtredende i gjær aldring forskning siden deres vellykkede utviklingen for noen år siden ^{3, 4, 6, 7.} Flere grupper har senere publisert på variasjoner av tidligere design ^5, og mange gjær laboratorier har ansatt microfluidic enheter for sin studie.

I en cellekultur under eksponentiell vekst, antall eldre mor celler som er tilgjengelige for observasjon er miniscule. Derfor er det generelle prinsipp av den mikrofluidinnretningen for levetids målinger er å bibeholde moderceller og for å fjerne datterceller. En slik utførelser gjør bruk av det faktum at gjæren underkastes asymmetrisk celledeling. Strukturene i enhets vil fange større moderceller og tillater mindre datterceller for å bli vasket bort. Microfluidic chip som er beskrevet i denne artikkelen, benytter en myk polydimetylsiloksan (PDMS) pute (vertikale pensile kolonner) for å felle mor-celler (figur 1). Anordninger av lignende konstruksjon er rapportert i tidligere ^{3, 4, 6, 7.} Denne protokollen bruker en enklere prosedyre for å fremstille microfluidic enheter og en enkel celle-lasting metode som er optimalisert for time-lapse bildebehandling eksperimenter. En av de viktigste parametre i mikrofluidinnretningen er bredden av PDMS elektrodene som brukes for å felle moderceller. vår device bruker bredere puter som kan holde flere moder cellene under hver blokk, inkludert en betydelig andel av frisk moderceller som kan spores gjennom hele levetiden. I tillegg til levetid, der målingene, er denne protokollen nyttig for enkelt celle på tidsintervaller bildebehandling eksperimenter når cellene må spores i mange generasjoner, eller når en observasjon gjennom hele levetiden er nødvendig.

Protocol

1. Silicon Wafer Mold Fabrication MERK: Fotomasken er designet med AutoCAD og produsert av et kommersielt selskap. Denne konstruksjonen inneholder tre lag med forskjellige mønstre ( Supplerende File 1 ). Høydene av de første, andre, og tredje lag er ca. 4 pm, 10 pm og 50 pm, respektivt. Silikonplaten Formen ble opprettet fra fotomasken ved hjelp av myklitografi 9, <sup class="xre…

Representative Results

Etter forsøkene, kan levetid for cellene og mange cellulære og molekylære fenotyper ekstraheres fra de registrerte tids-lapse bilder. Siden det er en rekke forskjellige funksjoner som kan ekstraheres fra hver celle, er det første trinnet av analysen er å kommentere cellene og hendelser, blant posisjonene og grensene til cellene og tidspunktene for ulike hendelser som blir sporet, slik som de spirende hendelser. Disse kommentarene vil gjøre det lettere å gå tilbake til det samme s…

Discussion

PDMS enheten må være rykende fersk. Ellers vil luftboblene som forårsakes ved innføring av rør i anordningen være vanskelig å fjerne. Trinn 3.4 er viktig for å forbedre den celle-innføring effektiviteten ved å konsentrere cellene. For å øke gjennomstrømningen av forsøket, 4 til 6 moduler på den samme brikke PDMS koblet til uavhengig drift av pumper er vanligvis brukes til å utføre 4 til 6 forskjellige forsøk (forskjellige stammer eller Sammensetningen av mediene) samtidig.

…

Materials

3'' <111> silicon wafer	Addison Engineering
SU-8 2000 and 3000 Series	MicroChem
SYLGARD® 184 SILICONE ELASTOMER KIT	ellsworth	2065622	Include Sylgard® silicone elastomer base and curing agent
Petri dishes	VWR	391-1502
Harris Uni-core™ punch(I.D. 0.75 mm)	Sigma-Aldrich	29002513
24 mm x 40 mm SLIP-RITE® cover glass	Thermo Fisher Scientific	102440
3M  Scotch Tape	ULINE	S-10223
VWR® Razor Blades	VWR	55411-050
PURE ETHANOL, KOPTEC	VWR	64-17-5
WHOOSH-DUSTER™	VWR	16650-027
5mL BD Syringe (Luer-Lock™Tip)	Becton, Dickinson and Company.	309646
PTFE Standard Wall Tubing (100ft, AWG Size:22, Nominal ID: 0.028)	COMPONENT SUPPLY COMPANY	SWTT-22
Needle Assortment	COMPONENT SUPPLY COMPANY	NEKIT-1
Desiccator	HACH	2238300
Lab Oven	FISHER SCIENTIFIC	13246516GAQ
Nikon TE2000 microscope with 40x and 60x objective	Nikon
Zeiss Axio Observer Z1 with 40x and 60x objective	Zeiss
Syringe Pump	Longerpump	TS-1B