JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemistry

النهج القائم على الطيف، جنبا إلى جنب السائل اللوني الكتلة لتحليل المستقلب من<em> المكورات العنقودية الذهبية</em

Published: March 28, 2017
doi:
10.3791/55558
, , ,
1Department of Biology,Georgetown University, 2Division of Infectious Diseases,Weill Cornell Medical College, 3Department of Medicine,Weill Cornell Medical College

Summary

نحن هنا وصف بروتوكول لاستخراج الأيض من المكورات العنقودية الذهبية والتحليل في وقت لاحق عبر اللوني السائل ومطياف الكتلة.

Abstract

في محاولة لإفشال مسببات الأمراض البكتيرية، وتستضيف في كثير من الأحيان تحد من توافر المواد المغذية المفيدة على موقع الإصابة. هذا التحديد يمكن أن يغير وفرة من المركبات الرئيسية التي عوامل تنظيمية تستجيب، وتعديل الأيض الخلوي. في السنوات الأخيرة، برز عدد من البروتينات والحمض النووي الريبي كما المنظمين هامة في التعبير الجيني الفوعة. على سبيل المثال، البروتين كودي يستجيب إلى مستويات الأحماض الأمينية المتفرعة السلسلة وGTP وحفظها على نطاق واسع في البلدان المنخفضة الدخل G + C البكتيريا إيجابية الجرام. كمنظم العالمي في المكورات العنقودية الذهبية، كودي تسيطر على التعبير العشرات من الفوعة والجينات التمثيل الغذائي. نحن نفترض أن بكتريا المكورة العنقودية البرتقالية يستخدم كودي، في جزء منه، إلى تغيير حالته التمثيل الغذائي في محاولة للتكيف مع ظروف تحد من المغذيات يحتمل أن تكون واجهتها في بيئة المضيف. توضح هذه المخطوطة طريقة لاستخراج وتحليل نواتج الأيض من S. الذهبية باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة إلى جانب المواصفات الشاملtrometry، وهو البروتوكول الذي تم تطويره لاختبار هذه الفرضية. يسلط الضوء على الأسلوب أيضا أفضل الممارسات التي من شأنها ضمان الدقة والتكاثر، مثل الحفاظ على حالة مستقرة البيولوجية والتهوية المستمرة دون استخدام الثقافات ناظم كيميائي مستمرة. بالنسبة إلى USA200 للميثيسيلين عرضة الذهبية S. عزل UAMS-1 السلالة الأبوية، عرضت على كودي متحولة إسوي زيادات كبيرة في الأحماض الأمينية المستمدة من اسبارتاتي (على سبيل المثال، ثريونين وآيسولوسين) والنقصان في سلائفها (على سبيل المثال، اسبارتاتي وO -acetylhomoserine ). هذه النتائج متطابقة تماما مع البيانات التي تم الحصول عليها النسخي مع تحليل الحمض النووي الريبي وما يليها: كانت الجينات في هذه المسارات يصل ينظم بين 10- و 800 أضعاف في متحولة لاغيا كودي. يمكن اقتران التحليلات العالمية لTranscriptome على وmetabolome تكشف كيف تغير البكتيريا عملية الأيض لديهم عندما تواجه مع الإجهاد البيئي أو الغذائية، وتقديم رؤية المحتملة في فيزالتغييرات المرتبطة iological نضوب المغذيات شهدت خلال العدوى. هذه الاكتشافات قد يمهد الطريق لتطوير رواية مكافحة العدوى والعلاجات.

Introduction

يجب مسببات الأمراض البكتيرية يتعامل مع العديد من التحديات في البيئة المضيفة. بالإضافة إلى الهجوم المباشر من قبل الخلايا المناعية، التي تستضيف أيضا تعزل العناصر الغذائية الضرورية للبقاء على قيد الحياة البكتيرية والتكرار، وتوليد مناعة الغذائية 1 و 2. البقاء على قيد الحياة هذه البيئات المعادية، مسببات الأمراض البكتيرية تنتشر عوامل الفوعة. بعض هذه العوامل السماح للبكتيريا للتهرب من الاستجابة المناعية. وتشمل العوامل الأخرى يفرز الإنزيمات الهضمية، مثل هيالورونيداز، thermonuclease، والليباز، والتي قد تمكن البكتيريا لتجديد المواد الغذائية التي تستهلك في عداد المفقودين المكونات المشتقة من الأنسجة 3 و 4 و 5. والواقع أن البكتيريا تطورت النظم التنظيمية التي تربط الحالة الفسيولوجية للخلية إلى إنتاج الفوعة العوامل 6، 7، <s حتى الطبقة = "XREF"> 8 و 9 و 10.

وهناك مجموعة متزايدة من الأدلة تشير الى كودي كمنظم حاسم ربط عملية التمثيل الغذائي والفوعة. على الرغم من أن اكتشفت لأول مرة في العصوية الرقيقة بمثابة كاظمة من الجين ثنائي الببتيد بيرمياز (النيابة العامة) 11، ومن المعروف كودي الآن إلى أن يتم إنتاجها من قبل ما يقرب من جميع المنخفضة البكتيريا G + C إيجابية الجرام 12 و 13 و ينظم العشرات من الجينات المسؤولة عن الكربون و الأيض 14، 15، 16، 17، 18، 19 النيتروجين. في الأنواع المسببة للأمراض، كودي أيضا تسيطر على التعبير عن بعض الجينات الفوعة أهم 20، 21،يتم تنشيط EF "> 22، 23، 24، 25، 26، 27 كودي كما بروتين ملزمة DNA من قبل فئتين من بروابط: الأحماض الأمينية المتفرعة السلسلة (BCAAs، آيسولوسين، ليسين، وحمض أميني أساسي [ILV]) وGTP . عندما تكون هذه المواد الغذائية وفيرة، ويقمع كودي (أو في بعض الحالات، ويحفز) النسخ. وتصبح هذه المواد الغذائية محدودة، وانخفاض النشاط كودي تدريجيا، مما أدى إلى استجابة النسخي متدرج أن إعادة طرق السلائف من خلال مختلف المسارات الأيضية المتصلة الأيض المركزي 28، 29، 30.
جنبا إلى جنب اللوني السائل إلى جانب لقياس الطيف الكتلي (LC-MS) هي تقنية قوية التي يمكن أن تحدد بدقة وتحديد جزيء صغير الأيض داخل الخلايا 31. عندما يقترن transcتحليل riptome (على سبيل المثال، RNA-يليها)، وهذا العمل التحليلي يمكن أن توفر نظرة ثاقبة على التغيرات الفسيولوجية التي تحدث في الاستجابة للإجهاد البيئي أو التغذية. هنا، نقدم طريقة لاستخراج المستقلب من خلايا المكورات العنقودية الذهبية وتحليلها لاحقا عبر LC-MS. وقد استخدم هذا النهج لإثبات الآثار عديد المظاهر من كودي على بكتريا المكورة العنقودية البرتقالية علم وظائف الأعضاء.

Protocol

1. إعداد العازلة حلول إعداد الفوسفات مخزنة المالحة (PBS، ودرجة الحموضة 7.4) عن طريق تمييع الحل المخزون من 10X PBS إلى التركيز النهائي من 1X مع عالى النقاء (المقطر ومنزوع الأيونات) المياه. يعد حل التب?…

Representative Results

قمنا بتحليل حمامات الأيض داخل الخلايا في S. الذهبية في المختبر خلال النمو في الغنية والمتوسطة معقدة. وكدليل على المبدأ، قارنا الشخصية الأيض بين S. الذهبية التهاب العظم والنقي للميثيسيلين عرضة عزل UAMS-1 (البرية من نوع [WT])، وسلالة إسوي تفت?…

Discussion

وترتبط جميع نواتج جزيء صغير لبعضها البعض من خلال أصول المشتركة في المسارات الأيضية المركزية. خلال النمو المتسارع، الخلايا البكتيرية هي في حالة مستقرة البيولوجية والتمثيل الغذائي، وتوفير لقطة من حالة فسيولوجية في ظل ظروف محددة. كودي تراقب الاكتفاء المواد الغذائية م…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وقد تم تمويل هذا العمل في جزء من ممر NIH لجائزة الاستقلال (منح GM 099893) وصناديق بدء التشغيل أعضاء هيئة التدريس لSRB، فضلا عن مشروع بحث غرانت (منح GM 042219). وكان الممولين أي دور في تصميم الدراسة وجمع البيانات وتفسيرها، أو قرار لتقديم عمل للنشر.

Materials

Material/Equipmenta
DeLong Culture Flask (250 ml) Belco 2510-00250
Sidearm Flask, 500 ml Pyrex 5340
3-hole Rubber Stopper, #7 Fisher 14-131E
Stainless Steel Filter holder/frit VWR 89428-936
Petri Dish, 35 mm Corning 430588 Not tissue culture treated
Mixed cellulose ester membrane, 0.22 μm pore size Millipore GSWP02500
Impact-resistant tubes, 2 ml USA Scientific 1420-9600
Silica Beads, 0.1 mm Biospec Products Inc 11079101Z
Precellys 24 homogenizer Bertin Instruments EQ03119-200-RD000.0
Micro BCA Protein Assay Kit Pierce (Thermo Scientific) 23235
Cogent Diamond hydride type C column Agilent 70000-15P-2
Accurate-Mass Time-of-Flight (TOF) LC-MS, 6200 Series Agilent G6230B
Quat Pump, 1290 Series Agilent G4204A 
Bin Pump, 1290 Series Agilent G4220A 
Valve Drive, 1290 Series Agilent G1107A 
Isocratic Pump, 1290 Series Agilent G1310B 
TCC, 1290 Series Agilent G1316C 
Sampler, 1290 Series Agilent G4226A 
Thermostat, 1290 Series Agilent G1330B 
Name Company Catalog Number Comments
Chemical
Tryptic Soy Broth Becton Dickinson 211825
Difco Agar, Granulated Becton Dickinson 214530 Solid media contains 1.5% [w/v] agar
Phosphate-buffered saline (pH 7.4) 10X Ambion AM9624 Dilute fresh to 1X with ultra-pure water
Acetonitrile Fisher Scientific A955-500 Optima LC-MS
Methanol Fisher Scientific A456-500 Optima LC-MS; toxic
Formic Acid Sigma Aldrich 94318 For mass spectrometry, 98%
Name Company Catalog Number Comments
Software
MassHunter Agilent G3337AA
Bacterial Strain Species Strain Genotype
SRB 337 Staphylococcus aureus USA200 MSSA UAMS-1 wild type
SRB 372 Staphylococcus aureus USA200 MSSA UAMS-1 ΔcodY::erm
aChemicals and materials listed are specific to the method described and do not include standard laboratory chemicals or supplies.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hood, M. I., Skaar, E. P. Nutritional immunity: transition metals at the pathogen-host interface. Nat. Rev. Microbiol. 10 (8), 525-537 (2012).
  2. Weinberg, E. D. Clinical enhancement of nutritional immunity. Comp. Ther. 1 (5), 38-40 (1975).
  3. Ibberson, C. B., et al. Staphylococcus aureus hyaluronidase is a CodY-regulated virulence factor. Infect. Immun. 82 (10), 4253-4264 (2014).
  4. Lee, C. Y., Iandolo, J. J. Mechanism of bacteriophage conversion of lipase activity in Staphylococcus aureus. J. Bacteriol. 164 (1), 288-293 (1985).
  5. Olson, M. E., et al. Staphylococcus aureus nuclease is an SaeRS-dependent virulence factor. Infect. Immun. 81 (4), 1316-1324 (2013).
  6. Somerville, G. A., Proctor, R. A. At the crossroads of bacterial metabolism and virulence factor synthesis in Staphylococci. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 73 (2), 233-248 (2009).
  7. Seidl, K., et al. Staphylococcus aureus CcpA affects virulence determinant production and antibiotic resistance. Antimicrob. Agents Chemother. 50 (4), 1183-1194 (2006).
  8. Richardson, A. R., Somerville, G. A., Sonenshein, A. L. Regulating the intersection of metabolism and pathogenesis in Gram-positive bacteria. Microbiol. Spectr. 3 (3), 1-27 (2015).
  9. Geiger, T., et al. Role of the (p)ppGpp synthase RSH, a RelA/SpoT homolog, in stringent response and virulence of Staphylococcus aureus. Infect. Immun. 78 (5), 1873-1883 (2010).
  10. Gaupp, R., et al. RpiRc is a pleiotropic effector of virulence determinant synthesis and attenuates pathogenicity in Staphylococcus aureus. Infect. Immun. 84 (7), 2031-2041 (2016).
  11. Serror, P., Sonenshein, A. L. Interaction of CodY, a novel Bacillus subtilis DNA-binding protein, with the dpp promoter region. Mol. Microbiol. 20 (4), 843-852 (1996).
  12. Sonenshein, A. L. CodY, a global regulator of stationary phase and virulence in Gram-positive bacteria. Curr. Opin. Microbiol. 8 (2), 203-207 (2005).
  13. Brinsmade, S. R. CodY, a master integrator of metabolism and virulence in Gram-positive bacteria. Curr. Genet. , (2016).
  14. Molle, V., et al. Additional targets of the Bacillus subtilis global regulator CodY identified by chromatin immunoprecipitation and genome-wide transcript analysis. J. Bacteriol. 185 (6), 1911-1922 (2003).
  15. Moses, S., et al. Proline utilization by Bacillus subtilis: Uptake and catabolism. J. Bacteriol. 194 (4), 745-758 (2012).
  16. Lobel, L., Herskovits, A. A. Systems level analyses reveal multiple regulatory activities of CodY controlling metabolism, motility, and virulence in Listeria monocytogenes. PLoS Genet. 12 (2), 1-27 (2016).
  17. Belitsky, B. R., Sonenshein, A. L. CodY-mediated regulation of guanosine uptake in Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 193 (22), 6276-6287 (2011).
  18. den Hengst, C. D., Buist, G., Nauta, A., Van Sinderen, D., Kuipers, O. P., Kok, J. Probing direct interactions between CodY and the oppD promoter of Lactococcus lactis. Microbiol. 187 (2), 512-521 (2005).
  19. Fisher, S. H. Regulation of nitrogen metabolism in Bacillus subtilis: vive la différence. Mol. Microbiol. 32 (2), 223-232 (1999).
  20. Dineen, S. S., McBride, S. M., Sonenshein, A. L. Integration of metabolism and virulence by Clostridium difficile CodY. J. Bacteriol. 192 (20), 5350-5362 (2010).
  21. Dineen, S. S., Villapakkam, A. C., Nordman, J. T., Sonenshein, A. L. Repression of Clostridium difficile toxin gene expression by CodY. Mol. Microbiol. 66 (1), 206-219 (2007).
  22. Hendriksen, W. T., et al. CodY of Streptococcus pneumoniae: Link between nutritional gene regulation and colonization. J. Bacteriol. 190 (2), 590-601 (2008).
  23. Bennett, H. J., et al. Characterization of relA and codY mutants of Listeria monocytogenes: Identification of the CodY regulon and its role in virulence. Mol. Microbiol. 63 (5), 1453-1467 (2007).
  24. Stenz, L., Francois, P., Whiteson, K., Wolz, C., Linder, P., Schrenzel, J. The CodY pleiotropic repressor controls virulence in Gram-positive pathogens. FEMS Immunol. and Med. Microbiol. 62 (2), 123-139 (2011).
  25. Majerczyk, C. D., et al. Direct targets of CodY in Staphylococcus aureus. J. Bacteriol. 192 (11), 2861-2877 (2010).
  26. Majerczyk, C. D., Sadykov, M. R., Luong, T. T., Lee, C., Somerville, G. A., Sonenshein, A. L. Staphylococcus aureus CodY negatively regulates virulence gene expression. J. Bacteriol. 190 (7), 2257-2265 (2008).
  27. Pohl, K., et al. CodY in Staphylococcus aureus: A regulatory link between metabolism and virulence gene expression. J. Bacteriol. 191 (9), 2953-2963 (2009).
  28. Sonenshein, A. L. Control of key metabolic intersections in Bacillus subtilis. Nat. Rev. Microbiol. 5 (12), 917-927 (2007).
  29. Brinsmade, S. R., et al. Hierarchical expression of genes controlled by the Bacillus subtilis global regulatory protein CodY. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 111 (22), 2-7 (2014).
  30. Waters, N. R., et al. A spectrum of CodY activities drives metabolic reorganization and virulence gene expression in Staphylococcus aureus. Mol. Microbiol. 101 (3), 495-514 (2016).
  31. Zhou, B., Xiao, J. F., Tuli, L., Ressom, H. W. LC-MS-based metabolomics. Mol. Biosyst. 8 (2), 470-481 (2012).
  32. Somerville, G. A., et al. Staphylococcus aureus aconitase inactivation unexpectedly inhibits post-exponential-phase growth and enhances stationary-phase survival. Infect. Immun. 70 (11), 6373-6382 (2002).
  33. Somerville, G. A., Said-Salim, B., Wickman, J. M., Raffel, S. J., Kreiswirth, B. N., Musser, J. M. Correlation of acetate catabolism and growth yield in Staphylococcus aureus: Implications for host-pathogen interactions. Infect. Immun. 71 (8), 4724-4732 (2003).
  34. Brinsmade, S. R., Kleijn, R. J., Sauer, U., Sonenshein, A. L. Regulation of CodY activity through modulation of intracellular branched-chain amino acid pools. J. Bacteriol. 192 (24), 6357-6368 (2010).
  35. Kaiser, J. C., Omer, S., Sheldon, J. R., Welch, I., Heinrichs, D. E. Role of BrnQ1 and BrnQ2 in branched-chain amino acid transport and virulence in Staphylococcus aureus. Infect. Immun. 83 (3), 1019-1029 (2015).
  36. Ledala, N., Zhang, B., Seravalli, J., Powers, R., Somerville, G. A. Influence of iron and aeration on Staphylococcus aureus growth, metabolism, and transcription. J. Bacteriol. 196 (12), 2178-2189 (2014).
  37. Novick, R. P. Autoinduction and signal transduction in the regulation of staphylococcal virulence. Mol. Micorbiol. 48 (6), 1429-1449 (2003).
  38. Pesek, J. J., Matyska, M. T., Fischer, S. M., Sana, T. R. Analysis of hydrophilic metabolites by high-performance liquid chromatography-mass spectrometry using a silica hydride-based stationary phase. J. Chromatog. A. 1204 (1), 48-55 (2008).
  39. Guan, X., Hoffman, B., Dwivedi, C., Matthees, D. P. A simultaneous liquid chromatography/mass spectrometric assay of glutathione, cysteine, homocysteine and their disulfides in biological samples. J. Pharm. Biomed. Anal. 31 (2), 251-261 (2003).
  40. Sporty, J. L., Kabir, M. M., Turteltaub, K. W., Ognibene, T., Lin, S. J., Bench, G. Single sample extraction protocol for the quantification of NAD and NADH redox states in Saccharomyces cerevisiae. J. Sep. Sci. 31 (18), 3202-3211 (2008).
  41. Rabinowitz, J. D., Kimball, E. Acidic acetonitrile for cellular metabolome extraction from Escherichia coli. Anal. Chem. 79 (16), 6167-6173 (2007).
  42. Somerville, G. A., Powers, R. Growth and preparation of Staphylococcus epidermidis for NMR metabolomic analysis. Methods Mol. Biol. 1106, 71-91 (2014).
  43. Roux, A., Todd, D. A., Velazquez, J. V., Cech, N. B., Sonenshein, A. L. CodY-Mediated regulation of the Staphylococcus aureus Agr system integrates nutritional and population density signals. J. Bacteriol. 196 (6), 1184-1196 (2014).
  44. Guillet, J., Hallier, M., Felden, B. Emerging functions for the Staphylococcus aureus RNome. PLoS Pathog. 9 (12), 1003767 (2013).
  45. Sauer, U., et al. Metabolic flux ratio analysis of genetic and environmental modulations of Escherichia coli central carbon metabolism. J. Bacteriol. 181 (21), 6679-6688 (1999).
  46. Niittylae, T., Chaudhuri, B., Sauer, U., Frommer, W. B. Comparison of Quantitative Metabolite Imaging Tools and Carbon-13 Techniques for Fluxomics. Methods Mol. Biol. 553 (1), 355-372 (2009).
  47. de Carvalho, L. P. S., Fischer, S. M., Marrero, J., Nathan, C., Ehrt, S., Rhee, K. Y. Metabolomics of Mycobacterium tuberculosis reveals compartmentalized co-catabolism of carbon substrates. Chem. Biol. 17 (10), 1122-1131 (2010).
  48. Weisenberg, S. A., Butterfield, T. R., Fischer, S. M., Rhee, K. Y. Suitability of silica hydride stationary phase, aqueous normal phase chromatography for untargeted metabolomic profiling of Enterococcus faecium and Staphylococcus aureus. J. Sep. Sci. 32 (13), 2262-2265 (2009).

Tags

Tandem Liquid Chromatography-Mass SpectrometryMetabolite AnalysisStaphylococcus AureusMetabolismPathogenesisNutrient DepletionHost InfectionOptical DensityExtraction BufferQuenching Solution

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Samuels, D. J., Wang, Z., Rhee, K. Y., Brinsmade, S. R. A Tandem Liquid Chromatography–Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus. J. Vis. Exp. (121), e55558, doi:10.3791/55558 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image