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Biochemistry

의 대사 산물 분석을위한 탠덤 액체 크로마토 그래피 - 질량 분석 기반 접근<em> 포도상 구균</em

Published: March 28, 2017
doi:
10.3791/55558
, , ,
1Department of Biology,Georgetown University, 2Division of Infectious Diseases,Weill Cornell Medical College, 3Department of Medicine,Weill Cornell Medical College

Summary

여기서 우리는 액체 크로마토 그래피 및 질량 분석을 통해 황색 포도상 구균과 이후 분석에서 대사 물질의 추출을위한 프로토콜을 기술한다.

Abstract

세균성 병원균을 저지하기위한 노력의 일환으로, 호스트는 종종 감염의 사이트에있는 영양소의 이용을 제한 할 수 있습니다. 이 제한은 규제 요인은 세포의 신진 대사를 조절, 대응되는 키 대사의 존재비를 변경할 수 있습니다. 최근에는 단백질과 RNA의 숫자가 독성 유전자 발현의 중요한 규제로 등장했다. 예를 들어, 코디 단백질 분지 쇄 아미노산 및 GTP의 레벨에 응답하고 널리 낮은 G + C 그램 양성 세균에 보존된다. 황색 포도상 구균의 글로벌 레귤레이터로서, 코디 독성 대사 유전자 수십개의 표현을 제어한다. 우리는 황색 포도상 구균이 코디가 부분적으로 잠재적 호스트 환경에서 발생하는 영양소 제한 조건에 적응하기위한 노력의 일환으로 자사의 대사 상태를 변경하는 데 사용하는 가설을 세웠다. 이 논문은 질량 분석과 결합 된 액체 크로마토 그래피를 이용하여 S. 구균에서 대사를 추출하여 분석하는 방법을 설명trometry,이 가설을 테스트하기 위해 개발 된 프로토콜입니다. 이 방법은 또한 연속 chemostat 문화를 사용하지 않고 생물학적 정상 상태와 일정한 통기를 유지하는 등 엄격하고 재현성을 보장 모범 사례를 강조한다. USA200의 메티 실린 감수성 황색 포도상 구균에 대한 상대 UAMS -1- 모 균주를 분리은 동질 코디 돌연변이 아스파 테이트 (예를 들어, 트레오닌과 이소류신) 유래의 아미노산의 현저한 증가를 나타내 및 (그 전구체 감소 예, 아스파라긴산 및 O의 -acetylhomoserine ). 이러한 결과는 RNA-서열 분석으로 얻어진 전사 데이터와 상관 관계가 다음 코디 널 돌연변이의 10 및 800 배 사이의 상향 조절이 경로의 유전자가 있었다. 사체와 대사 체의 글로벌 분석을 커플 링하는 것은 환경이나 영양 스트레스에 직면했을 때 박테리아가 PHY를에 잠재적 인 통찰력을 제공하고, 신진 대사를 변경하는 방법을 밝힐 수영양 결핍과 관련된 iological 변화는 감염 동안 경험했다. 이러한 발견은 새로운 항 감염 제 및 치료제의 개발을위한 방법을 포장 할 수있다.

Introduction

세균성 병원체는 호스트 환경에서 많은 도전에 맞설해야합니다. 면역 세포에 의한 직접 공격뿐만 아니라, 호스트는 세균의 생존과 복제, 생성 영양 면역 1, 2 필수 영양소를 담즙산이. 이러한 적대적 환경에서 살아 남기 위해, 세균성 병원균은 병원성 인자를 배포합니다. 이러한 요소 중 일부는 박테리아가 면역 반응을 회피 할 수 있도록; 다른 인자는 조직 유래 성분 3, 4, 5를 소비하여 누락 된 영양소를 보충 할 수 있도록 세균 등 히알루, thermonuclease, 리파제 등의 소화 효소를 분비를 포함한다. 실제로, 병원성 세균, 6 인자 (7)의 생산 세포의 생리 학적 상태를 묶어 규제 시스템 진화, <s 클래스 = "외부 참조"> 8, 9, 10까지.

증거의 성장 몸은 신진 대사 및 독성을 연결하는 중요한 레귤레이터로 코디를 가리 킵니다. 먼저 디 펩티드 퍼 미아 제 (DPP) 유전자 (11)의 리프레로서 고초균에서 발견되지만, 코디는 현재 거의 모든 낮은 G + C 그램 양성 세균 (12, 13)에 의해 생성되는 것으로 알려져 및 조절되는 탄소가 관여하는 유전자 수십 질소 대사 14, 15, 16, 17, 18, 19. 병원성 종에서, 코디는 가장 중요한 독성 유전자 (20), (21)의 일부의 발현을 제어하고,. EF "> 22, 23, 24, 25, 26, 27 코디 리간드의 두 개의 클래스에 의해 DNA 결합 단백질로 활성화되어 분지 쇄 아미노산 (BCAA를, 이소류신, 류신 및 발린 [ILV])과 GTP 전사 이러한 영양소가 풍부하면., 코디 억압 (또는 어떤 경우에, 자극). 이러한 영양소가 제한 될 때, 코디 활동이 점차 감소되고, – 경로를 다시하는 것은 중앙 대사에 연결된 다양한 대사 경로를 통해 전구체하는 경사 전사 반응을 초래 28, 29, 30.
질량 분석기 (LC-MS)에 결합 된 액체 크로마토 그래피 탠덤 정확하게 저분자 세포 대사 (31)를 식별하고 정량화 할 수있는 강력한 기술이다. transc와 결합 할 때riptome 분석 (예, RNA-SEQ)는이 분석 워크 플로우 환경이나 영양 스트레스에 반응하여 발생하는 생리적 변화에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 여기서는 LC-MS를 통해 포도상 구균 세포 및 후속 분석 대사 추출을위한 방법을 제시한다. 이 방법은 S. aureus에 생리학 코디의다면 발현 성 효과를 보여주기 위해 사용되었다.

Protocol

버퍼 솔루션 1. 준비 인산 완충 식염수 준비, 초순수로 1 배의 최종 농도로 10 배 PBS의 원액을 희석하여 (PBS pH를 7.4) (증류수 및 탈) 물. 아세토 니트릴 2 ㎖, 메탄올 2 ㎖, 초순수 H 2 O 1 ㎖, 포름산 19 μL (0.1 mM의 최종 농도)을 조합하여 켄칭 용액을 준비한다. LC-MS 초순수에 포름산 (0.2 % [v / V를] 최종 농도)을 첨가하여 용매를 준비한다. 아세토 니트릴, 포름산 (0.2 % …

Representative Results

우리는 풍부하고 복잡한 배지에서 체외 성장 동안 S. 구균 세포 내 대사 풀을 분석 하였다. 원리 증명 된 바와 같이, 우리는 비교 메티 실린 감수성 S. 구균 골수염 간 대사 프로파일 UAMS -1- (야생형 [WT]) 및 글로벌 전사 조절 코디 (Δ 코디) (26)가없는 동종의 균주를 분리. 프로토콜의 단계 2에 기술 된 바와 같이 정상 상태에서, WT ?…

Discussion

모든 작은 분자 대사는 중앙 대사 경로에서 공통의 기원을 통해 서로 연결되어있다. 기하 급수적으로 성장하는 동안 박테리아 세포는 특정 조건 하에서 생리 상태의 스냅 샷을 제공하는 생물학적 대사 안정 상태에있다. 코디 ILV와 GTP에 응답하여 영양 자족을 모니터링합니다. ILV 및 GTP 풀 강하 같이, 코디 활성 가능성 점진적 영양분 고갈 (30)의 증가에 적응하는 그것의 표적 유전?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품은 독립 수상에 NIH 통로 (GM 099,893을 부여) 교수 시작 기금 SRB에,뿐만 아니라 연구 프로젝트 그랜트 (GM 042219 부여)에 의해 부분적으로 투자되었다. 자금 제공자는 연구 설계, 자료 수집 및 해석, 또는 출판을 위해 작업을 제출하기로 결정에서 아무런 역할이 없었다.

Materials

Material/Equipmenta
DeLong Culture Flask (250 ml) Belco 2510-00250
Sidearm Flask, 500 ml Pyrex 5340
3-hole Rubber Stopper, #7 Fisher 14-131E
Stainless Steel Filter holder/frit VWR 89428-936
Petri Dish, 35 mm Corning 430588 Not tissue culture treated
Mixed cellulose ester membrane, 0.22 μm pore size Millipore GSWP02500
Impact-resistant tubes, 2 ml USA Scientific 1420-9600
Silica Beads, 0.1 mm Biospec Products Inc 11079101Z
Precellys 24 homogenizer Bertin Instruments EQ03119-200-RD000.0
Micro BCA Protein Assay Kit Pierce (Thermo Scientific) 23235
Cogent Diamond hydride type C column Agilent 70000-15P-2
Accurate-Mass Time-of-Flight (TOF) LC-MS, 6200 Series Agilent G6230B
Quat Pump, 1290 Series Agilent G4204A 
Bin Pump, 1290 Series Agilent G4220A 
Valve Drive, 1290 Series Agilent G1107A 
Isocratic Pump, 1290 Series Agilent G1310B 
TCC, 1290 Series Agilent G1316C 
Sampler, 1290 Series Agilent G4226A 
Thermostat, 1290 Series Agilent G1330B 
Name Company Catalog Number Comments
Chemical
Tryptic Soy Broth Becton Dickinson 211825
Difco Agar, Granulated Becton Dickinson 214530 Solid media contains 1.5% [w/v] agar
Phosphate-buffered saline (pH 7.4) 10X Ambion AM9624 Dilute fresh to 1X with ultra-pure water
Acetonitrile Fisher Scientific A955-500 Optima LC-MS
Methanol Fisher Scientific A456-500 Optima LC-MS; toxic
Formic Acid Sigma Aldrich 94318 For mass spectrometry, 98%
Name Company Catalog Number Comments
Software
MassHunter Agilent G3337AA
Bacterial Strain Species Strain Genotype
SRB 337 Staphylococcus aureus USA200 MSSA UAMS-1 wild type
SRB 372 Staphylococcus aureus USA200 MSSA UAMS-1 ΔcodY::erm
aChemicals and materials listed are specific to the method described and do not include standard laboratory chemicals or supplies.
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References

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Keywords: Tandem Liquid Chromatography-Mass SpectrometryMetabolite AnalysisStaphylococcus AureusMetabolismPathogenesisNutrient DepletionHost InfectionOptical DensityExtraction BufferQuenching Solution
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Samuels, D. J., Wang, Z., Rhee, K. Y., Brinsmade, S. R. A Tandem Liquid Chromatography–Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus. J. Vis. Exp. (121), e55558, doi:10.3791/55558 (2017).
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