Une approche fondée Spectrométrie liquide tandem chromatographie-masse pour l'analyse des Métabolite<em> Staphylococcus aureus</em

Summary

Nous décrivons ici un protocole pour l'extraction des métabolites à partir de Staphylococcus aureus et leur analyse ultérieure par Chromatographie liquide et spectrométrie de masse.

Abstract

Dans un effort pour contrecarrer les bactéries pathogènes, les hôtes limitent souvent la disponibilité des nutriments sur le site de l'infection. Cette limitation peut modifier les abondances des métabolites clés qui répondent facteurs réglementaires, l'ajustement du métabolisme cellulaire. Ces dernières années, un certain nombre de protéines et d'ARN ont émergé comme des régulateurs importants de l'expression des gènes de virulence. Par exemple, la protéine CodY répond à des niveaux d'acides aminés à chaîne ramifiée et GTP et est largement conservée dans bas G + C des bactéries Gram-positives. En tant que régulateur global dans Staphylococcus aureus, CodY contrôle l'expression de douzaines de gènes de virulence et métaboliques. Nous présumons que S. aureus utilise CodY, en partie, de modifier son état métabolique dans un effort d'adaptation aux conditions de limitation de nutriments potentiellement rencontrés dans l'environnement hôte. Ce manuscrit décrit un procédé pour l' extraction et l' analyse des métabolites provenant de S. aureus en utilisant la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de massespectrométrie, un protocole qui a été développé pour tester cette hypothèse. La méthode met également en évidence les meilleures pratiques qui assureront la rigueur et la reproductibilité, comme le maintien de l'état d'équilibre biologique et l'aération constante sans l'utilisation des cultures de chémostat continue. Par rapport aux USA200 sensibles à la méthicilline de S. aureus souche parentale isoler UAMS-1, le mutant isogénique codY présentait une augmentation significative des acides aminés dérivés de l' aspartate (par exemple, threonine et isoleucine) et des diminutions de leurs précurseurs (par exemple, l' aspartate et O -acetylhomoserine ). Ces résultats sont en bonne corrélation avec les données de transcription obtenus avec l' analyse de l' ARN-seq: gènes dans ces voies ont été régulés à la hausse entre 10 et 800 fois dans le mutant nul codY. Le couplage des analyses globales du transcriptome et métabolome peut révéler comment les bactéries modifient leur métabolisme lorsqu'ils sont confrontés à un stress environnemental ou alimentaire, fournissant un aperçu potentiel dans les Physchangements siologiques associés à l'épuisement des nutriments a connu au cours de l'infection. Ces découvertes peuvent ouvrir la voie à la mise au point de nouveaux anti-infectieux et thérapeutiques.

Introduction

Les bactéries pathogènes doivent faire face à de nombreux défis dans l'environnement hôte. En plus d'attaque directe par les cellules immunitaires, l'hôte séquestrant également des nutriments essentiels pour la survie et la réplication bactérienne, générant une immunité nutritionnelle ^{1, 2.} Pour survivre à ces environnements hostiles, les bactéries pathogènes déploient des facteurs de virulence. Certains de ces facteurs permettent aux bactéries d'échapper à la réponse immunitaire; D' autres facteurs comprennent sécrétées enzymes digestives, telles que l' hyaluronidase, thermonucléase, et la lipase, ce qui peut permettre aux bactéries de reconstituer les éléments nutritifs manquants en consommant des constituants dérivés de tissus ^{3, 4, 5.} En effet, les bactéries ont développé des systèmes de réglementation qui lient l'état physiologique de la cellule à la production de facteurs de virulence ^{6, 7,} <s up class = "xref"> ^{8, 9, 10.}

Un nombre croissant de Justificatif CodY comme à régulateur critique reliant le métabolisme et la virulence. Bien que d' abord découvert dans Bacillus subtilis comme un répresseur du gène ^11, Cody est maintenant connu perméase dipeptide (dpp) à produire par la quasi – totalité du faible G + C des bactéries Gram-positives ^{12, 13} et régule des douzaines de gènes impliqués dans le carbone et le métabolisme de l' azote ^{14, 15, 16, 17, 18, 19.} Chez les espèces pathogènes, CodY contrôle également l'expression de certains des plus importants gènes de virulence ^{20, 21,}. ef "> ^{22, 23, 24, 25, 26, 27} CodY est activée en tant que protéine de liaison à l' ADN par deux classes de ligands: acides aminés à chaîne ramifiée (BCAA, isoleucine, leucine et valine [VLI]) et GTP . Lorsque ces nutriments sont abondants, Cody refoule (ou dans certains cas, stimule) la transcription. Comme ces nutriments deviennent limitées, l'activité CodY est progressivement réduite, résultant en une réponse transcriptionnelle à gradient qui réachemine des précurseurs à travers différentes voies métaboliques liés au métabolisme central ^{28, 29, 30.}
Chromatographie liquide en tandem couplée à la spectrométrie de masse (LC-MS) est une technique puissante qui peut précisément identifier et quantifier les métabolites intracellulaires de petites molécules ^31. Lorsqu'il est associé à transcanalyse riptome (par exemple, l' ARN-Seq), ce flux de travail d' analyse peut donner un aperçu des changements physiologiques qui se produisent en réponse au stress environnemental ou nutritionnel. Ici, nous présentons une méthode pour l' extraction des métabolites à partir de cellules de Staphylococcus aureus et une analyse ultérieure par LC-MS. Cette approche a été utilisée pour démontrer les effets pléiotropiques de CodY sur la physiologie de S. aureus.

Protocol

1. Préparation de tampon Solutions Préparer une solution saline tamponnée au phosphate (PBS; pH 7,4) par dilution d'une solution mère de 10 x PBS à une concentration finale de 1 x avec ultrapure (distillée et désionisée) de l'eau. Préparer la solution de trempe en combinant 2 ml d'acétonitrile, 2 ml de methanol, 1 ml de H 2 O ultrapure, et 19 ul (0,1 mM de concentration finale) d'acide formique. Préparez solvant LC-MS A par addition d'acide formiqu…

Representative Results

Nous avons analysé les pools de métabolites intracellulaires dans S. aureus pendant la croissance in vitro dans un milieu riche et complexe,. Comme preuve de principe, nous avons des profils de métabolites comparés entre les méthicilline S. aureus sensible à l' ostéomyélite isoler UAMS-1 (type sauvage [WT]) et une souche isogénique manque le régulateur transcriptionnel global CodY (Δ codY) 26. L'état d' ?…

Discussion

Tous les métabolites de petites molécules sont reliés entre eux par leurs origines communes dans les voies métaboliques centrales. Au cours de la croissance exponentielle, les cellules bactériennes sont à l'état d'équilibre biologique et métabolique, donnant un aperçu de l'état physiologique dans des conditions spécifiques. CodY surveille la suffisance des éléments nutritifs en répondant à ILV et GTP. Comme ILV et GTP baisse des piscines, l' activité est susceptible CodY réduit progress…

Materials

Material/Equipmenta
DeLong Culture Flask (250 ml)	Belco	2510-00250
Sidearm Flask, 500 ml	Pyrex	5340
3-hole Rubber Stopper, #7	Fisher	14-131E
Stainless Steel Filter holder/frit	VWR	89428-936
Petri Dish, 35 mm	Corning	430588	Not tissue culture treated
Mixed cellulose ester membrane, 0.22 μm pore size	Millipore	GSWP02500
Impact-resistant tubes, 2 ml	USA Scientific	1420-9600
Silica Beads, 0.1 mm	Biospec Products Inc	11079101Z
Precellys 24 homogenizer	Bertin Instruments	EQ03119-200-RD000.0
Micro BCA Protein Assay Kit	Pierce (Thermo Scientific)	23235
Cogent Diamond hydride type C column	Agilent	70000-15P-2
Accurate-Mass Time-of-Flight (TOF) LC-MS, 6200 Series	Agilent	G6230B
Quat Pump, 1290 Series	Agilent	G4204A
Bin Pump, 1290 Series	Agilent	G4220A
Valve Drive, 1290 Series	Agilent	G1107A
Isocratic Pump, 1290 Series	Agilent	G1310B
TCC, 1290 Series	Agilent	G1316C
Sampler, 1290 Series	Agilent	G4226A
Thermostat, 1290 Series	Agilent	G1330B
Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemical
Tryptic Soy Broth	Becton Dickinson	211825
Difco Agar, Granulated	Becton Dickinson	214530	Solid media contains 1.5% [w/v] agar
Phosphate-buffered saline (pH 7.4) 10X	Ambion	AM9624	Dilute fresh to 1X with ultra-pure water
Acetonitrile	Fisher Scientific	A955-500	Optima LC-MS
Methanol	Fisher Scientific	A456-500	Optima LC-MS; toxic
Formic Acid	Sigma Aldrich	94318	For mass spectrometry, 98%
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
MassHunter	Agilent	G3337AA
Bacterial Strain	Species	Strain	Genotype
SRB 337	Staphylococcus aureus	USA200 MSSA UAMS-1	wild type
SRB 372	Staphylococcus aureus	USA200 MSSA UAMS-1	ΔcodY::erm
aChemicals and materials listed are specific to the method described and do not include standard laboratory chemicals or supplies.