Un enfoque basado en espectrometría de Tandem Liquid Chromatography-Mass para el análisis de metabolitos de<em> Staphylococcus aureus</em

Summary

Aquí se describe un protocolo para la extracción de metabolitos a partir de Staphylococcus aureus y su posterior análisis por cromatografía de líquidos y espectrometría de masas.

Abstract

En un esfuerzo para frustrar los patógenos bacterianos, anfitriones a menudo limitan la disponibilidad de nutrientes en el sitio de la infección. Esta limitación puede alterar las abundancias de metabolitos clave a los que factores reguladores responden, ajustando el metabolismo celular. En los últimos años, un número de proteínas y ARN han surgido como importantes reguladores de la expresión del gen de virulencia. Por ejemplo, la proteína CodY responde a niveles de aminoácidos de cadena ramificada y GTP y es ampliamente conservada en bajo de G + C bacterias Gram-positivas. Como un regulador global en Staphylococcus aureus, Cody controla la expresión de la virulencia y de genes metabólicos decenas. Se postula que el S. aureus utiliza Cody, en parte, para alterar su estado metabólico en un esfuerzo para adaptarse a las condiciones de nutrientes limitantes potencialmente encontradas en el entorno de acogida. Este manuscrito describe un método para la extracción y el análisis de metabolitos a partir de S. aureus utilizando cromatografía líquida acoplada con espectrometría de masastrometry, un protocolo que fue desarrollado para probar esta hipótesis. El método también destaca las mejores prácticas que garanticen el rigor y la reproducibilidad, tales como mantener el estado de equilibrio biológico y aireación constante y sin el uso de cultivos continuos quimiostato. Con relación a la USA200 susceptibles a la meticilina de S. aureus aislar UAMS-1 cepa parental, la isogénica mutante Cody exhibió incrementos significativos en aminoácidos derivados de aspartato (por ejemplo, treonina e isoleucina) y disminuye en sus precursores (por ejemplo, aspartato y O -acetilhomoserina ). Estos hallazgos se correlacionan bien con los datos de la transcripción obtenidos con el análisis de RNA-seq: genes en estas vías fueron reguladas entre 10 y 800 veces en el mutante nulo Cody. El acoplamiento de los análisis globales del transcriptoma y el metaboloma puede revelar cómo las bacterias alteran su metabolismo cuando se enfrentan a estrés ambiental o nutricional, proporcionando una visión potencial en los Physcambios IOLÓGICA asociados con el agotamiento de nutrientes experimentaron durante la infección. Tales descubrimientos pueden allanar el camino para el desarrollo de nuevos agentes antiinfecciosos y la terapéutica.

Introduction

Los patógenos bacterianos deben enfrentarse a muchos desafíos en el entorno de acogida. Además de ataque directo por las células inmunes, el anfitrión también secuestra nutrientes esenciales para la supervivencia y replicación bacteriana, generando inmunidad nutricional ^{1, 2.} Para sobrevivir a estos ambientes hostiles, los patógenos bacterianos se despliegan factores de virulencia. Algunos de estos factores permiten que las bacterias para evadir la respuesta inmune; Otros factores incluyen las enzimas digestivas, tales como hialuronidasa, termonucleasa, y lipasa, que pueden permitir a las bacterias para reponer los nutrientes que faltan por el consumo de constituyentes derivadas de tejido ^{3, 4, 5} secretadas. De hecho, las bacterias han evolucionado los sistemas de regulación que atan el estado fisiológico de la célula para la producción de factores de virulencia ^{6, 7,} <s hasta class = "xref"> ^{8, 9, 10.}

Un cuerpo creciente de evidencia apunta a Cody como un regulador crítico que une el metabolismo y la virulencia. Aunque primero descubierto en Bacillus subtilis como un represor del gen dipéptido permeasa (dpp) ^11, Cody ahora se sabe que se produce en casi todas las bacterias G + C Gram-positivos bajos ^{12, 13} y regula docenas de genes implicados en carbono y nitrógeno metabolismo ^{14, 15, 16, 17, 18, 19.} En las especies patógenas, Cody también controla la expresión de algunos de los genes de virulencia más importantes ^{20, 21,}. ef "> ^{22, 23, 24, 25, 26, 27} CodY se activa como una proteína de unión a ADN por dos clases de ligandos: aminoácidos de cadena ramificada (BCAA; isoleucina, leucina, y valina [ILV]) y GTP . Cuando estos nutrientes son abundantes, Cody reprime (o en algunos casos, estimula) la transcripción. Como estos nutrientes se vuelven limitado, se reduce progresivamente la actividad Cody, que resulta en una respuesta transcripcional graduada que rutas de re precursores a través de diversas vías metabólicas conectados a metabolismo central ^{28, 29, 30.}
Cromatografía líquida de Tandem acoplada a espectrometría de masas (LC-MS) es una técnica poderosa que puede identificar con precisión y cuantificar de molécula pequeña metabolitos intracelulares ^31. Cuando se combina con transcriptasaanálisis riptome (por ejemplo, RNA-Seq), este flujo de trabajo analítico puede dar una idea de los cambios fisiológicos que se producen en respuesta al estrés ambiental o nutricional. A continuación, presentamos un método para la extracción de metabolitos a partir de células de Staphylococcus aureus y el análisis posterior mediante LC-MS. Este enfoque ha sido utilizado para demostrar los efectos pleiotrópicos de CodY en S. aureus fisiología.

Protocol

1. Preparación de tampón Soluciones Prepare la solución salina tamponada con fosfato (PBS; pH 7,4) mediante la dilución de una solución madre de 10x PBS a una concentración final de 1x con ultrapura (destilada y desionizada) agua. Preparar la solución de temple mediante la combinación de 2 ml de acetonitrilo, 2 ml de metanol, 1 ml de ultrapura H 2 O, y 19! L (0,1 mM concentración final) de ácido fórmico. Prepare LC-MS disolvente A mediante la adición de ácido fórmi…

Representative Results

Hemos analizado piscinas de metabolitos intracelulares en S. aureus durante el crecimiento in vitro en un medio rico y complejo. Como prueba de principio, se compararon los perfiles de metabolitos entre el S. osteomielitis aureus sensible a la meticilina aíslan UAMS-1 (de tipo salvaje [WT]) y una cepa isogénica que carece del regulador global transcripcional CodY (Δ Cody) 26. El estado de equilibrio, se establecieron…

Discussion

Todos los metabolitos de molécula pequeña se conectan entre sí a través de sus orígenes comunes en las vías metabólicas centrales. Durante el crecimiento exponencial, las células bacterianas están en el estado de equilibrio biológico y metabólica, proporcionando una instantánea del estado fisiológico en condiciones específicas. CodY supervisa la suficiencia de nutrientes al responder a ILV y GTP. Como ILV y GTP piscinas gota, la actividad Cody es probable reduce progresivamente, el ajuste de la expresión …

Materials

Material/Equipmenta
DeLong Culture Flask (250 ml)	Belco	2510-00250
Sidearm Flask, 500 ml	Pyrex	5340
3-hole Rubber Stopper, #7	Fisher	14-131E
Stainless Steel Filter holder/frit	VWR	89428-936
Petri Dish, 35 mm	Corning	430588	Not tissue culture treated
Mixed cellulose ester membrane, 0.22 μm pore size	Millipore	GSWP02500
Impact-resistant tubes, 2 ml	USA Scientific	1420-9600
Silica Beads, 0.1 mm	Biospec Products Inc	11079101Z
Precellys 24 homogenizer	Bertin Instruments	EQ03119-200-RD000.0
Micro BCA Protein Assay Kit	Pierce (Thermo Scientific)	23235
Cogent Diamond hydride type C column	Agilent	70000-15P-2
Accurate-Mass Time-of-Flight (TOF) LC-MS, 6200 Series	Agilent	G6230B
Quat Pump, 1290 Series	Agilent	G4204A
Bin Pump, 1290 Series	Agilent	G4220A
Valve Drive, 1290 Series	Agilent	G1107A
Isocratic Pump, 1290 Series	Agilent	G1310B
TCC, 1290 Series	Agilent	G1316C
Sampler, 1290 Series	Agilent	G4226A
Thermostat, 1290 Series	Agilent	G1330B
Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemical
Tryptic Soy Broth	Becton Dickinson	211825
Difco Agar, Granulated	Becton Dickinson	214530	Solid media contains 1.5% [w/v] agar
Phosphate-buffered saline (pH 7.4) 10X	Ambion	AM9624	Dilute fresh to 1X with ultra-pure water
Acetonitrile	Fisher Scientific	A955-500	Optima LC-MS
Methanol	Fisher Scientific	A456-500	Optima LC-MS; toxic
Formic Acid	Sigma Aldrich	94318	For mass spectrometry, 98%
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
MassHunter	Agilent	G3337AA
Bacterial Strain	Species	Strain	Genotype
SRB 337	Staphylococcus aureus	USA200 MSSA UAMS-1	wild type
SRB 372	Staphylococcus aureus	USA200 MSSA UAMS-1	ΔcodY::erm
aChemicals and materials listed are specific to the method described and do not include standard laboratory chemicals or supplies.