Тандем жидкостной хроматографии на основе подхода для анализа метаболитов<em> Золотистый стафилококк</em

Summary

Здесь мы опишем протокол для экстракции метаболитов из золотистого стафилококка и их последующего анализа с помощью жидкостной хроматографии и масс – спектрометрии.

Abstract

В попытке сорвать бактериальные патогены, хозяева часто ограничивают доступность питательных веществ в месте инфекции. Это ограничение может изменить содержания ключевых метаболитов, которые регуляторные факторы отвечают, регулируя клеточный метаболизм. В последние годы ряд белков и РНК стали важными регуляторами экспрессии генов вирулентности. Так, например, белок Cody реагирует на уровни разветвленных аминокислот и ГТФ и широко сохраняется в условиях низкой G + C грамположительных бактерий. В качестве глобального регулятора в стафилококк, Cody контролирует экспрессию десятков вирулентности и метаболических генов. Мы предполагаем , что золотистый стафилококк использует Коди, в частности, для изменения его метаболического состояния в целях адаптации к питательным ограничивающим условиям , потенциально встречающимся в принимающей среде. Эта рукопись описывает способ экстракции и анализа метаболитов из золотистого стафилококка с использованием жидкостной хроматографии в сочетании с масс – спектрометрическихtrometry, протокол, который был разработан, чтобы проверить эту гипотезу. Метод также подчеркивает лучшие практики, которые будут обеспечивать строгость и воспроизводимость, такие как поддержание биологического устойчивого состояния и постоянная аэрации без использования непрерывных культур хемостатических. По отношению к USA200 метициллин-чувствительных золотистого стафилококка изолировать UAMS-1 родительского штамма, изогенных Cody мутант показал значительное увеличение аминокислот , полученных из аспартата (например, треонин и изолейцин) и уменьшается в их предшественников (например, аспартат и О -acetylhomoserine ). Эти результаты хорошо коррелируют с данными , полученными транскрипционных с РНК-сл анализа: гены в этих путей были повышающей регуляции между 10- и 800-кратного в нуль – мутанта Cody. Сцепление глобальных анализов транскриптома и метабол может показать, как бактерии изменяют свой метаболизм, когда сталкиваются с экологическим или питательным стрессом, обеспечивая потенциальное понимание в Physiological изменения, связанные с истощением питательных веществ испытали во время инфекции. Такие открытия могут проложить путь к разработке новых антибактериальных и терапевтических средств.

Introduction

Бактериальные патогены должны бороться со многими проблемами в пределах принимающей среды. В дополнении к прямой атаке иммунных клеток, хозяин также изолирует питательные вещества , необходимые для выживания бактерий и репликации, генерирующие питательная иммунитета ^{1, 2.} Чтобы выжить эти враждебные среды, бактериальные патогены развертывания факторов вирулентности. Некоторые из этих факторов позволяет бактериям уклоняться от иммунного ответа; Другие факторы включают секретируются пищеварительные ферменты, такие как гиалуронидаза, thermonuclease, и липазы, которые могут позволить бактерии пополнить недостающие питательные вещества, потребляя ткани , полученные составляющие ^{3, 4, 5.} В самом деле, бактерии развивались регуляторные системы , которые связывают физиологическое состояние клетки к продукции факторов вирулентности ^{6, 7,} <s до класса = "внешних ссылок"> ^{8, 9, 10.}

Все больше данных указывает на Коди в качестве критического регулятора, связывающего обмен веществ и вирулентность. Несмотря на то, впервые обнаружен в Bacillus зиЫШз как репрессор гена ¹¹ дипептид пермеазы (ДПП), Cody теперь известно, производится почти всеми низкими G + C , грам-положительных бактерий , ^{12, 13} и регулирует множество генов , участвующих в угле и азота , метаболизм ^{14, 15, 16, 17, 18, 19.} В патогенных видов, Cody также контролирует экспрессию некоторых из наиболее важных генов вирулентности ^{20, 21,}. эф "> ^{22, 23, 24, 25, 26, 27} Cody активируется в качестве белка ДНК-связывающего два класса лигандов: с разветвленной цепью аминокислот (ВСАА; изолейцин, лейцин и валин [РКН]) и ГТФ . Когда эти питательные вещества в изобилии, Cody репрессирует (или в некоторых случаях, стимулирует) транскрипцию. Поскольку эти питательные вещества становятся ограниченными, активность Cody постепенно уменьшается, что приводит к градуированному транскрипционному ответу, который перенаправляет предшественник с помощью различных метаболических путей, связанных с центральным метаболизмом ^{28, 29, 30.}
Тандем жидкостной хроматографии в сочетании с масс – спектрометрией (ЖХ-МС) представляет собой мощный метод , который может точно определить и количественно малые молекулы внутриклеточных метаболитов ^31. В сочетании с Закавкriptome анализ (например, РНК-Seq), этот аналитический рабочий процесс может дать представление о физиологических изменениях , которые происходят в ответ на экологический или питательный стресс. Здесь мы представляем метод для экстракции метаболита из клеток золотистого стафилококка и последующего анализа с помощью LC-MS. Этот подход был использован для демонстрации плеотропных эффектов Кодьте на золотистом стафилококке физиологии.

Protocol

1. Приготовление буферных растворов Подготовка фосфатно-солевого буфера (PBS,; рН 7,4) путем разбавления исходного раствора 10х PBS до конечной концентрации 1х с сверхчистых (дистиллированной и деионизированной) водой. Готовят раствор закалки путем объединения 2 мл ацетонитрила, 2 …

Representative Results

Мы провели анализ внутриклеточных пулов метаболита в золотистого стафилококка в процессе роста в пробирке в богатой, сложной среде. В качестве доказательства принципа, мы сравнили метаболит профили между метициллиночувствительным золотистым стафилокок…

Discussion

Все метаболиты малых молекул связаны друг с другом через их общее происхождение в центральных метаболических путях. Во время экспоненциального роста, бактериальные клетки находятся в биологическом и метаболическом стационарном состоянии, обеспечивая снимок физиологического состоя…

Materials

Material/Equipmenta
DeLong Culture Flask (250 ml)	Belco	2510-00250
Sidearm Flask, 500 ml	Pyrex	5340
3-hole Rubber Stopper, #7	Fisher	14-131E
Stainless Steel Filter holder/frit	VWR	89428-936
Petri Dish, 35 mm	Corning	430588	Not tissue culture treated
Mixed cellulose ester membrane, 0.22 μm pore size	Millipore	GSWP02500
Impact-resistant tubes, 2 ml	USA Scientific	1420-9600
Silica Beads, 0.1 mm	Biospec Products Inc	11079101Z
Precellys 24 homogenizer	Bertin Instruments	EQ03119-200-RD000.0
Micro BCA Protein Assay Kit	Pierce (Thermo Scientific)	23235
Cogent Diamond hydride type C column	Agilent	70000-15P-2
Accurate-Mass Time-of-Flight (TOF) LC-MS, 6200 Series	Agilent	G6230B
Quat Pump, 1290 Series	Agilent	G4204A
Bin Pump, 1290 Series	Agilent	G4220A
Valve Drive, 1290 Series	Agilent	G1107A
Isocratic Pump, 1290 Series	Agilent	G1310B
TCC, 1290 Series	Agilent	G1316C
Sampler, 1290 Series	Agilent	G4226A
Thermostat, 1290 Series	Agilent	G1330B
Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemical
Tryptic Soy Broth	Becton Dickinson	211825
Difco Agar, Granulated	Becton Dickinson	214530	Solid media contains 1.5% [w/v] agar
Phosphate-buffered saline (pH 7.4) 10X	Ambion	AM9624	Dilute fresh to 1X with ultra-pure water
Acetonitrile	Fisher Scientific	A955-500	Optima LC-MS
Methanol	Fisher Scientific	A456-500	Optima LC-MS; toxic
Formic Acid	Sigma Aldrich	94318	For mass spectrometry, 98%
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
MassHunter	Agilent	G3337AA
Bacterial Strain	Species	Strain	Genotype
SRB 337	Staphylococcus aureus	USA200 MSSA UAMS-1	wild type
SRB 372	Staphylococcus aureus	USA200 MSSA UAMS-1	ΔcodY::erm
aChemicals and materials listed are specific to the method described and do not include standard laboratory chemicals or supplies.