כאן אנו מתארים פרוטוקול להפקת מטבוליטים מ סטפילוקוקוס והניתוח הבא שלהם באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית ו ספקטרומטריית מסה.
במאמץ לסכל חיידקים פתוגנים, מארחים קרובים להגביל את הזמינות של חומרים מזינים באתר של זיהום. הגבלה זו יכולה לשנות את שכיחותם של מטבוליטים מפתח אשר גורם רגולטוריים להגיב, התאמת חילוף חומרים תאיים. בשנים האחרונות, מספר החלבונים ו- RNA צמח כמו רגולטורים חשובים של ביטוי גנים ארסיים. לדוגמה, החלבון Cody מגיב רמות של חומצות אמינו מסועפות שרשרת ו GTP ו נשמרת נרחב חיידקים G + C גראם חיובי נמוך. כרגולטור עולמי Staphylococcus aureus, Cody שולט הביטוי של עשרות ארסיות וגני מטבולית. אנו משערים כי S. aureus משתמשת cody, בין השאר, כדי לשנות מצב מטבולי שלה בניסיון להסתגל לתנאים מגבילים-מזין נתקלו פוטנציאלי בסביבה המארח. כתב יד זה מתאר שיטה לחילוץ וניתוח מטבוליטים מ S. aureus באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב עם מפרט מוניתtrometry, פרוטוקול אשר פותח על מנת לבחון השערה זו. השיטה גם מדגישה מומלצת שיבטיחו הקפדת שחזור, כגון שמירה על מצב יציב ביולוגי אוורור קבוע ללא שימוש בתרבויות chemostat רציפות. ביחס aureus USA200 ס רגיש ל- methicillin לבודד UAMS-1 זן הורי, מוטצית Cody isogenic הציגה עליות משמעותיות חומצות אמינו הנגזרות aspartate (למשל, תראונין ואיזולויסין) וירידות קודמיהם (למשל, אספרטט ו- O -acetylhomoserine ). ממצאים אלה תואמים היטב עם נתוני תעתיק שהושגו עם ניתוח RNA-seq: גנים במסלולים אלה היו למעלה מוסדרים בין 10 ו 800 של פי מוטצית Cody null. צימוד ניתוחים הגלובליים של transcriptome ואת metabolome יכול לחשוף כמה חיידקים לשנות את חילוף החומרים שלהם כאשר הוא מתמודד עם לחץ סביבתי או תזונתי, המספק תובנה פוטנציאל לתוך להתעמלותשינויים iological הקשורים דלדול מזין חוו במהלך זיהום. תגליות אלה עשויות לסלול את הדרך לפיתוח תרופות נוגדת זיהום ואת הרומן.
חיידקים פתוגנים חייבים להתמודד עם אתגרים רבים בתוך הסביבה המארחת. בנוסף התקפה ישירה על ידי תאי מערכת חיסון, המארח גם sequesters מזינים חיוניים להישרדות שכפול חיידקים, יצירת חסינויות תזונתיות 1, 2. כדי לשרוד בסביבה העוינת אלה, חיידקים פתוגנים לפרוס גורמים ארסיים. חלק מגורמים אלה מאפשרים החיידק להתחמק התגובה החיסונית; גורמים אחרים כוללים מופרש אנזימי עיכול, כגון hyaluronidase, thermonuclease, וטריפז, אשר עשוי לאפשר לחיידקים לחדש מזינים חסרים על ידי צריכת מרכיבים שמקורם ברקמה 3, 4, 5. ואכן, חיידקים התפתחו מערכות רגולטוריות שקושרים את המצב הפיזיולוגי של התא לייצור של גורמים בחיידק הגורם 6, 7, <s עד class = "Xref"> 8, 9, 10.
גוף גדל והולך של ראיות מצביע Cody כרגולטור קריטי המקשר חילוף חומרים ואת ארסיות. למרות גילו לראשונה subtilis Bacillus בתור מדכא של permease dipeptide (DPP) גן 11, קודי הוא ידוע כיום להיות מיוצר על ידי כמעט כל החיידקים G + C נמוך גראם חיובי 12, 13 ו מסדיר עשרות גנים המעורבים פחמן חנקן המטבוליזם 14, 15, 16, 17, 18, 19. במינים פתוגניים, Cody שולט גם הביטוי של כמה גנים הארסיים החשובים 20, 21,. EF "> 22, 23, 24, 25, 26, 27 קודי מופעל בתור חלבון קושר DNA על ידי שתי כיתות של הליגנדים: חומצות אמינו מסועפות שרשרת (BCAAs; ואיזולויסין, לאוצין, ו- וואלין [ILV]) ו GTP . כאשר מזין אלה נמצאים בשפע, Cody מדחיק (או במקרים מסוימים, מגרה) תעתיק. כמו חומרים מזינים אלו הופכים מוגבלים, פעילות Cody מצטמצמת בהדרגה, ומביא לתגובת תעתיק מדורגת כי חישוב מחדש של מסלולים מבשרים דרך מסלולי מטבוליים שונים הקשורים למטבוליזם מרכזי 28, 29, 30.
כרומטוגרפיה נוזלית טנדם מצמידים ספקטרומטריית מסה (LC-MS) הינה טכניקה שיכולה לזהות במדויק ולכמת מטבוליטים תאיים-מולקולה קטנה 31. כאשר יחד עם transcניתוח riptome (למשל, RNA-seq), עבודה אנליטית זה יכול לספק תובנות לגבי השינויים הפיסיולוגיים המתרחשים בתגובה לעקה סביבתית או תזונתית. כאן, אנו מציגים שיטה להפקת המטבוליט מתאי סטפילוקוקוס וניתוח שלאחר מכן באמצעות LC-MS. גישה זו נעשה שימוש כדי להדגים את ההשפעות pleiotropic של Cody על הפיזיולוגיה aureus S..
כל מטבוליטים המולקולות קטנות מחוברים זו לזו באמצעות מקורותיה המשותפים שלהם מסלולי מטבוליים מרכזיים. במהלך גידול מעריכי, תאי חיידקיים הם על מצב יציב ביולוגי מטבוליות, מתן תמונת מצב של המצב הפיזיולוגי בתנאים ספציפיים. Cody מפקחת הסתפקות מזין ידי היענות ILV ו GTP. כפי ILV ושח?…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו מומנה בחלקה על ידי מסלול NIH כדי פרס העצמאות (להעניק GM 099,893) וקרנות ההפעלה הסגל כדי SRB, כמו גם גרנט פרויקט מחקר (להעניק GM 042,219). הממנים לא היה תפקיד בעיצוב המחקר, איסוף הנתונים לפרשנות, או ההחלטה להגיש את העבודה עבור פרסום.
Material/Equipmenta | |||
DeLong Culture Flask (250 ml) | Belco | 2510-00250 | |
Sidearm Flask, 500 ml | Pyrex | 5340 | |
3-hole Rubber Stopper, #7 | Fisher | 14-131E | |
Stainless Steel Filter holder/frit | VWR | 89428-936 | |
Petri Dish, 35 mm | Corning | 430588 | Not tissue culture treated |
Mixed cellulose ester membrane, 0.22 μm pore size | Millipore | GSWP02500 | |
Impact-resistant tubes, 2 ml | USA Scientific | 1420-9600 | |
Silica Beads, 0.1 mm | Biospec Products Inc | 11079101Z | |
Precellys 24 homogenizer | Bertin Instruments | EQ03119-200-RD000.0 | |
Micro BCA Protein Assay Kit | Pierce (Thermo Scientific) | 23235 | |
Cogent Diamond hydride type C column | Agilent | 70000-15P-2 | |
Accurate-Mass Time-of-Flight (TOF) LC-MS, 6200 Series | Agilent | G6230B | |
Quat Pump, 1290 Series | Agilent | G4204A | |
Bin Pump, 1290 Series | Agilent | G4220A | |
Valve Drive, 1290 Series | Agilent | G1107A | |
Isocratic Pump, 1290 Series | Agilent | G1310B | |
TCC, 1290 Series | Agilent | G1316C | |
Sampler, 1290 Series | Agilent | G4226A | |
Thermostat, 1290 Series | Agilent | G1330B | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Chemical | |||
Tryptic Soy Broth | Becton Dickinson | 211825 | |
Difco Agar, Granulated | Becton Dickinson | 214530 | Solid media contains 1.5% [w/v] agar |
Phosphate-buffered saline (pH 7.4) 10X | Ambion | AM9624 | Dilute fresh to 1X with ultra-pure water |
Acetonitrile | Fisher Scientific | A955-500 | Optima LC-MS |
Methanol | Fisher Scientific | A456-500 | Optima LC-MS; toxic |
Formic Acid | Sigma Aldrich | 94318 | For mass spectrometry, 98% |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software | |||
MassHunter | Agilent | G3337AA | |
Bacterial Strain | Species | Strain | Genotype |
SRB 337 | Staphylococcus aureus | USA200 MSSA UAMS-1 | wild type |
SRB 372 | Staphylococcus aureus | USA200 MSSA UAMS-1 | ΔcodY::erm |
aChemicals and materials listed are specific to the method described and do not include standard laboratory chemicals or supplies. |