En Tandem væskekromatografi-massespektrometri-baseret tilgang til Metabolit Analyse af<em> Staphylococcus aureus</em

Summary

Her beskriver vi en protokol til ekstraktion af metabolitter fra Staphylococcus aureus og deres efterfølgende analyse via væskekromatografi og massespektrometri.

Abstract

I et forsøg på at forpurre bakterielle patogener, værter ofte begrænse tilgængeligheden af ​​næringsstoffer i stedet for infektion. Denne begrænsning kan ændre mængderne af centrale metabolitter, som regulatoriske faktorer reagerer, justering cellulær metabolisme. I de senere år har en række proteiner og RNA opstået som vigtige regulatorer af virulens genekspression. For eksempel Cody proteinet reagerer på niveauer af forgrenede aminosyrer og GTP og er bredt konserveret i lav G + C grampositive bakterier. Som en global regulator i Staphylococcus aureus, Cody kontrollerer ekspressionen af snesevis af virulens og metaboliske gener. Vi hypotesen, at S. aureus anvender Cody delvis at ændre sin metabolisk tilstand i et forsøg på at tilpasse sig til næringsstof-begrænsende betingelser potentielt stødt i værtsmiljøet. Dette manuskript beskriver en fremgangsmåde til ekstraktion og analyse af metabolitter fra S. aureus under anvendelse af væskekromatografi koblet med massespektrumtrometry, en protokol, der blev udviklet for at teste denne hypotese. Fremgangsmåden fremhæver også god praksis som kan sikre stringens og reproducerbarhed, såsom opretholdelse af biologisk stabil tilstand og konstant beluftning uden brug af kontinuerlige kemostat kulturer. I forhold til de USA200 methicillin-modtagelige S. aureus isolere UAMS-1 parentale stamme, den isogene Cody mutanten udviste signifikante stigninger i aminosyrer afledt fra aspartat (fx threonin og isoleucin) og fald i deres forstadier (for eksempel aspartat og O -acetylhomoserine ). Disse fund korrelerer godt med transkriptionelle data opnået med RNA-seq analyse: gener i disse veje opreguleret mellem 10- og 800-fold i Cody null mutant. Kobling globale analyser af transkriptom og metabolomet kan afsløre, hvordan bakterier ændre deres metabolisme når de står med miljø- eller ernæringsmæssig stress, der giver potentiel indsigt i fysiological ændringer forbundet med næringsstof udtynding oplevet under infektion. Sådanne opdagelser kan bane vejen for udviklingen af ​​hidtil ukendte anti-infektiøse og terapeutika.

Introduction

Bakteriepatogener skal kæmpe med mange udfordringer inden værten miljø. Ud over direkte angreb af immunceller, værten sekvestrerer også næringsstoffer afgørende for bakteriel overlevelse og replikation, frembringelse ernæringsmæssige immunitet ^{1, 2.} For at overleve disse fjendtlige miljøer, bakterielle patogener implementere virulensfaktorer. Nogle af disse faktorer tillader bakterierne at unddrage sig den immunrespons; Andre faktorer omfatter udskilles fordøjelsesenzymer, såsom hyaluronidase, thermonuclease, og lipase, som kan gøre det muligt for bakterierne at genopbygge manglende næringsstoffer ved at indtage vævsafledte bestanddele ^{3, 4, 5.} Faktisk har bakterier udviklet reguleringssystemer, der binder den fysiologiske tilstand af cellen til produktion af virulensfaktorer ^{6, 7,} <s op class = "xref"> ^{8, 9, 10.}

En voksende dokumentation peger på Cody som et kritisk regulator forbinder metabolisme og virulens. Selvom først opdaget i Bacillus subtilis som en repressor af dipeptidet permease (dpp) gen ¹¹ er Cody nu vides at blive produceret af næsten alle de lave G + C Gram-positive bakterier ^{12, 13} og regulerer snesevis af gener involveret i carbon og nitrogenmetabolisme ^{14, 15, 16, 17, 18, 19.} I patogene arter, Cody styrer også udtryk for nogle af de vigtigste virulensgener ^{20, 21,}. ef "> ^{22, 23, 24, 25, 26, 27} Cody aktiveres som en DNA-bindende protein ved to klasser af ligander: forgrenet aminosyre (BCAA, isoleucin, leucin og valin [ILV]) og GTP . Når disse næringsstoffer er rigelige, Cody undertrykker (eller i nogle tilfælde stimulerer transskription). Da disse næringsstoffer bliver begrænset, Cody aktivitet nedsættes gradvis, hvilket resulterer i en gradueret transkriptionel respons, som re-dirigeres forstadier gennem forskellige metaboliske veje er forbundet til det centrale stofskifte ^{28, 29, 30.}
Tandem væskekromatografi koblet til massespektrometri (LC-MS) er en kraftfuld teknik, der nøjagtigt kan identificere og kvantificere små molekyler intracellulære metabolitter ^31. Når parret med transcriptome analyse (fx RNA-Seq), denne analytiske arbejdsgang kan give indsigt i de fysiologiske forandringer, der sker som reaktion på miljømæssig eller ernæringsmæssig stress. Her præsenteres en fremgangsmåde til metabolit ekstraktion fra Staphylococcus aureus-celler og efterfølgende analyse via LCMS. Denne fremgangsmåde er blevet anvendt til at påvise de pleiotrope virkninger af Cody på S. aureus fysiologi.

Protocol

1. Udarbejdelse af Buffer Solutions Forberede phosphatbufret saltvand (PBS; pH 7,4) ved fortynding af en stamopløsning af 10x PBS til en slutkoncentration på 1 x med ultrarent (destilleret og deioniseret) vand. Forberede quenching opløsning ved at kombinere 2 ml acetonitril, 2 ml methanol, 1 ml ultrarent H2O, og 19 pi (0,1 mM slutkoncentration) myresyre. Forberede LC-MS opløsningsmiddel A ved tilsætning af myresyre (0,2% [v / v] slutkoncentration) til ultrarent vand. <…

Representative Results

Vi har analyseret intracellulære metabolit pools i S. aureus under in vitro vækst i et rigt, komplekst medium. Som bevis for princippet, sammenlignede vi metabolitprofiler mellem methicillinmodtagelig S. aureus osteomyelitis isolere UAMS-1 (vildtype [WT]) og en isogen stamme, der mangler den globale transkriptionel regulator Cody (Δ Cody) 26. Steady-state blev eksponentielle kulturer af WT og Cody stammer etableret i…

Discussion

Alle små molekyler metabolitter forbundet med hinanden via deres fælles oprindelse i de centrale metaboliske veje. Under eksponentiel vækst, bakterieceller er i biologisk og metabolisk stabil tilstand, tilvejebringelse af et øjebliksbillede af den fysiologiske tilstand under specifikke betingelser. Cody overvåger næringsstof tilstrækkelighed ved at reagere på ILV og GTP. Som ILV og GTP pools dråbe, er Cody aktivitet sandsynligvis nedsættes gradvis, indstilling af ekspression af dens målgener til at tilpasse s…

Materials

Material/Equipmenta
DeLong Culture Flask (250 ml)	Belco	2510-00250
Sidearm Flask, 500 ml	Pyrex	5340
3-hole Rubber Stopper, #7	Fisher	14-131E
Stainless Steel Filter holder/frit	VWR	89428-936
Petri Dish, 35 mm	Corning	430588	Not tissue culture treated
Mixed cellulose ester membrane, 0.22 μm pore size	Millipore	GSWP02500
Impact-resistant tubes, 2 ml	USA Scientific	1420-9600
Silica Beads, 0.1 mm	Biospec Products Inc	11079101Z
Precellys 24 homogenizer	Bertin Instruments	EQ03119-200-RD000.0
Micro BCA Protein Assay Kit	Pierce (Thermo Scientific)	23235
Cogent Diamond hydride type C column	Agilent	70000-15P-2
Accurate-Mass Time-of-Flight (TOF) LC-MS, 6200 Series	Agilent	G6230B
Quat Pump, 1290 Series	Agilent	G4204A
Bin Pump, 1290 Series	Agilent	G4220A
Valve Drive, 1290 Series	Agilent	G1107A
Isocratic Pump, 1290 Series	Agilent	G1310B
TCC, 1290 Series	Agilent	G1316C
Sampler, 1290 Series	Agilent	G4226A
Thermostat, 1290 Series	Agilent	G1330B
Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemical
Tryptic Soy Broth	Becton Dickinson	211825
Difco Agar, Granulated	Becton Dickinson	214530	Solid media contains 1.5% [w/v] agar
Phosphate-buffered saline (pH 7.4) 10X	Ambion	AM9624	Dilute fresh to 1X with ultra-pure water
Acetonitrile	Fisher Scientific	A955-500	Optima LC-MS
Methanol	Fisher Scientific	A456-500	Optima LC-MS; toxic
Formic Acid	Sigma Aldrich	94318	For mass spectrometry, 98%
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
MassHunter	Agilent	G3337AA
Bacterial Strain	Species	Strain	Genotype
SRB 337	Staphylococcus aureus	USA200 MSSA UAMS-1	wild type
SRB 372	Staphylococcus aureus	USA200 MSSA UAMS-1	ΔcodY::erm
aChemicals and materials listed are specific to the method described and do not include standard laboratory chemicals or supplies.