Analyse av cellesuspensjoner Isolert fra solid vev ved Spectral Flow Cytometry
Summary
Denne artikkelen beskriver spektral-cytometri, en ny tilnærming i flowcytometri som bruker former av emisjonsspektra for å skille fluorokromer. En algoritme erstatter kompensasjon og kan behandle auto-fluorescens som en uavhengig parameter. Denne nye tilnærmingen muliggjør riktig analyse av celler isolert fra faste organer.
Abstract
Strømningscytometri er blitt brukt for de siste 40 årene for å definere og analysere fenotypen til lymfoide og andre hematopoietiske celler. I første omgang begrenses til analyse av noen få fluorokromer, som for tiden er det mange forskjellige fluorescerende fargestoffer, og opp til 14-18 forskjellige fargestoffer kan kombineres på en gang. Men flere begrensninger fortsatt svekke analytiske evner. På grunn av mangfoldet av fluorescerende prober, og dataanalyse blitt stadig mer komplisert på grunn av behovet for store, multi-parametriske kompensasjon matriser. Dessuten har mutant musemodeller som bærer fluorescerende proteiner for å detektere og spore spesifikke celletyper i forskjellige vev blir tilgjengelig, slik at analyse (ved flowcytometri) av auto-fluorescerende cellesuspensjoner oppnådd fra faste organer er nødvendig. Spectral flowcytometri, som skiller formene av emisjonsspektra langs et bredt spekter av kontinuerlige bølgelengder, løser noen av disse problemene. Dataene blir analysert wed en algoritme som erstatter kompensasjon matriser og behandler auto-fluorescens som en uavhengig parameter. Således bør spektral flowcytometri være istand til å skjelne fluorokromer med tilsvarende utslippstopper, og kan tilveiebringe en multi-parametrisk analyse uten kompenseringsbehov.
Denne protokollen beskriver den spektrale flowcytometrianalyse, slik at for en 21 parameter (19 fluorescerende prober) karakterisering og styring av en auto-fluorescerende signal, som gir høy oppløsning i mindre populasjon deteksjon. Resultatene presentert her viser at spektralanalyse flowcytometri presenterer fordeler i analysen av cellepopulasjoner fra vev som er vanskelig å karakterisere på vanlig strømningscytometri, slik som hjerte og tarm. Spectral flowcytometri dermed demonstrerer multiparametrisk analysekapasitet på høy ytelse konvensjonell flowcytometri uten krav om erstatning og muliggjør auto-fluorescens administrasjon.
Introduction
I de siste tiårene, flowcytometri (FCM) ble en allment tilgjengelig analysemetode viktig for celle fenotyping studier. Det har vært en betydelig økning i de tilgjengelige fluorescerende fargestoffer, særlig fluorokromer eksiteres av den fiolette laser (405 nm) (for eksempel Brilliant Violet og nye Q-dot fargestoffer). Men øker veksten av tilgjengelige fluorescerende fargestoffer risikoen for overlappende utslipp og krever arbeidsintensive kompensasjon matriser. FCM ble allment brukt for å analysere cellesuspensjoner fra fast vev, men tilstedeværelsen av auto-fluorescerende celler begrenser diskriminering av spesifikt merket populasjoner.
De grunnleggende prinsipper for spektral FCM er gjengitt i detalj i Futamura et al. 1, 2. Kort sagt blir den spektrale FCM anvendt her (se tabell over materialer) er utstyrt med 405, 488, og 638 nm lasere. Den spektrale FCM fanger opp alt det utsendte fluorescence som spektra i en 32-kanals lineære gruppe PMT (32ch PMT) på 500 nm til 800 nm og 2 uavhengige PMTs på 420 nm til 440 nm og 450 nm til 469 nm, henholdsvis, som erstatter de konvensjonelle båndpassfiltre. De 488 og 405/638 nm laserpunkter som er romlig adskilt, mens de 405 nm og 638 nm laserpunkter som er ko-lineære. For hver enkelt partikkel, den spektrale FCM måler opp til 66 kanaler med fluorescens data som er eksitert ved 405 nm og 488 nm lasere. Når celler blir eksitert av 638 nm laser, måler den spektrale FCM 58 kanaler med fluorescens dataene fordi en maske er satt inn for å hindre at 638 nm laser fra skinner inn i PMT. Spektral FCM analyserer de innsamlede fulle spektrumdata med en algoritme basert på den vektede minste kvadraters metode (WLSM), som muliggjør separering av overlappende fluorescerende spektra. Spektra utledet fra enkelt-fargede og ufargede prøvene er anerkjent som den grunnleggende referanse-spektra. Multi-fargede prøver blir matematisk montert ennd ublandet, og spektret av en prøve med blandede fluorescerende markører er dekomponert i en samling av dets bestanddeler spektra. Den unmixing, i spektral teknologi 3, 4, erstatter den kompensasjon som fjerner signaler fra alle detektorene unntatt ett måling av et gitt fargestoff.
I denne studien vi kombinert og prøvet 19 fluorokromer i en enkelt, 21-parameteranalyse som karakteriseres de store hematopoietiske undergrupper som finnes i musemilt. I tillegg demonstrerte vi at den spektrale cytometri kan styre auto fluorescerende signal, og dermed forbedre karakteriseringen av intestinale epitelceller intra-lymfocytter og av embryonale hjertet. Faktisk, i disse vev, auto-fluorescens styring tillatt for tildeling av spesifikk fluorescens for cellene som vil bli ekskludert fra analysen på konvensjonell FCM.
Protocol
Representative Results
Discussion
Konvensjonell FCM er basert på detektering av fotoner som utsendes etter eksitasjon av fluorescerende prober. Fluorescensemisjonen fra én fluorkrom detektert i en detektor som er utformet for å måle signalet fra en annen fluorokrom induserer fysiske overlapping. Dette ringvirkninger blant emisjonsspekter må korrigeres av kompensasjoner.
Spektral FCM og databehandling ved unmixing dekonvolveringen algoritme muliggjør en kombinasjon av fluorokromer med tett utslippstopper uten ytterliger…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi erkjenner de tekniske og teoretiske bidrag i spektral cytometri av K. Futamura, som også kritisk revidert manuskriptet. Vi er også i gjeld til C. Ait-Mansour, P.-H. Commere, A. Bandeira, og P. Pereira for kritisk lesing av manuskriptet og for endeløs teknisk rådgivning og støtte. Vi takker også P. Pereira for gaven av anti Vγ7-APC og Vδ4-Biotin merkede antistoffer. Vi aknowledge Centre d'Enseignements fra Pasteur Institute for innbydende og støtte filming logistikk. Dette arbeidet ble støttet av Pasteur-instituttet, Institut National de la Santé et de la Recherche MEDICALE (INSERM); Swiss National Science Foundation og Pasteur Bourse Roux (SS); Fundação para en Ciencia ea Tecnologia – SFRH / BD / 74218/2010 (MV); og Université Paris Diderot, Agence Nationale de la Recherche (ANR) prosjekt Twothyme, ANR, og Program GJENOPPLIVE (investering for fremtiden) (AC).
Materials
| Mice | Janvier Labs | CD45.2 | Source of cells |
| Ethanol 70% | VWR | 83801.36 | Sterilization |
| DPBS (Ca2+, Mg2+) | GIBCO ThermoFisher | 14040-174 | Embryos collection |
| Hanks' Balanced Salt Solution (+Ca2+ +Mg2+) (HBSS+/+) | GIBCO Life ThermoFisher | 14025092 | Dissociation, digestion and staining solutions |
| Hanks' Balanced Salt Solution (-Ca2+, -Mg2+) (HBSS-/-) | GIBCO Life ThermoFisher | 14175095 | Dissociation, digestion and staining solutions |
| Fetal calf serum (FCS) | EUROBIO | CVFSVF00-0U | Dissociation, digestion and staining solutions |
| Collagenase | Sigma | C2139 | Enzymatic solution |
| 90 x 15 mm, plastic tissue culture Petri dishes. |
TPP | T93100 | Embryos and hearts collection |
| 35 x 15 mm, plastic tissue culture Petri dishes. |
TPP | T9340 | Hearts collection |
| Fine iris scissor | Fine Science Tools | 14090-09 | Dissection tools |
| Gross forceps (narrow pattern forceps, curved 12 cm | Fine Science Tools | 11003-12 | Dissection tools |
| Fine forceps (Dumont no. 7 forceps, | Fine Science Tools | 11272-30 | Dissection tools |
| Scalpel | VWR | 21909-668 | Dissection tools |
| LEICA MZ6 Dissection microscope | LEICA | MZ6 10445111 | Sampling; Occular W-Pl10x/23 |
| Cold lamp source | SCHOTT VWR | KL1500 compact | Sampling; Two goose neck fibers adapted |
| FACS tubes | VWR | 60819-310 | Digesting cells |
| 96 well plate (round bottom) | VWR | 10861-564 | Staining cells |
| Nylon mesh bolting cloth sterilized, 50/50 mm pieces. |
SEFAR NITEX | SEFAR NITEX | Cell filtration |
| UltrasComp eBeads | |||
| Fluorescence labeled antibodies | Biolegend | Catalogue number see table below | Staining cells |
References
- Futamura, K., et al. Novel full-spectral flow cytometry with multiple spectrally-adjacent fluorescent proteins and fluorochromes and visualization of in vivo cellular movement. Cytometry A. 87 (9), 830-842 (2015).
- Schmutz, S., Valente, M., Cumano, A., Novault, S. Spectral Cytometry Has Unique Properties Allowing Multicolor Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues. PLoS One. 11 (8), e0159961 (2016).
- Roederer, M. Multiparameter FACS analysis. Curr Protoc Immunol. , (2002).
- Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system. Nat Rev Immunol. 4 (8), 648-655 (2004).
- Grigoriadou, K., Boucontet, L., Pereira, P. T cell receptor-gamma allele-specific selection of V gamma 1/V delta 4 cells in the intestinal epithelium. J Immunol. 169 (7), 3736-3743 (2002).
- Guy-Grand, D., et al. Origin, trafficking, and intraepithelial fate of gut-tropic T cells. J Exp Med. 210 (9), 1839-1854 (2013).
- Lavoinne, A., Cauliez, B. [Cardiac troponin I and T: specific biomarkers of cardiomyocyte]. Rev Med Interne. 25 (2), 115-123 (2004).
- Staudt, D. W., Liu, J., Thorn, K. S., Stuurman, N., Liebling, M., Stainier, D. Y. High-resolution imaging of cardiomyocyte behavior reveals two distinct steps in ventricular trabeculation. Development. 141 (3), 585-593 (2014).
- Beltrami, A. P., et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration. Cell. 114 (6), 763-776 (2003).
- Keith, M. C., Bolli, R. “String theory” of c-kit(pos) cardiac cells: a new paradigm regarding the nature of these cells that may reconcile apparently discrepant results. Circ Res. 116 (7), 1216-1230 (2015).
- Valente, M., Nascimento, D. S., Cumano, A., Pinto-do-Ó, P. Sca-1+ cardiac progenitor cells and heart-making: a critical synopsis. Stem Cells Dev. 23 (19), 2263-2273 (2014).
