Summary
Questa procedura descrive come avviare rapidamente, estendere e collegare neuriti organizzati in camere microfluidiche utilizzando perline poli-D-lisina fissate a micropipette che guidano l'allungamento del neurite.
Abstract
La lesione del cervello e del midollo spinale può portare a disabilità permanente e alla morte perché non è ancora possibile rigenerare i neuroni per lunghe distanze e ricollegarle con un bersaglio adeguato. Qui viene descritta una procedura per iniziare, allungare e collegare rapidamente nuovi circuiti neuronali funzionali a lunghe distanze. I tassi di estensione raggiunti raggiungono oltre 1,2 mm / h, 30-60 volte più velocemente rispetto ai tassi in vivo degli assoni in crescita più veloci del sistema nervoso periferico (0,02 a 0,04 mm / h) 28 e 10 volte più veloci di quanto riportato in precedenza per gli stessi Tipo neuronale in una fase precedente dello sviluppo 4 . In primo luogo, le popolazioni isolate di neuroni ippocampali del ratto vengono coltivate per 2-3 settimane in dispositivi microfluidici per posizionare le cellule in modo preciso, consentendo una facile micromanipolazione e una riproducibilità sperimentale. Successivamente, le perle ricoperte di poli-D-lisina (PDL) vengono poste sulle neurite per formare cont. AdesiveGli atti e la micromanipolazione pipettata vengono utilizzati per spostare il complesso bead-neurite risultante. Mentre il tallone viene spostato, estrae un nuovo neurite che può essere esteso su centinaia di micrometri e collegato funzionalmente a una cellula bersaglio in meno di 1 h. Questo processo consente la riproducibilità sperimentale e la facilità di manipolazione, escludendo strategie chimiche più lente per indurre la crescita del neurite. Le misure preliminari presentate qui dimostrano un tasso di crescita neuronale molto superiore a quelle fisiologiche. Combinando queste innovazioni permette la precisa creazione di reti neuronali nella cultura con un grado di controllo senza precedenti. È un metodo nuovo che apre la porta ad una pletora di informazioni e approfondimenti sulla trasmissione del segnale e sulla comunicazione all'interno della rete neuronale, nonché come un parco giochi in cui esplorare i limiti della crescita neuronale. Le potenziali applicazioni e gli esperimenti sono diffusi con implicazioni dirette per terapie che mirano a ricollegare la neuronaL circuiti dopo trauma o in malattie neurodegenerative.
Introduction
Le lesioni al sistema nervoso centrale adulto (CNS) possono portare a disabilità permanente a causa di meccanismi multipli che limitano la ricrescita assonale 1 . Dopo l'infortunio, molti assoni CNS non formano un nuovo cono di crescita e non riescono a montare una risposta efficace rigenerativa 2 . Inoltre, i danni e il tessuto delle cicatrici che circondano lesioni del CNS inibiscono significativamente la crescita axonica 1 , 2 , 3 . Le terapie correnti per promuovere la rigenerazione del SNC dopo lesioni sono state focalizzate sul miglioramento del potenziale di crescita intrinseco del neurone danneggiato e sulla mascheratura degli inibitori dell'estensione assonica associata a detriti di mielina e la cicatrice gliale 1 , 3 . Nonostante ciò la capacità di rigenerare gli assi lunghi a obiettivi lontani e di formare appropriate sinapsi funzionali rimane gravemente limitata 4 , 5 , 6 , 7 .
Nell'attuale lavoro, microbeads, micromanipolazione pipettata e dispositivi microfluidici vengono utilizzati per avviare, allungare e collegare rapidamente nuovi circuiti neuronali funzionali a lunghe distanze. Precedenti lavori hanno dimostrato che le perline ricoperte da poli-D-lisina inducono l'adesione della membrana seguita dal clustering dei complessi di vescicole sinaptici e la formazione di bouton presinaptici funzionali 8 . È stato inoltre dimostrato che quando il PDL-bead viene tirato meccanicamente dopo la differenziazione presinaptica, il cluster proteico sinaptico segue il branco, innescando un nuovo neurite 9 . La seguente procedura sfrutta questo fatto insieme alla capacità di coltivare i neuroni ippocampali embrionali di ratti in regioni organizzate su una copertura con dispositivi microfluidici polidimetilsilossano (PDMS) per ricreare con precisione un neuronecircuito.
Questi dispositivi microfluidici PDMS sono non tossici, otticamente trasparenti e sono costituiti da due camere collegate da un sistema di microchannel. Una volta assemblati su una copertura, ogni apparecchio serve come uno stampo per guidare la crescita neuronale e mantenere sani le culture neuronali su modelli precisi per più di 4 settimane in vitro .
Qui viene presentato un quadro per studiare i limiti di estensione e funzionalità del nuovo neurite. Nuove funzionalità neurite vengono create e posizionate per controllare (re) le reti neuronali. I tassi di estensione raggiunti sono più veloci di 20 μm / min su distanze di millimetro e sono stabilite le connessioni funzionali. Questi risultati mostrano inaspettatamente che la capacità intrinseca di queste neuriti per allungamento è molto più veloce di quanto precedentemente pensato. Questo approccio meccanico proposto supera strategie chimiche lente e consente la connessione controllata ad un target specifico. thÈ la tecnica apre nuove vie per lo studio in vitro di nuove terapie per ripristinare la connettività neuronale dopo il danno. Permette inoltre la manipolazione e il riavvolgimento delle reti neuronali per indagare aspetti fondamentali dell'elaborazione dei segnali neuronali e della funzione neuronale in vitro .
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Protocol
Tutte le procedure descritte di seguito sono state approvate dalla McGill University Animal Care Committee e sono conformi alle linee guida del Consiglio canadese di Animal Care.
1. Standardizzazione delle culture neuronali usando dispositivi microfluidici: Assemblaggio di apparecchiature
- Selezionare un dispositivo microfluidico adatto per l'esperimento desiderato. Per collegare i neuroni all'interno della stessa popolazione, utilizzare i Neuro Devices ( Figura 1 ) e collegare i neuroni in diverse popolazioni usa i dispositivi Co-Cultura ( Figura 6 ).
- Pulire e preparare il numero desiderato di coperchietti sterili o piatti di fondo in vetro. Per ottenere risultati ottimali sulle superfici di plastica utilizzare piatti da 35 mm, su vetri da 25 mm, oppure da piatti di fondo da 35 mm. Selezionare lo spessore del vetro basato sul sistema di imaging, ad esempio 0,15 mm.
- Cappare i piatti o le copertine con 0,5-1 ml di 100 μg / mL PDL per 2 ore o durante la notte a temperatura ambienteature.
Nota: il protocollo può essere interrotto qui e ripreso il giorno successivo, se lo si desidera. Inoltre, i piatti possono essere rivestiti con PDL diluito in borato, PolyL-Lysine (PLL), laminina o qualsiasi altra molecola di adesione cellulare. - Lavare i piatti due volte con acqua (non utilizzare saline fosforato-tamponato (PBS) in quanto i cristalli salini possono bloccare i canali), rimuovere tutto il liquido e lasciarlo asciugare in un ambiente sterile come un armadio per la biosicurezza per 5-10 minuti o fino a La superficie è completamente asciutta.
Nota: Fare attenzione a garantire che le copertine siano assolutamente asciutte, poiché qualsiasi liquido residuo interferisce con l'adesione dei sistemi microfluidici. - Posizionare i dispositivi microfluidici con i modelli rivolti verso l'alto sotto la luce UV in un ambiente sterile (armadio di biosicurezza) per 10 min. Assicurarsi di seguire le procedure sterili quando si lavora nell'armadio della biosicurezza 10 .
- Usando le pinzette mettere un dispositivo microfluidico con il modello rivolto verso il basso in contatto con i coperchi pulitiip / piatto. Utilizzare le pinzette per premere dolcemente il dispositivo in modo che aderisca al vetro.
Nota: la trasparenza della regione aderente sarà visibile quando si guarda contro la luce. Assicurarsi che tutti gli angoli stiano contattando il vetro. Fai questo a tutti i dispositivi microfluidici. Vedere la Figura 1a . - Per riempire il dispositivo della singola popolazione con il mezzo, puntare la pipetta verso i canali e aggiungere 50 μl di mezzo completo di cellule integrati con B-27 privo di sieri (rapporto di volume 1:50) e 500 μg / mL di penicillina / streptomicina / glutamina Chiamato NBM) al pozzo superiore destro e quindi aggiungere un altro 50 μL al pozzetto che si trova diagonalmente ad esso. Fai questo per tutti i dispositivi, assicurandoti che il mezzo scorre tra pozzetti. Successivamente, aggiungere 50 μL di mezzo ai restanti 2 pozzetti. Vedere la Figura 2a .
- Per riempire il dispositivo multiplo di popolazione con il mezzo, puntare la pipetta verso i canali e aggiungere 30 μLDella NBM completa ai pozzetti di destra, fare riferimento alla Figura 6a . Fai questo per tutti i dispositivi, assicurandoti che il mezzo scorre tra pozzetti. Successivamente, aggiungere 50 μL di mezzo ai restanti 4 pozzetti.
- Posizionare i dispositivi in una piastra più grande con un piatto aperto con acqua autoclave (camera bagnata) e collocare nell'incubatrice (37 ° C, 5% CO 2 e 95% di umidità) per 1-2 h durante la preparazione della coltura cellulare. Vedere la Figura 2b .
2. Neuroni di placcatura nei sistemi microfluidici
- Seguendo il protocollo delineato in Rif. 8 , ottenere neuroni ippocampali dissociati o corticali da embrioni di ratto di Sprague Dawley (entrambi i sessi).
- Resuspendere i neuroni embrionali in NBM a una concentrazione di 1-2 milioni di neuroni / ml. Verificare le concentrazioni di cellule nel microscopio usando un emocitometro e seguendo il riferimento 8 . Regolare la concentrazione della concentrazione cellulareG alla densità cellulare desiderata. Per aumentare le probabilità di ottenere singoli assi ippocampali per canale, piastra 10.000 neuroni per dispositivo. Per avere più assoni nello stesso canale, inserire 60.000 neuroni per dispositivo.
Nota: Questi numeri variano in funzione del tipo neuronale utilizzato. - Rimuovere il mezzo dai dispositivi microfluidici senza svuotare i pozzetti. Lasciare circa 5 μL in ciascuno.
- Per piastrare le celle nel dispositivo della popolazione singola, aggiungere 50 μL di NBM al pozzo inferiore destro. A questo punto il mezzo scorre da solo per riempire l'altro pozzo inferiore. Aggiungere 20 μL della soluzione di cellule concentrate nel pozzo superiore destro del dispositivo microfluidico, come indicato in figura 1b .
- Per piastrare le cellule nel dispositivo multiplo della popolazione aggiungere 20 μL della soluzione di cellule concentrate in ciascuno dei pozzetti di destra nella figura 6a .
- Controllare nel microscopio se le celleSono all'interno delle camere e collocano i dispositivi nell'incubatrice per 15-30 minuti per promuovere l'attaccamento cellulare al substrato.
- Controllare il microscopio se ci sono celle sufficienti nelle camere. Se sono necessari ulteriori, ripetere i passaggi 2.4 e 2.5.
- Aggiungere 50 μL di NBM ai 2 pozzetti superiori del dispositivo di popolazione singola e 20 μL di NBM nello stesso pozzetto in cui le cellule sono state iniettate nel dispositivo multiplo della popolazione. I supporti si sporgono leggermente per formare un menisco positivo, dando ai pozzetti un aspetto superiore della muffin. Ancora una volta, vedere la Figura 2a .
- Mantenere le cellule a 37 ° C, 5% CO 2 e 95% di umidità.
3. Manutenzione delle culture neuronali
- Rimuovere NBM (circa 30 μL con una pipetta) dalle cellule e applicare il nuovo NBM preriscaldato il giorno successivo alla loro introduzione ai dispositivi (cioè 1 d dopo il passo 2).
- Controllare ogni 2 giorni se c'è sufficiente mezzo in ogni canale. Se il muffin tOp è basso basta aggiungere più medio ai pozzi superiori.
- Coltivare le cellule per almeno 7 giorni prima della rimozione dei dispositivi microfluidici. Le cellule possono sopravvivere in questi dispositivi per diverse settimane. Rimuovere i dispositivi 1-2 giorni prima che gli esperimenti siano eseguiti sui campioni.
4. Rimozione dei dispositivi microfluidici
- 1 - 2 d prima della rimozione dei dispositivi microfluidici, aggiungere 2 mL di NBM preriscaldati a 37 ° C ad ogni piatto di campione, inondando le camere e mantenere i dispositivi nell'incubatrice.
- Utilizzare pinzette sterili e una punta per rimuovere i dispositivi microfluidici dai coperchi lasciando una configurazione di neuroni modellata. Utilizzare la punta per tenere la copertura in posizione e le pinzette per chiudere il bordo del dispositivo nell'angolo inferiore sinistro del pozzetto. Applicare delicatamente la torsione, sollevando il dispositivo con le pinzette in modo da sbucciare la copertura. Vedere la Figura 2c - 2d .
- Ogni 2-3 giorni, sostituire l'haSe la NBM finché il campione non viene utilizzato per gli esperimenti.
- Prima di eseguire esperimenti di riavvolgimento sul campione, verificare che le neurite nei singoli canali di popolazione e le popolazioni neuronali nel dispositivo multiplo della popolazione siano isolate esaminando le lacune tra di loro nel microscopio per assicurare che non ci siano filamenti che collegano le popolazioni neuronali.
5. Preparazione dei branelli rivestiti in PDL
- Aggiungere 2 gocce di 50 μl di branelli in polistirene di 4, 10 o 20 μm diluiti in acqua (1: 500) a 1 ml di PDL (100 μg / ml). Lasciare almeno 2 ore a temperatura ambiente.
Nota: il protocollo può essere interrotto qui e ripreso il giorno successivo. - Centrifugare la soluzione a 8.820 xg per 1 min. Rimuovere con cautela il surnatante senza disturbare le perle accumulate in fondo al contenitore.
- Lavare le perle due volte con 1 ml di soluzione sterile 10 mM HEPES pH 8.4.
- Resuspendere le perle rivestite con PDL in 200 mL di 10 mM HEPES pH 8.4soluzione.
6. Preparazione delle micropipette
- Preparare pipette provenienti da tubi capillari di vetro (diametro interno di 1 mm, diametro esterno di 1,5 mm) utilizzando un estrattore elettrodo orizzontale. Regolare le impostazioni in modo che la punta esterna della micropipetta tirata sia di ~ 2-5 μm. Prima di tirare, assicurarsi che i tubi di vetro siano puliti.
- Fissare le pipette alle vetrate di vetro per essere conservate e assicurarsi che la punta non tocchi la superficie dello scivolo poiché la punta è fragile. Conservare a temperatura ambiente in un contenitore coperto per proteggere dalla polvere. Usare pipette nello stesso giorno in cui vengono tirate.
7. Adesione ai Neuroni di PDL-bead
- Aggiungere 40-60 μL di branelli rivestiti in PDL preparati nel passaggio 5 ad una coltura cellulare preparata nel passaggio 4. Centrare la punta pipetta sopra i neuroni, che sono debolmente visibili sul coperchio e aggiungere le perle (vedi figura 3 ).
- Rimettere il campione all'incubatore per 1 ora per promuovere la formazione dell'occhioContatti naptici 8 , 9 .
- Dopo l'incubazione, rimuovere le perle non aderenti lavando delicatamente la coltura con NBM preriscaldata.
8. Preparazione della soluzione fisiologica salina (per esperimenti sulla temperatura ambiente)
- Preparare la soluzione salina fisiologica combinando gli ingredienti elencati nei riferimenti 7 , 8 . Questo è per regolare l'ambiente cellulare all'esterno dell'incubatore.
- Verificare i livelli di osmolarità e pH come indicato nei riferimenti 7 , 8 .
- Continuare a infondere la soluzione con O 2 per ridurre al minimo le fluttuazioni del pH durante lo svolgimento di esperimenti.
- Riscaldare a temperatura ambiente.
- Impostare il sistema di perfusione inserendo un'estremità di un tubo di plastica (dimensioni opzionali) in soluzione fisiologica iniettata da O 2 e fissando le altreNd ad un ago inserito nel supporto del campione. Mettere il tubo e la soluzione più alti del campione (vedere la Figura 4 ).
- Scollegare il tubo dall'ago e collegarlo ad una siringa. Usare la siringa per esercitare pressione e disegnare liquido, riempiendo il tubo. Sigillare con un morsetto a rulli e ricollegare l'ago.
9. Micromanipolazione di perline
- Installare il campione in una configurazione sperimentale in modo tale che le celle possano essere accessate dall'alto da due micropipette montate in micromanipulatori e accessibili in modo ottico sotto, ad esempio con l'obiettivo a 40 secondi (apertura numerica di 0,6) di un microscopio ottico invertito. In questa configurazione, montare una telecamera CCD per la cattura delle immagini sulla porta laterale del microscopio. Collegare ogni pipetta a 1 ml di siringhe tramite tubo di plastica. A questo punto, sostituire NBM con soluzione salina fisiologica (1-2 mL) (vedi figura 4 ).
- Durante l'esperienza, Continuamente perfusione delle cellule con la soluzione fisiologica salina preparata al punto 8 a una velocità di 0,5-1 ml / min.
- Selezionare un PDL-bead NON collegato ad un neurone nel campo visivo. Allineare la perlina con una punta di micropipetta mettendo a fuoco sul tallone quindi fino alla micropipetta. Portare il puntale giù il più vicino possibile al tallone monitorandolo attraverso il microscopio.
- Applicare una pressione negativa con la siringa da 1 ml collegata alla pipetta per raccogliere il tallone. Mantenere una pressione negativa per tutto l'esperimento.
10. Tirare i Neuriti
- Selezionare un tallone PDL collegato ad un neurone nel campo visivo e collegarlo alla seconda micropipetta usando l'aspirazione come descritto nei passaggi 9.3-9.4.
- Tirare il complesso PDL-bead-neuron lentamente (~ 0,5 μm / min) spostando il micromanipolatore o la fase di campionamento di 1 μm e pausa per 5 minuti per consentire l'iniziazione neurita.
- Ripetere due volte il passaggio 10.2.
Nota: i primi 3 &# 181; m deve essere tirato lentamente per garantire il successo sperimentale, che si verifica oltre il 95% del tempo. - Tirare il complesso PDL-bead-neuron lentamente (~ 0,5 μm / min) spostando il micromanipolatore o la fase di campionamento di 2 μm e pausa per 5 minuti per consentire l'allungamento del neurite.
- Dopo un inizio di successo e l'estensione del neurite per i primi 5 μm, tirare il neurite a 20 μm / min su distanze di millimetro.
Nota: l'estrazione può essere eseguita in modo continuo o in gradini ea diverse velocità. Vedere la Figura 5b -5c .
11. Collegamento dei neuroni
- Selezionare una regione ricca di neuriti e abbassare il complesso PDL-bead-neurite in modo che lo contatti fisicamente. Utilizzare altre perle per misurare l'altezza del punzone sopra la superficie del coperchio. Vedere la Figura 5d .
- Lasciare il complesso PDL-bead-neurite a contatto con il neurite target durante la manipolazione della seconda micropiPette. Abbassare la seconda pipetta con il secondo PDL-bead sulla parte superiore del neurite appena formato, circa 20 μm dal primo bead. Utilizzare il secondo PDL-bead per spingere il nuovo filamento neurite verso la cella di destinazione.
- Tenere entrambe le perle in posizione per almeno 1 h. Verificare l'assenza di gonfiore focale, un ispessimento dei neuriti che contattano il tallone, con il microscopio 16 .
- Durante questo periodo, utilizzare la perfusione per cambiare lentamente il mezzo del campione da salinità fisiologica a NBM precarbonizzato CO 2- equilibrato.
- Rilasciare il tallone dalla seconda pipetta rilasciando l'aspirazione. Se il nuovo neurite rimane attaccato, rilasciare anche il primo tallone. Vedere la Figura 5e .
- Rimuovere delicatamente la soluzione salina e sostituire con NBM (~ 2 mL).
- Riposizionare con cautela il campione nell'incubatrice per rafforzare la connessione neuronale per i prossimi esperimenti. Questa connessione è stabile per> 24 h 7
12. Verifica della funzionalità della nuova connessione mediante le registrazioni delle morsetti di patch a coppie intere
- Seguire i riferimenti 7 , 18 , 19 . Per assemblare un set di elettrofisiologia.
- Seguire i riferimenti 7 . Per preparare gli elettrodi pre- e postinaptici.
- Raccogliere i dati della pinzetta delle patch, ripetutamente seguendo i riferimenti 18 , 19 .
- Confronta i risultati con i segnali naturali 7 per determinare il tipo di connessione.
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Representative Results
I neuroni ippocampali del ratto embrionale vengono coltivati in dispositivi microfluidici per consentire un posizionamento preciso di cellule, PDL-perle e micromanipulatori. Il primo passo è quello di montare correttamente il dispositivo microfluidico su una copertura o un piatto di vetro. È essenziale che il dispositivo microfluidico sia ben attaccato al substrato per evitare che le cellule esca dalle camere e che si muovano sotto le parti del dispositivo che dovrebbero essere sigillate ( Figura 1a ). Per mantenere culture sane per diverse settimane, è importante evitare l'evaporazione media controllando il mezzo cellulare ogni 2-3 giorni e conservando un menisco positivo di mezzo ( Figura 2a ). Evita anche l'evaporazione media mantenendo le due celle e un piatto aperto d'acqua all'interno di una piastra più grande ( Figura 2b ). I dispositivi microfluidici possono essere rimossi in qualsiasi momento. Per risultati ottimali, NBM dovrebbe essere aggiunto alla cell-deVice sistema almeno 1 d prima della rimozione del dispositivo. Ciò minimizza lo stress cellulare poiché i neuroni sono in contatto con il mezzo a temperatura e pH ideali quando i dispositivi vengono rimossi. Quando i dispositivi microfluidici vengono lentamente sbucciati dal piatto ( Figura 2c E 2d ) rimangono nella posizione modellata ( Figura 3 e Figura 5a ).
Sono utilizzati due tipi di dispositivi microfluidici: Dispositivo Neuro e Dispositivo di Co-Cultura. Il primo consente una facile identificazione di assoni, dendriti e corpi cellulari. La soma rimane nella camera di soma superiore mentre gli assoni e i dendriti crescono lungo i canali microfluidici ( Figura 5a ) verso la camera asonale.
Si raccomanda che le perle PDL siano aggiunte alle cellule ad un rapporto di 10: 1 e che la maggior parte delle perle che haNon aderito alla coltura viene rimosso lavando le cellule una volta con NBM dopo l'incubazione di 1 ora ( Figura 3 ). Dopo l'adesione PDL-bead ai neuriti, il complesso PDL-bead-neurite viene tirato e può essere esteso su grandi distanze. Il neurite appena formato può essere collegato esattamente ai neuriti o ai millimetri di soma ( Figura 5b -5e ). Il tasso di successo per tirare un nuovo neurite per i primi 3 μm a velocità inferiori a 1 μm / min è> 95% (n = 206). Il tasso di successo per il collegamento del nuovo neurite ad un'altra cella è del 70% (n = 30). La connessione è molto fragile nei primi 18 h, soprattutto perché il nuovo neurite è un filamento inferiore a 1 μm di diametro ancorato da un PDL da 10 μm. Se il piatto viene rapidamente spostato durante i primi minuti di contatto, la turbolenza risultante del mezzo può provocare la rotazione del tallone e di conseguenza l'adesione perderà. Tuttavia, se il campione non è shaKen, in 30 minuti la pera si attacca ai neuriti sul piatto e la nuova connessione rimane per almeno 48 h. Vedere la Figura 4 per uno schema del set-up.
La posizione PDL-bead sulla cultura può anche essere utilizzata per identificare facilmente la posizione del neurite collegato ( figure 6d-6e ). Dopo l'iniziazione, l'estensione e la connessione di un nuovo neurite, un secondo, non attaccato PDL-branco raccolto attraverso il micromanipulator, viene utilizzato per creare un secondo sito di adesione tra il neurite iniziato e la seconda popolazione neuronale. Il secondo PDL-bead è posto sulla parte superiore del nuovo neurite, compresso così che il nuovo neurite appena contatta la seconda popolazione neuronale 11 . Questo promuoverà l'adesione con la seconda popolazione neuronale ( Figura 5f ).
Il dispositivo multiplo di popolazione enabLa crescita di 4 popolazioni neuronali isolate sul medesimo piatto. Ogni popolazione neuronale è limitata ad un rettangolo da 4 x 7 mm separato da altre popolazioni neuronali da una distanza di 100 o 200 μm ( Figura 6a ). Neuroni sani possono crescere all'interno dei dispositivi per diverse settimane. Di solito, le popolazioni neuronali rimangono isolate fino a 48 ore dopo la rimozione del dispositivo. Dopo questo periodo di 48 ore, i neuroni tendono a crescere verso le popolazioni neuronali vicine e formano connessioni naturali. Prima di collegare due popolazioni isolate, bisogna verificare che le popolazioni sono veramente isolate esaminando l'intero intervallo con il microscopio per stabilire che non esiste alcun legame tra le due popolazioni neuronali ( Figura 6b ).
Dopo la connessione, i campioni sono stati incubati per 24 ore e sono state condotte registrazioni a morsetto patch patch elettriche intere per verificare se le nuoveNeurite formato per collegare due popolazioni neuronali isolate era funzionale e in grado di trasmettere segnali elettrici. Un neurone nella popolazione uno, situato meno di 100 μm dal luogo in cui è stato avviato il neurite indotto, è stato scelto per registrare potenziali di azione presinaptica (PAPs). Questo neurone è stato considerato la cellula presinaptica. L'attività eccitatoria o inibitoria postinaptica è stata registrata da un neurone in popolazione due, dall'altro lato del divario, situato in raggio inferiore a 100 μm della connessione micromanipulata ( Figura 7a -7c ). Le registrazioni derivate dai collegamenti meccanicamente indotte sono state analizzate e confrontate con quelle di popolazioni neuronali e popolazioni non collegate naturalmente ( Figura 7 ). Le risposte elettriche dopo il PAP registrate da neuroni collegati naturalmente e da micromanipolazione sono significativamente più elevati e temporalmente correlati con il presinapticoAttività ( Figura 7 ).
Figura 1: Standardizzazione delle culture neuronali usando dispositivi microfluidici 7 . ( A ) Assemblaggio del dispositivo: quando i dispositivi microfluidici sono montati correttamente su una superficie asciutta, tutte le camere sono visibili. ( B ) Plating: piastra le cellule in alto a destra e le cellule dovrebbero spostarsi verso il pozzetto sinistro. (D) Densità delle cellule: subito dopo la placcatura, controllare nel microscopio se la concentrazione delle cellule è adeguata. ( D ) Dopo 1 d in coltura, i neuroni ippocampali sono ben aderiti vicino ai microchanneli e iniziano a formare neuriti. Clicca qui per vedere un largo Er di questa figura.
Figura 2 : Manutenzione di culture neuronali sane per diverse settimane 7 . ( A ) Aggiungere ogni 2-3 d di media e mantenere un menisco positivo nei pozzetti superiori delle camere microfluidiche, in modo che le cellule avranno un'alimentazione costante di sostanze nutritive. B ) Tenere le celle all'interno di una piastra più grande con un piatto contenente acqua per ridurre l'evaporazione media. ( C ) Utilizzare punta e pinzette sterili per ( d ) scaricare facilmente le microelettroniche. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Figura 3 : Posizione delle pipette che depositano branelli nelle culture. Una volta rimosso il dispositivo microfluidico, i neuroni sono visibili sul coperchio. Quando si deposita le perle, posizionare la punta della pipetta in modo che sia al centro delle celle. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Schema di una tipica impostazione del tirare neuriti. Il campione poggia su uno stadio (piezoattivo) ed è accessibile dall'alto da 2 micropipette tenute in micromanipulatori e collegate a 1 ml di siringhe tramite tubi di plastica. Il campione è accessibile in modo ottico dal basso da un obiettivo collegato a una telecamera CCD che inviaImmagini in una CPU. Un tubo di entrata alimenta una soluzione salina fisiologica ossigenata al campione che poggia al di sotto e un tubo di uscita collegato ad una siringa consente il ritiro della soluzione in caso di overflow. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 : adesione PDL-bead ai neuroni e micromanipolazione pipettata 7 . ( A ) I neuroni rimangono organizzati in modelli dopo la rimozione delle camere microfluidiche che consentono una facile identificazione di soma e neuriti. ( B ) Micromanipulazione di brani PDL aderenti ai neuriti consente l'iniziazione neurite, l'estensione ( c ) e la connessione ( d ),Seguito dal rilascio del PDL-bead dalla pipetta ( e ). ( F ) Dopo aver contattato due popolazioni neuronali isolate (freccia inferiore), viene utilizzato un secondo micromanipolatore PDL e pipetta (freccia superiore) per stabilire un secondo punto di adesione, a poche centinaia di micron a partire dal primo punto di contatto e garantire funzionalità connessioni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6 . Iniziazione, allungamento e connessione di nuovi neuriti per connettere due popolazioni isolate utilizzando dispositivi multipli di popolazione e micromanipolazione 7 . ( A ) Il dispositivo elimina 4 popolazioni neuronaliTra 3 distanze di 100 o 200 μm ciascuna. ( B ) Dopo la rimozione del dispositivo, selezionare un vuoto e certificare che nessun neurite collega le due singole popolazioni. C ) Schema della configurazione sperimentale come dovrebbe essere visibile nel microscopio ottico, indica la posizione di due micropipette e la presenza di branelli rivestiti in PDL. ( D ) Applicando una pressione negativa a una pipetta, un PDL-bead aderito ad una popolazione neuronale viene tirato con la punta della pipetta, iniziando così un nuovo neurite. Tenendo la pressione negativa nella pipetta, il complesso PDL-bead-neurite (verde) può essere tirato, allungando il neurite. ( E ) La micromanipolazione della pipetta guida l'estensione del nuovo neurite sul divario e la formazione di un collegamento con una nuova popolazione neuronale. Per assicurare l'adesione del nuovo neurite alla seconda popolazione, un PDL-bead (rosso) è posizionato con una seconda pipetta sopra sia neurite e neuroLa popolazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Il neurito appena indotto, allungato e connesso può trasferire informazioni tra due popolazioni neuronali isolate 7 . Le popolazioni neuronali isolate sono state coltivate separate da un gap di 100 μm nei microdevizi PDMS. Le registrazioni a morsetto di patch sono state eseguite in configurazione di cellule intere da un neurone nella popolazione uno e un neurone nella popolazione due (dall'altro lato del divario) quando le due popolazioni sono state collegate tramite manipolazione meccanica ( a ), consentite di interconnettere naturalmente Gap ( b ) o rimanere non collegati da maintIl divario ( c ). Per ciascuna condizione ( df ) vengono mostrate tracce rappresentative di registrazioni accoppiate. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Grazie alla micromanipolazione standard e ai dispositivi innovativi microfluidici, è stata sviluppata una nuova tecnica per avviare, allungare e collegare rapidamente nuovi circuiti neuronali funzionali a grandi distanze. La micromanipolazione della pipetta è uno strumento comune nella maggior parte dei laboratori neuroscienze 4 , 13 . La vera sfida per ottenere risultati riproducibili e affidabili è stata la standardizzazione di culture neuronali sane e posizionate per tutta la durata dell'esperimento (che può essere sull'ordine delle settimane) attraverso lo sviluppo di dispositivi microfluidici per organizzare le colture cellulari con precisione micrometrica. Le culture cellulari di alta qualità sono la pietra angolare della convalida dei dati. Ciò contribuisce a un'immagine più semplice e veloce della microscopia e alla standardizzazione delle culture e dei risultati. I dispositivi microfluidici sono stati progettati per coltivare le cellule in vitro con organizzazione simile in vivo . Il dispositivo di popolazione singola abilitaLa crescita di neuriti lunghi e la facile identificazione di assoni, neuriti e soma. Il numero di cellule placcate nelle camere microfluidiche determina la densità neuronale. Pertanto, placcando meno celle per dispositivo è facile identificare singoli neuroni vicini ai canali. L'assone e più dendriti di un solo neurone crescono all'interno di un canale. I dendriti crescono almeno 5 volte più lenti degli assoni 6 , 17 e dopo 2-3 settimane in vitro la loro crescita nei canali è di solito limitata a 200 μm mentre gli assoni in rapida crescita possono raggiungere oltre 2 mm 17 . Pertanto, dopo l'aggiunta di brani PDL ai campioni, è relativamente facile valutare se le perle stanno aderendo principalmente ad assoni o ad assoni e dendriti ( Figura 5b - 5f ). Ci sono maggiori probabilità di tirare nuovi assoni e dendriti quando tirando i PDL-perle attaccati a neuriti inferiori a 200 μm, whCi sono maggiori probabilità di tirare solo nuovi assoni quando tirando PDL perline attaccate ai neuriti più lunghi di 500 μm. Il dispositivo multiplo della popolazione è utile per la crescita riproducibile di popolazioni sane separate per diverse settimane. Questo sistema di canali è utile per studiare fino a 4 tipi di cellule differenti o confrontare le stesse cellule con diversi trattamenti.
Inoltre, un ambiente di coltura cellulare controllato e riproducibile fornisce un quadro ideale per l'analisi e la manipolazione delle cellule. Il preciso posizionamento delle celle su un piatto agevola l'identificazione delle regioni di interesse, nonché l'orientamento e la navigazione attraverso questi settori di interesse, consentendo in ultima analisi un controllo senza precedenti sul sito di iniziazione neurite. Una distribuzione di celle controllate rende più facile visualizzare la connessione appena formata e molto più veloce per trovare la nuova connessione con il microscopio nei giorni successivi all'incubazione. Inoltre, configurazioni riproducibili di celluleConsentono il posizionamento facile e preciso di segnali chimici, come le perle rivestite in PDL, sul soma, sui dendriti o sugli assoni 8 . Considerati insieme, l'analisi e l'analisi delle cellule coltivate in dispositivi microfluidiche sono più veloci a causa dell'organizzazione cellulare standard riprodotta in tutti i piatti. Inoltre, i dispositivi sono realizzati in materiale biocompatibile, trasparente e rimovibile, consentendo l'acquisizione di immagini a tutte le lunghezze d'onda visibili e la sopravvivenza delle cellule all'interno dei dispositivi per diverse settimane. La miniaturizzazione dei dosaggi cellulari aiuta anche a raccogliere più dati con meno celle. Il basso consumo dei dispositivi microfluidici riduce il numero di cellule necessarie per ogni esperimento e aumenta l'efficacia sperimentale. Ad esempio, invece di passare parecchie ore di ricerca con un microscopio per forse 1 o 2 assoni isolati in un piatto, il dispositivo di singola popolazione può essere utilizzato per accedere immediatamente a 100 assoni isolati per campione di cellule. I dispositivi microfluidici offrono una miniaturizzazione affidabile e controllataAmbiente di coltura cellulare favorendo l'analisi di campioni rari con il tempo per eseguire test multipli.
Le variazioni potenziali della tecnica implicano l'attacco diretto del tallone alla micropipetta. Nel protocollo attuale, viene descritto un metodo per attaccare il tallone alla punta attraverso l'aspirazione, ma il tallone può anche essere incollato alla punta. La colla è l'opzione migliore se è desiderabile una connessione altamente stabile tra la punta e il tallone, ad esempio se si effettuano misure di forza utilizzando la pipetta come sensore o se l'indagine di adesione tra PDL e neurite è l'obiettivo sperimentale principale. In un'altra vena, l'aspirazione è vantaggiosa in quanto consente il rilascio del tallone dopo il posizionamento senza interrompere il complesso di neurite, permettendo in tal modo diverse connessioni in parallelo. L'aspirazione fornisce mezzi per esperimenti di ricarica ad elevata produttività, un miglioramento rispetto ad altre tecniche di manipolazione come la microscopia a forza atomica (AFM) 7 </ Sup> , 16 . Entrambe le modifiche di questo metodo permettono di selezionare il sito di iniziazione neurita semplicemente mantenendo un branco a contatto con un dendrite, così si formano sinapsi. Tuttavia, la strategia di incubare diversi brani come descritto nel passaggio 7 consente di risparmiare tempo allo stadio di manipolazione e si raccomanda se il controllo preciso sul sito di iniziazione non è necessario nell'esperimento.
La ricerca futura potrebbe cercare di affrontare varie limitazioni strumentali, vale a dire il controllo della temperatura e l'accessibilità dei campioni. Le proprietà meccaniche della membrana cellulare possono variare sensibilmente a diverse temperature 27 . Idealmente tutti gli esperimenti dovrebbero essere eseguiti a 37 ° C nel mezzo neuronale e condizioni adeguate (corretti controlli di CO 2 e di umidità). Tuttavia non è stato possibile utilizzare un incubatore di cellule chiuse perché l'accesso ai campioni dall'alto è necessario per i micromanipulatori,Fondo per il microscopio e dal lato per spostare lo stadio. Perciò è stata utilizzata la perfusione a temperatura ambiente. In una simile vena, poiché la configurazione ha solo spazio sufficiente per ospitare 2 micromanipulatori e ci vogliono quasi 1 ora per stabilire una singola connessione, esiste un limite al numero di esperimenti che si possono eseguire. Questo problema potrebbe essere affrontato con un manipolatore che tira più di una perlina alla volta. Un altro potenziale miglioramento di questo protocollo è la capacità di registrare l'altezza del complesso di bead-pipette dalla superficie del campione. L'incapacità di farlo può portare a imprecisioni quando si abbassa il secondo bead e la mette sul neurite indotto per risolverlo. Il tallone viene abbassato in cima al nuovo neurite in una regione ricca di neuriti fino a quando il nuovo neurite e quelli sul piatto si trovano nello stesso piano focale. Il nuovo neurite non è mai tra il tallone e il piatto, ma sempre tra un cuscino di materia cellulare e il tallone, quindi la compressione è ridotta. Inoltre,Il nuovo neurite viene osservato per 10 minuti nel microscopio per valutare se i gonfiori focali neuriti vengono formati vicino al tallone. Come descritto nel riferimento 16 , la presenza di gonfiori indica la degenerazione neurita. Tuttavia, poiché l'applicazione di varie quantità di pressione agli assi può portare a cambiamenti fisiologici 16 , la ricerca futura potrebbe concentrarsi sull'adattamento delle sonde pipettate fissando riflettori a loro e monitorando lo spostamento perpendicolare alla superficie del campione con i metodi AFM. Infine, forse la sfida più grande a questo protocollo è quella di testare la funzionalità della connessione manipolata. La tecnica più diretta, affidabile e ben consolidata è le registrazioni a morsetto patch a cellule parziali. Tuttavia, il tasso di successo della regolare registrazione di morsetti patch associati è molto basso (<25%) 18 . Il morsetto di patch a cellule intere presenta diversi svantaggi, tra cui il tempo di installazione lungo, il numero limitato di esperimenti al giorno, il tempo di registrazione limitato (~ 30Min), scarsa resa sperimentale per le registrazioni a morsetto patch patch e la morte cellulare dopo le misurazioni. A causa di queste sfide tecniche, la resa sperimentale di registrazioni adesive di morsetti di patch a cellule intere dopo micromanipolazione è molto bassa. Sono necessarie migliori piattaforme e tecniche per stimolare, registrare e confrontare più precisamente l'attività neuronale in connessioni naturali e micromanipulate.
L'importanza della tensione nella crescita axonica è stata conosciuta sin dai primi giorni della neuroanatomia - riferendosi ad esso come stretching passivo 20 . Durante i primi sviluppi embrionali, i neuriti migrano attraverso piccole distanze per raggiungere i loro obiettivi. Come la maggior parte delle cellule divide e duplica, gli assoni sono sottoposti a forze continue per allungare e regolare la loro lunghezza alla crescita embrionale 20 , 21 . Diversi gruppi hanno cercato di testare i limiti della crescita dei neuriti applicando segnali chimici e / o tensioni meccaniche a neuRons (per la revisione vedere il riferimento 22 ). In queste relazioni 23 , 24 , 25 , 26 e durante la crescita fisiologica, le neurite vengono tirate mentre sono attaccate ad un substrato. La differenza principale per la nostra impostazione è che nella presente tecnica i nuovi neuriti hanno solo due contatti di adesione; Alla base il neurite è attaccato al neurone e alla punta il neurite è attaccato al tallone. Durante l'allungamento i componenti del nuovo neurite hanno la libertà di disperdersi nel modo più efficiente per accogliere le forze di tiro. Ancora più importante, questo protocollo descrive come riprodurre questi esperimenti senza causare la rottura o la degenerazione del neurite, basata su studi precedenti sulla formazione di contatti sinaptici 8 e sulla resistenza degli assoni alla pressione 16 che mostra come utilizzare micro- e nanotools aTirare continuamente i neuriti con la forza appropriata. Le velocità di prolungamento neurite qui descritte (1,2 mm / h) sono 30-60 volte più veloci rispetto ai tassi in vivo degli assoni in crescita più veloci del sistema nervoso periferico (0,02 a 0,04 mm / h) 28 . Rispetto allo stesso tipo neuronale in vitro , le velocità di prolungamento assonale qui descritte sono 7,5 volte più veloci rispetto ai tassi di crescita descritti da altri autori in una fase iniziale dello sviluppo (0,1 mm / h) 4 . Sono stati trovati diversi tipi di neuroni per estendere gli assoni a diverse frequenze intrinseche che variano da più volte 29 . Inoltre, gli assoni del sistema nervoso centrale perdono di solito l'elevato tasso di crescita assonale dopo innervazione bersaglio in vivo 29 e 3 d di coltura in vitro 6 . Pertanto, la tecnica di estensione axonal corrente dovrebbe essere testata con diversi tipi di neuroni per capire meglioI limiti dell'estensione del neurite.
Micromanipolazione pipettata e dispositivi microfluidici sono tecniche dimostrate per creare nuove neurite funzionali e per controllare posizionare o (re) reti neuronali. Questa piattaforma è ideale per misure sistematiche e standardizzate. Introduce la riproducibilità e il controllo in vivo in esperimenti su reti complesse di neuroni. I tassi di estensione raggiunti sono più veloci di 20 μm / min su distanze di millimetro e sono stabilite le connessioni funzionali. Questi risultati mostrano inaspettatamente che la capacità intrinseca degli assoni per allungamento, compresi quelli dei loro componenti citoscheletrici, è molto più veloce di quanto precedentemente pensato 10 , 11 , 12 . Questo approccio meccanico proposto supera strategie chimiche lente e rappresenta pertanto un cambiamento di paradigma per gli sviluppi terapeutici per ripristinare la connettività neuronale dopo lesioniE per la micro-neuroinstrumentazione delle reti neurali artificiali per il loro studio controllato in vitro . Questi risultati hanno anche un impatto importante sulla medicina rigenerativa e sugli approcci neuro-ingegneristici con implicazioni dirette per terapie che mirano a ricollegare i circuiti neuronali dopo traumi o malattie neurodegenerative. Questa piattaforma apre la porta per ottenere dati sulla comunicazione di neuroni, sulla modulazione del segnale e sulla crescita e sulla rigenerazione. È un nuovo modo di rigenerare meccanicamente il CNS e tecniche analoghe possono consentire il ripristino della funzione dopo lesioni. Inoltre, questa tecnica può essere usata per creare reti neuronali progettate sistematicamente come nuove piattaforme di bioassay per la scoperta di droga e la convalida di bersagli. È un precursore del cablaggio diretto di robuste interfacce cerebrali-macchina.
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Disclosures
L'autore Margaret H Magdesian è il CEO di Ananda Devices che produce gli strumenti utilizzati in questo articolo.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare Yoichi Miyahara per molte discussioni e approfondimenti utili. MA e PG riconoscono il finanziamento da NSERC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Co-culture devices | Ananda Devices | Commercially available at http://www.anandadevices.com | |
| Neuro devices | Ananda Devices | Commercially available at http://www.anandadevices.com | |
| No. 1 Glass Coverslip 25 mm Round | Warner Instruments | 64-0705 | |
| 35 mm Glass Bottom Dishes #0, Uncoated, Gamma-Irradiated | MatTex Incorporation | P35G-0-20-C | |
| 35 mm cell culture dish, Non-Pyrogenic, Sterile | Corning Inc | 430165 | |
| 95 mm x 15 mm Petri Dish, Slippable Lid, Sterile Polystyrene | Fisherbrand | FB0875714G | |
| 50 mL Centrifuge tubes with printed graduations and flat caps | VWR | 89039-656 | |
| 15 mL Polypropylene Conical Tube, 17 x 120 mm style, Non Pyrogenic, Sterile | Falcon | 352097 | |
| Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103-049 | Extracellular solution |
| B-27 Supplement (50X), serum free | B-27 Supplement (50X), serum free | 17504044 | Extracellular solution |
| Pennicilin, Streptomyocin, Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11995-065 | Extracellular solution |
| 200 μ L Pipettors | VWR | 89079-458 | |
| 2 - 20 μL Pipettors | Aerosol Resistant Tips | 2149P | |
| BD Falcon 3mL Transfer Pipettes [Non-sterile] | BD Falcon | 357524 | |
| Glucose | Gibco | 15023-021 | Extracellular solution |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | Extracellular solution/Beads |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | Extracellular solution |
| KCl | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | Extracellular solution |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | Extracellular solution |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | Extracellular solution |
| #5 Dumont Dumostar Tweezers 11 cm | World Precision Instruments | 500233 | |
| Dissection tools | Braun, Aesculap | ||
| Poly-D-lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P6407 | |
| Micro particles based on polystyrene, 10 μm | Sigma-Aldrich | 72986 | |
| Borosilicate tubes | King Precision Glass, Inc. | 14696-2 | |
| Horizontal Pipette Puller | Sutter Instruments | Brown-Flaming P-97 | |
| Micromanipulators, PCS-5000 Series | SD Instruments | MC7600R | |
| 1 mL Syringe | BD Luer-Lok | 309628 | |
| Inverted Microscope | Olympus | IX71 | |
| Objective | Olympus | UIS2, LUCPLFLN 40X | |
| CCD Camera | Photometrics | Cascade II: 512 | |
| Leibovitz's (1x) L-15 Medium | Life Technologies | 11415-064 | Rat Dissection |
| Typsin-EDTA (0.05%), Phenol red | Life Technologies | 25300054 | Rat Dissection |
| DMEM (1x) Dulbecco's Modified Eagle Medium [+4.5 g/L D-Glucose, + L-Glutamine, + 110 mg/L Sodium Pyruvate] | Life Technologies | 11995-065 | Rat Dissection |
| HBSS (1x) Hank's Balanced Salt Solution [- Calcium Chloride, - Magnesium Chloride, - Magnesium Sulfate] | Life Technologies | 14170-112 | Rat Dissection |
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