Summary
Este procedimento descreve como iniciar rapidamente, estender e conectar neurites organizados em câmaras microfluídicas usando pérolas revestidas de poli-D-lisina fixadas em micropipetas que guiam o alongamento de neurites.
Abstract
Lesões do cérebro e da medula espinhal podem levar à incapacidade permanente e à morte, porque ainda não é possível regenerar os neurônios em longas distâncias e reconectá-los com precisão com um alvo apropriado. Aqui, um procedimento é descrito para iniciar, alongar e conectar com precisão novos circuitos neuronais funcionais em longas distâncias. As taxas de extensão alcançadas atingem mais de 1,2 mm / h, 30-60 vezes mais rápido do que as taxas in vivo dos axônios de crescimento mais rápido do sistema nervoso periférico (0,02 a 0,04 mm / h) 28 e 10 vezes mais rápido do que o relatado anteriormente para o mesmo Tipo neuronal em um estágio anterior de desenvolvimento 4 . Em primeiro lugar, as populações isoladas de neurônios do hipocampo de ratos são cultivadas por 2-3 semanas em dispositivos microfluídicos para posicionar com precisão as células, possibilitando uma fácil micromanipulação e reprodutibilidade experimental. Em seguida, as pérolas revestidas com poli-D-lisina (PDL) são colocadas em neurites para formar contatos de adesivoOs atos e a micromanipulação de pipeta são usados para mover o complexo resultante do bead-neurite. À medida que o talão é movido, ele tira um novo neurite que pode ser estendido sobre centenas de micrômetros e funcionalmente conectado a uma célula alvo em menos de 1 h. Este processo permite reprodutibilidade experimental e facilidade de manipulação, ignorando estratégias químicas mais lentas para induzir o crescimento de neurites. As medidas preliminares aqui apresentadas demonstram uma taxa de crescimento neuronal muito superior aos fisiológicos. A combinação dessas inovações permite o estabelecimento preciso de redes neuronais em cultura com um grau de controle sem precedentes. É um método inovador que abre a porta a uma infinidade de informações e insights sobre a transmissão e comunicação de sinais dentro da rede neuronal, além de ser um campo de jogos para explorar os limites do crescimento neuronal. As aplicações e experiências em potencial são generalizadas com implicações diretas para terapias que visam reconectar a neuronaL após trauma ou em doenças neurodegenerativas.
Introduction
As lesões do sistema nervoso central do adulto (SNC) podem levar à incapacidade permanente devido a múltiplos mecanismos que limitam o crescimento do crescimento axonal 1 . Após a lesão, muitos axônios do SNC não formam um novo cone de crescimento e não conseguem montar uma resposta regenerativa efetiva 2 . Além disso, danos e tecido cicatricial que envolvem lesões do SNC inibem significativamente o crescimento axonal 1 , 2 , 3 . As terapias atuais para promover a regeneração do SNC após a lesão se concentraram no aumento do potencial de crescimento intrínseco do neurônio lesado e no encobrimento dos inibidores da extensão axonal associada aos detritos de mielina e à cicatriz glial 1 , 3 . Apesar disso, a capacidade de regenerar axônios longos para alvos distantes e formar sinapses funcionais adequadas permanece severamente limitada 4 , 5 , 6 , 7 .
No presente trabalho, micrometras, micromanipulação de pipeta e dispositivos microfluídicos são usados para iniciar, alongar e conectar com precisão novos circuitos neuronais funcionais em longas distâncias. O trabalho anterior mostrou que os grânulos revestidos com poli-D-lisina (pílulas PDL) induzem a adesão da membrana seguido pelo agrupamento de complexos de vesículas sinápticas e a formação de boutons presinápticos funcionais 8 . Também foi demonstrado que, quando o retículo PDL é mecanicamente puxado após a diferenciação pré-sináptica, o conjunto de proteína sináptica segue o grânulo, iniciando um novo neurite 9 . O procedimento a seguir explora esse fato, juntamente com a capacidade de cultura de neurônios embrionários do hipocampo de ratos em regiões organizadas em uma lamínula usando dispositivos microfluídicos de polidimetilsiloxano (PDMS) para recarregar precisamente um neurônioo circuito.
Estes dispositivos microfluídicos PDMS são não tóxicos, transparentes opticamente e consistem em duas câmaras conectadas por um sistema de microcanais. Uma vez montado em uma lamínula, cada dispositivo serve como um molde para orientar o crescimento neuronal e manter culturas neuronais saudáveis em padrões precisos por mais de 4 semanas in vitro .
Aqui, é apresentada uma estrutura para investigar os limites de extensão e funcionalidade do novo neurite. Novites neurites funcionais são criados e posicionados para controlar (re) redes neuronais de rede controláveis. As taxas de extensão alcançadas são mais rápidas do que 20 μm / min em distâncias de escala milimétrica e as conexões funcionais são estabelecidas. Estes resultados mostram, inesperadamente, que a capacidade intrínseca desses neurites para o alongamento é muito mais rápida do que se pensava anteriormente. Esta abordagem mecânica proposta ultrapassa as estratégias químicas lentas e permite a conexão controlada a um alvo específico. ºA técnica abre novos caminhos para o estudo in vitro de novas terapias para restaurar a conectividade neuronal após a lesão. Também permite a manipulação e reconexão de redes neuronais para investigar aspectos fundamentais do processamento de sinal neuronal e função neuronal in vitro .
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Protocol
Todos os procedimentos detalhados abaixo foram aprovados pelo Comitê de Cuidados com Animais da Universidade McGill e estão de acordo com as diretrizes do Conselho Canadense de Cuidados com Animais.
1. Padronização de culturas neuronais usando dispositivos microfluídicos: montagem de dispositivos
- Selecione um dispositivo microfluídico adequado para a experiência desejada. Para conectar neurônios dentro da mesma população, use o Neuro Devices ( Figura 1 ) e para conectar neurônios em diferentes populações, use os Dispositivos de Co-Cultura ( Figura 6 ).
- Limpe e prepare o número desejado de lâminas estéreis ou pratos de fundo de vidro. Para obter melhores resultados em superfícies plásticas, use pratos de 35 mm, em vidro use lâminas de 25 mm ou pratos de fundo de vidro de 35 mm. Selecione a espessura do vidro com base no sistema de imagem, por exemplo 0,15 mm.
- Revestir os pratos ou lâminas com 0,5-1 mL de 100 μg / mL de PDL durante 2 h ou durante a noite em temperatura ambienteAture.
Nota: O protocolo pode ser pausado aqui e retomado no dia seguinte, se desejado. Além disso, os pratos podem ser revestidos com PDL diluída com tampão borato, poli-L-lisina (PLL), laminina ou qualquer outra molécula de adesão celular. - Lave o prato duas vezes com água (não use solução salina tamponada com fosfato (PBS), pois os cristais de sal podem bloquear os canais), retire todo o líquido e deixe secar em um ambiente estéril, como um gabinete de biossegurança por 5-10 min ou até A superfície está completamente seca.
Nota: Tenha cuidado para garantir que os lamínulas estejam absolutamente secas, pois qualquer líquido restante irá interferir com a aderência dos sistemas microfluídicos. - Coloque dispositivos microfluídicos com padrões voltados para cima sob luz UV em um ambiente estéril (gabinete de biossegurança) por 10 min. Certifique-se de seguir procedimentos estéreis quando estiver trabalhando no gabinete de segurança de biossegurança 10 .
- Ao usar pinças, coloque um dispositivo microfluídico com padrão virado para baixo em contato com a capa limpaIp / prato. Use a pinça para pressionar suavemente o dispositivo para que ele adira ao copo.
Nota: A transparência da região aderida será visível ao olhar contra a luz. Verifique se todos os cantos estão entrando em contato com o vidro. Faça isso com todos os dispositivos microfluídicos. Veja a Figura 1a . - Para preencher o dispositivo de população individual com meio, apontar a pipeta para os canais e adicionar 50 μL de meio celular completo suplementado com B-27 livre de soro (razão de volume 1:50) e 500 μg / mL de penicilina / estreptomicina / glutamina (coletivamente Chamado NBM) para o poço superior direito e, em seguida, adicione mais 50 μL ao poço deitado diagonalmente. Faça isso para todos os dispositivos, certificando-se de que o meio flua entre os poços. Em seguida, adicione 50 μL de meio aos dois poços restantes. Veja a Figura 2a .
- Para preencher o dispositivo de população múltipla com meio, apontar a pipeta para os canais e adicionar 30 μLDe NBM completo para os poços certos, consulte a Figura 6a . Faça isso para todos os dispositivos, certificando-se de que o meio flua entre os poços. Em seguida, adicione 50 μL de meio aos restantes 4 poços.
- Coloque os dispositivos em uma placa maior com um prato aberto com água autoclavada (câmara molhada) e coloque na incubadora (37 ° C, 5% de CO 2 e 95% de umidade) durante 1-2 h enquanto prepara a cultura celular. Veja a Figura 2b .
2. Galvanização de neurônios em sistemas microfluídicos
- Seguindo o protocolo descrito na Ref. 8 , obtém neurônios dissociados de hipocampo ou cortical de embriões de ratos Sprague Dawley (qualquer gênero).
- Ressuspenda os neurônios embrionários em NBM em uma concentração de 1-2 milhões de neurônios / mL. Verifique as concentrações celulares no microscópio usando um hemocitómetro e seguindo a referência 8 . Ajuste a concentração da célulaG para a densidade celular desejada. Para aumentar as chances de obter axônios do hipocampo simples por canal, apresente 10.000 neurônios por dispositivo. Para ter múltiplos axônios no mesmo canal, aplique 60.000 neurônios por dispositivo.
Nota: Estes números variam de acordo com o tipo de neurônio utilizado. - Remova o meio dos dispositivos microfluídicos sem esvaziar os poços. Deixe aproximadamente 5 μL em cada um.
- Para plaquear células no dispositivo de população única, adicione 50 μL de NBM no poço inferior direito. Neste ponto, o meio flui por si só para preencher o outro poço inferior. Adicione 20 μL da solução de célula concentrada no poço superior direito do dispositivo microfluídico, conforme indicado na Figura 1b .
- Para células de placa no dispositivo de população múltipla, adicione 20 μL da solução de célula de concentrado em cada um dos poços certos na Figura 6a .
- Verifique no microscópio se as célulasEstão dentro das câmaras e colocam os dispositivos na incubadora por 15 a 30 minutos para promover a fixação celular ao substrato.
- Verifique no microscópio se houver células suficientes nas câmaras. Se for necessário mais, repita as etapas 2.4 e 2.5.
- Adicione 50 μL de NBM aos 2 poços superiores do dispositivo de população única e 20 μL de NBM no mesmo bem que as células foram injetadas no dispositivo de população múltipla. A mídia sobe ligeiramente para formar um menisco positivo dando aos poços um aspecto de muffin top. Novamente, veja a Figura 2a .
- Manter as células a 37 ° C, 5% de CO 2 e 95% de umidade.
3. Manter as Culturas Neuronais
- Remova NBM (aproximadamente 30 μL com uma pipeta) das células e aplique novo NBM pré-aquecido no dia seguinte à sua introdução aos dispositivos (ou seja, 1 d após o passo 2).
- Verifique a cada 2 dias se houver média suficiente em cada canal. Se o muffin tO op é baixo, apenas adicione mais poços médios aos melhores.
- Células culturais durante pelo menos 7 d antes da remoção dos dispositivos microfluídicos. As células podem sobreviver nestes dispositivos por várias semanas. Remova os dispositivos 1-2 dias antes de as experiências serem realizadas em amostras.
4. Remoção de dispositivos microfluídicos
- 1 - 2 d antes da remoção de dispositivos microfluídicos, adicione 2 mL de NBM pré-aquecido a 37 ° C em cada prato de amostra, inundando as câmaras e mantendo os dispositivos na incubadora.
- Use uma pinça estéril e uma ponta para remover os dispositivos microfluídicos das lamelas deixando uma configuração padronizada de neurônios. Use a ponta para segurar a lamínula no lugar e as pinças para apertar a borda do dispositivo no canto inferior esquerdo do poço. Aplicar delicadamente a torção, elevando o dispositivo com as pinças para que ele cai fora da lamínula. Veja a Figura 2c - 2d .
- A cada 2-3 dias, substitua haSe o NBM for utilizado até a amostra para experiências.
- Antes de realizar experimentos de re-câmbio na amostra, verifique se os neurites nos canais de dispositivo de população única e as populações neuronais no dispositivo de população múltipla são isolados examinando as lacunas entre eles no microscópio para garantir que não haja filamentos que liguem as populações neuronais.
5. Preparação de grânulos revestidos com PDL
- Adicione 2 x 50 μL de gotas de pérolas de poliestireno de 4, 10 ou 20 μm diluídas em água (1: 500) para 1 mL de PDL (100 μg / mL). Deixe durante pelo menos 2 h à temperatura ambiente.
Nota: O protocolo pode ser pausado aqui e retomado no dia seguinte. - Centrifugar a solução a 8 820 xg durante 1 min. Remova cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar as contas acumuladas no fundo do recipiente.
- Lave as contas duas vezes com 1 mL de solução esterilizada 10 mM de HEPES pH 8.4.
- Ressuspender os grânulos revestidos com PDL em 200 mL de HEPES 10 mM pH 8.4solução.
6. Preparando Micropipetas
- Prepare pipetas de tubos capilares de vidro (1 mm de diâmetro interno, 1,5 mm de diâmetro externo) usando um extrator de eletrodo horizontal. Ajuste as configurações para que a ponta externa da micropipeta puxada seja ~ 2-5 μm. Antes de puxar, certifique-se de que os tubos de vidro estejam limpos.
- Fixar pipetas para lâminas de vidro para armazenamento e garantir que a ponta não entre em contato com a superfície do slide, pois a ponta é frágil. Armazenar à temperatura ambiente em um recipiente coberto para proteger da poeira. Use pipetas no mesmo dia em que são puxados.
7. Adesão do pêndulo PDL aos neurônios
- Adicionar 40-60 μL de pérolas revestidas com PDL preparadas no passo 5 para uma cultura celular preparada no passo 4. Centre a ponta da pipeta sobre os neurônios, que são visivelmente visíveis na lamela e adicione as contas (veja a Figura 3 ).
- Devolver a amostra à incubadora por 1 h para promover a formação de syContatos napticos 8 , 9 .
- Após a incubação, remova todas as pérolas não aderidas lavando suavemente a cultura com NBM pré-aquecido.
8. Preparando Solução Salina Fisiológica (para Experimentos de Temperatura do Quarto)
- Prepare solução salina fisiológica combinando os ingredientes listados nas referências 7 , 8 . Isto é para regular o ambiente celular fora da incubadora.
- Verifique os níveis de osmolaridade e pH como indicado nas referências 7 , 8 .
- Infundir continuamente a solução com O 2 para minimizar as flutuações do pH ao realizar experimentos.
- Calor até a temperatura ambiente.
- Configure o sistema de perfusão inserindo uma extremidade de um tubo de plástico (dimensões opcionais) em solução fisiológica induzida por O2 e corrigindo o outro eE a uma agulha inserida no suporte da amostra. Coloque a tubulação e a solução mais alta que a amostra (veja a Figura 4 ).
- Desconecte o tubo da agulha e conecte-o a uma seringa. Use a seringa para exercer pressão e desenhe o líquido, enchendo o tubo. Selar com um grampo de rolo e reconectar a agulha.
9. Micromanipulação de grânulos
- Instale a amostra em uma configuração experimental de modo que as células possam ser acessadas a partir de cima por duas micropipetas montadas em micromanipuladores e acessadas opticamente abaixo, por exemplo, com o objetivo da fase 40X (abertura numérica de 0,6) de um microscópio óptico invertido. Nesta configuração, monte uma câmera CCD para captura de imagem na porta lateral do microscópio. Conecte cada pipeta a seringas de 1 mL por meio de tubos de plástico. Nesta etapa, substitua NBM por solução salina fisiológica (1-2 mL) (veja a Figura 4 ).
- Durante a experiência, Células de perfusão contínuas com a solução salina fisiológica preparada no passo 8 a uma taxa de 0,5-1 mL / min.
- Selecione um PDL-bead NÃO ligado a um neurônio no campo de visão. Alinhe o talão com uma ponta de micropipetas, concentrando-se no talão e até a micropipeta. Traga a ponta para baixo o mais próximo possível da perna monitorando-a através do microscópio.
- Aplique pressão negativa com a seringa de 1 mL conectada à pipeta para retirar o talão. Mantenha a pressão negativa durante todo o experimento.
10. Neurites puxando
- Selecione um retículo PDL ligado a um neurônio no campo de visão e anexe-o à segunda micropipleta usando sucção como descrito nos passos 9.3-9.4.
- Puxe o complexo PDL-bead-neurônio lentamente (~ 0,5 μm / min) movendo o micromanipulador ou o estágio da amostra em 1 μm e pausando durante 5 minutos para permitir a iniciação dos neurites.
- Repita o passo 10.2 duas vezes.
Nota: Os primeiros 3 &# 181; m tem que ser puxado muito devagar para garantir o sucesso experimental, que ocorre em mais de 95% do tempo. - Puxe o complexo PDL-bead-neurônio lentamente (~ 0,5 μm / min) movendo o micromanipulador ou o estágio da amostra em 2 μm e pausando durante 5 minutos para permitir o alongamento dos neurites.
- Após a iniciação bem sucedida e extensão de neurite para os primeiros 5 μm, puxe a neurite a 20 μm / min em distâncias da escala milimétrica.
Nota: A puxar pode ser realizada de forma contínua ou em etapas e em taxas variáveis. Veja a Figura 5b- 5c .
11. Conectando Neurônios
- Selecione uma região rica em neurites e abaixe o complexo PDL-bead-neurite para contatá-lo fisicamente. Use outras contas para medir a altura da ponta acima da superfície do coxiforme. Veja a Figura 5d .
- Deixe o complexo PDL-bead-neurite em contato com o neurite alvo enquanto manipula o segundo micropiPette. Abaixe a segunda pipeta com o segundo pérolas PDL em cima do neurite recém formado, cerca de 20 μm, formam o primeiro talão. Use o segundo pino PDL para empurrar o novo filamento neurítico para a célula alvo.
- Segure ambas as pérolas no lugar por pelo menos 1 h. Verifique a ausência de inchaço focal, um espessamento dos neurites em contato com o grânulo, com o microscópio 16 .
- Durante este tempo, use a perfusão para mudar lentamente o meio da amostra da solução salina fisiológica para o NBM pré-aquecido e com CO2 equilibrado.
- Solte o cordão da segunda pipeta soltando a sucção. Se o novo neurite permanecer em anexo, solte o primeiro talão também. Veja a Figura 5e .
- Retire suavemente a solução salina e substitua-a com NBM (~ 2 mL).
- Coloque cuidadosamente a amostra na incubadora para fortalecer a conexão neuronal para futuras experiências. Esta conexão é estável por> 24 h 7
12. Verificando a funcionalidade da nova conexão através de gravações de grampos de patchs com células inteiras
- Siga as referências 7 , 18 , 19 . Para montar uma instalação de eletrofisiologia.
- Siga as referências 7 . Para preparar os eletrodos pré e pós-sinápticos.
- Reúna dados de grampos de patch, novamente seguindo as referências 18 , 19 .
- Compare os resultados com os sinais 7 de ocorrência natural para determinar o tipo de conexão.
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Representative Results
Os neurônios do hipocampo do rato embrionário são cultivados em dispositivos microfluídicos para permitir o posicionamento preciso de células, PDL-beads e micromanipuladores. O primeiro passo é montar adequadamente o dispositivo microfluídico em uma lamínula de vidro ou prato. É essencial que o dispositivo microfluídico esteja bem ligado ao substrato para evitar células que saem das câmaras e se movendo sob as partes do dispositivo que devem ser seladas ( Figura 1a ). Para manter culturas saudáveis durante várias semanas, é importante evitar a evaporação média, verificando o meio celular a cada 2-3 dias e preservando um menisco positivo de meio ( Figura 2a ). A evaporação média também é evitada mantendo as células e um prato aberto de água dentro de uma placa maior ( Figura 2b ). Os dispositivos microfluídicos podem ser removidos a qualquer momento. Para resultados ótimos, NBM deve ser adicionado à célula-deVire o sistema pelo menos 1 d antes da remoção do dispositivo. Isso minimiza o estresse celular, pois os neurônios estão em contato com o meio na temperatura e pH ideais quando os dispositivos são removidos. Quando os dispositivos microfluídicos são retirados lentamente do prato ( Figura 2c E 2d ) as células permanecerão na posição padronizada ( Figura 3 e Figura 5a ).
São utilizados dois tipos de dispositivos microfluídicos: Neuro Device e Co-Culture Device. O primeiro permite uma identificação fácil de axônios, dendritos e corpos celulares. O soma permanece na câmara de soma superior enquanto axônios e dendritos crescem ao longo dos canais microfluídicos ( Figura 5a ) em direção à câmara axonal.
Recomenda-se que o PDL-beads seja adicionado às células em uma proporção de 10: 1 e que a maioria das contas que haNão aderiu à cultura ser removida lavando as células uma vez com NBM após a incubação de 1 h ( Figura 3 ). Após a aderência do retículo PDL aos neurites, o complexo PDL-bead-neurite é puxado e pode ser prolongado em grandes distâncias. O neurite recém formado pode ser precisamente conectado a neurites ou soma milímetros de distância ( Figura 5b -5e ). A taxa de sucesso para puxar um novo neurite para os primeiros 3 μm a velocidades inferiores a 1 μm / min é> 95% (n = 206). A taxa de sucesso para conectar o novo neurite a outra célula é de 70% (n = 30). A conexão é muito frágil nas primeiras 18 h, principalmente porque o novo neurite é um filamento com menos de 1 μm de diâmetro ancorado por um talão PDL de 10 μm. Se o prato é movido rapidamente durante os primeiros minutos de contato, a turbulência resultante do meio pode fazer com que o cordão rolo e conseqüentemente a adesão a ser perdida. No entanto, se a amostra não for shaKen, em 30 min, o grânulo anexa aos neurites no prato e a nova conexão permanece por pelo menos 48 h. Veja a Figura 4 para um esquema da configuração.
A posição PDL-bead na cultura também pode ser usada para identificar facilmente a localização da neurite conectada ( Figuras 6d-6e ). Após a iniciação, extensão e conexão de um novo neurite, um segundo e não aderente PDL-bead, captado através do micromanipulador, é usado para criar um segundo local de adesão entre o neurite iniciado e a segunda população neuronal. O segundo PDL-bead é colocado em cima do novo neurite, comprimindo-o de tal forma que o novo neurite apenas contata a segunda população neuronal 11 . Isso promoverá a adesão com a segunda população neuronal ( Figura 5f ).
O dispositivo de população múltipla emabO crescimento de 4 populações neuronais isoladas no mesmo prato. Cada população neuronal é confinada a um retângulo de 4 x 7 mm separado de outras populações neuronais em intervalos de 100 ou 200 μm ( Figura 6a ). Os neurônios saudáveis podem crescer dentro dos dispositivos por várias semanas. Normalmente, as populações neuronais permanecem isoladas até 48 h após a remoção do dispositivo. Após esse período de 48 horas, os neurônios tendem a crescer em direção a populações neuronais vizinhas e formam conexões naturais. Antes de conectar duas populações isoladas, deve-se verificar que as populações realmente estão verdadeiramente isoladas examinando toda a lacuna com o microscópio para estabelecer que não há nenhuma ligação entre as duas populações neuronais ( Figura 6b ).
Após a conexão, as amostras foram incubadas durante 24 h e as gravações elétricas de braçadeiras de parcelamento de células inteiras foram realizadas para investigar se o recém-renovadoO neurite formado usado para conectar duas populações neuronais isoladas era funcional e capaz de transmitir sinais elétricos. Um neurônio na população um, localizado a menos de 100 um do raio do local onde o neurite induzido foi iniciado, foi selecionado para registrar os potenciais de ação pré-sinápticos (PAPs). Este neurônio foi considerado a célula pré-sináptica. A atividade excitadora ou inibitória pós-sináptica foi registrada a partir de um neurônio na população dois, do outro lado do espaço, localizado em um raio de menos de 100 μm da conexão micromanipulada ( Figura 7a- 7c ). As gravações derivadas das conexões induzidas mecanicamente foram analisadas e comparadas às das populações neuronais naturalmente conectadas e às populações não conectadas ( Figura 7 ). As respostas elétricas após PAP registradas a partir de neurônios conectados naturalmente e por micromanipulação são significativamente maiores e temporariamente correlacionadas com a pré-sinápticaAtividade ( Figura 7 ).
Figura 1: Padronização de culturas neuronais usando dispositivos microfluídicos 7 . (A) Montagem do dispositivo: quando os dispositivos microfluídicos são adequadamente montados em uma superfície seca, todas as câmaras são visíveis. ( B ) Revestimento de células: prenda as células no poço direito superior e as células devem se mover para o poço esquerdo. ( C ) Densidade celular: logo após o revestimento, verifique no microscópio se a concentração de células é adequada. ( D ) Após 1 d em cultura, os neurônios do hipocampo são bem aderidos perto dos microcanais e começam a formar neurites. Clique aqui para ver um grande E a versão desta figura.
Figura 2 : Manutenção de culturas neuronais saudáveis durante várias semanas 7 . (A) Adicione o meio a cada 2-3 dias e mantenha um menisco positivo nos poços superiores das câmaras microfluídicas para que as células tenham um suprimento constante de nutrientes. ( B ) Mantenha as células dentro de uma placa maior com um prato contendo água para reduzir a evaporação média. ( C ) Use ponta esterilizada e pinças para ( d ) descasque facilmente as microdevenções. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 3 : Localização de pétilas de deposição de pipeta em culturas. Uma vez que o dispositivo microfluídico foi removido, os neurônios são visíveis no lamínula. Ao depositar grânulos, posicione a ponta da pipeta de modo que esteja no centro das células. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Esquema de um conjunto típico de piragem de neurite. A amostra repousa em um estágio (acionada por piezo) e pode ser acessada por cima por 2 micropipetas mantidas em micromanipuladores e conectadas a seringas de 1 mL por meio de tubos de plástico. A amostra é acessada opticamente por baixo de um objetivo conectado a uma câmera CCD que enviaS imagens para uma CPU. Um tubo de entrada alimenta a solução salina fisiológica oxigenada para a amostra, que fica abaixo dela, e um tubo de saída conectado a uma seringa permite a retirada da solução em caso de transbordamento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 : Adesão do pêndulo PDL aos neurônios e micromanipulação de pipeta 7 . (A) Os neurônios permanecem organizados em padrões após a remoção de câmaras microfluídicas, permitindo fácil identificação de soma e neurites. ( B ) Micromanipulação de pérolas de PDL aderidas a neurites permite a iniciação de neurite, extensão ( c ) e conexão ( d ),Seguido da liberação do retângulo PDL da pipeta ( e ). ( F ) Depois de entrar em contato com duas populações neuronais isoladas (seta do fundo), um segundo micromanipulador de pérolas PDL e de pipeta (seta superior) é usado para estabelecer um segundo ponto de adesão, algumas centenas de microns aparte do primeiro ponto de contato e garante funcionalidades Conexões. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6 . Iniciação, Elongação e Conexão de Neurites Novos para Conectar Duas Populações Isoladas Usando Dispositivo de População Múltipla e Micromanipulação 7 . (A) O dispositivo isola 4 populações neuronaisEntre 3 intervalos de 100 ou 200 μm cada. ( B ) Após a remoção do dispositivo, selecione um intervalo e certifique que nenhum neurite liga as 2 populações individuais. ( C ) Esquema da configuração experimental como deve ser visível no microscópio óptico, indica a posição de duas micropipetas e a presença de pérolas revestidas com PDL. ( D ) Ao aplicar pressão negativa a uma pipeta, uma ponta PDL aderida a uma população neuronal é puxada com a ponta da pipeta, iniciando desse modo uma nova neurite. Ao manter a pressão negativa na pipeta, o complexo PDL-bead-neurite (verde) pode ser puxado, alongando a neurite. ( E ) A micromanipulação de pipeta guia a extensão do novo neurite sobre o fosso e a formação de uma conexão com uma nova população neuronal. Para garantir a adesão do novo neurite à segunda população, um talão PDL (vermelho) é posicionado com uma segunda pipeta em cima tanto do neurite alongado quanto do neuroPopulação nal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: O Neurite recém-induzido, alongado e conectado pode transferir informações entre duas populações neuronais isoladas 7 . As populações neuronais isoladas foram cultivadas separadas por um espaço de 100 μm nas microdevenções PDMS. As gravações de grampos de patch pareados foram realizadas em configuração de células inteiras de um neurônio na população um e um neurônio na população dois (do outro lado da lacuna) quando as duas populações foram conectadas através de manipulação mecânica ( a ), permitiu-se interconectar naturalmente através da Intervalo ( b ) ou permanecer não conectado pelo maintEstabelecendo a lacuna ( c ). Traços representativos de gravações em pares são mostrados para cada condição ( df ). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Usando micromanipulação padrão e dispositivos microfluídicos inovadores, uma nova técnica foi desenvolvida para iniciar, alongar e conectar com precisão novos circuitos neuronais funcionais em grandes distâncias. A micromanipulação de pipeta é uma ferramenta comum na maioria dos laboratórios de neurociência 4 , 13 . O verdadeiro desafio para alcançar resultados reprodutíveis e confiáveis foi a padronização de culturas neuronais saudáveis e posicionadas com precisão durante a duração do experimento (que pode estar na ordem das semanas) através do desenvolvimento de dispositivos microfluídicos para organizar culturas celulares com precisão micrométrica. As culturas de células de alta qualidade são a pedra angular da validação de dados. Isso contribui para uma imagem de microscopia mais simples e rápida e padronização de culturas e resultados. Os dispositivos microfluídicos foram projetados para cultivar células in vitro com organização similar à in vivo . O dispositivo de população única permiteO crescimento de neurites longos e fácil identificação de axônios, neurites e soma. O número de células plaqueadas nas câmaras microfluídicas determina a densidade neuronal. Portanto, ao colocar menos células por dispositivo, é fácil identificar neurônios únicos próximos aos canais. O axônio e múltiplas dendritas de um único neurônio crescem dentro de um canal. Os dendritos crescem pelo menos 5 vezes mais lento do que os axônios 6 , 17 e após 2-3 semanas in vitro, seu crescimento nos canais geralmente é limitado a 200 μm, enquanto os axônios de rápido crescimento podem ultrapassar 2 mm 17 . Portanto, depois de adicionar contas de PDL às amostras, é relativamente fácil estimar se as contas se aderem principalmente a axônios ou axônios e dendritos ( Figura 5b - 5f ). Existem maiores chances de puxar novos axônios e dendritos ao puxar os grânulos PDL ligados a neurites com menos de 200 μm, whExistem maiores probabilidades de puxar apenas novos axônios ao puxar as pérolas PDL ligadas a neurites com mais de 500 μm. O dispositivo de população múltipla é útil para o crescimento reproduzível de populações separadas saudáveis por várias semanas. Este sistema de canais é útil para estudar até 4 tipos de células diferentes ou comparar as mesmas células com diferentes tratamentos.
Além disso, um ambiente de cultura celular controlado e reprodutível fornece uma estrutura ideal para análise e manipulação de células. O posicionamento preciso das células em um prato facilita a identificação de regiões de interesse, bem como a orientação e navegação através dessas áreas de interesse, permitindo um controle sem precedentes sobre o site de iniciação de neurites. Uma distribuição celular controlada torna mais fácil a visualização da conexão recém formada e muito mais rápida para encontrar a nova conexão com o microscópio nos dias após a incubação. Além disso, configurações reproduzíveis de célulasPermitir posicionamento fácil e preciso de pistas químicas, como os grânulos revestidos com PDL, no soma, dendritos ou axônios 8 . Em conjunto, imagens e análises de células cultivadas em dispositivos microfluídicos são mais rápidas devido à organização celular padrão reproduzida em todos os pratos. Além disso, os dispositivos são feitos de material biocompatível, transparente e removível, permitindo a imagem em todos os comprimentos de onda visíveis e a sobrevivência celular dentro dos dispositivos por várias semanas. A miniaturização dos ensaios celulares também ajuda a reunir mais dados com menos células. O baixo volume de consumo de dispositivos microfluídicos reduz o número de células necessárias por experiência e aumenta a eficácia experimental. Por exemplo, em vez de passar várias horas pesquisando com um microscópio para talvez 1 ou 2 axônios isolados em um prato, o dispositivo de população única pode ser usado para acessar imediatamente mais de 100 axônios isolados por amostra celular. Os dispositivos microfluídicos oferecem um modelo miniaturizado confiável e controlado.Ambiente de cultura celular favorecendo a análise de amostras raras com tempo para realizar testes múltiplos.
As variações potenciais da técnica envolvem a ligação direta do talão à micropipeta. No protocolo atual, um método é descrito para anexar o talão à ponta por sucção, mas o talão também pode ser colado na ponta. A cola é a opção melhor se uma conexão altamente estável entre a ponta e o talão for desejável, por exemplo, se as medidas de força forem feitas usando a pipeta como sensor ou se a investigação de adesão entre PDL e neurite for o principal objetivo experimental. Noutra veia, a sucção é vantajosa, uma vez que permite a liberação do grânulo após a colocação sem separar o complexo do nervo neurite, permitindo assim que várias conexões sejam feitas em paralelo. A sucção fornece meios para experiências de re-câmbio de alto rendimento, uma melhoria em relação a outras técnicas de manipulação, como a microscopia de força atômica (AFM) 7 </ Sup> , 16 . Ambas as modificações deste método permitem que o sítio de iniciação de neurite seja selecionado simplesmente mantendo uma cordão em contato com uma dendrite para que as sinapses sejam formadas. No entanto, a estratégia de incubar vários talões como descrito no passo 7 economiza tempo na fase de manipulação e é recomendável se o controle preciso sobre o site de iniciação for desnecessário no experimento.
Pesquisa futura poderia buscar abordar várias limitações instrumentais, nomeadamente o controle de temperatura e a acessibilidade da amostra. As propriedades mecânicas da membrana celular podem variar significativamente em diferentes temperaturas 27 . Idealmente, todas as experiências devem ser realizadas a 37 ° C em meio neuronal e condições adequadas (controles corretos de pressão e umidade do CO 2 ). No entanto, não foi possível usar uma incubadora de células fechadas, porque o acesso às amostras do topo é necessário para os micromanipuladores, desde oFundo para o microscópio e do lado para mover o palco. Portanto, a perfusão à temperatura ambiente foi utilizada. Na mesma linha, uma vez que a configuração apenas tem espaço suficiente para acomodar 2 micromanipuladores e leva quase 1 h para estabelecer uma única conexão, há um limite para o número de experimentos que um pode executar. Esta questão pode ser abordada com um manipulador que puxa mais de um talão por vez. Outra melhoria potencial para este protocolo é a capacidade de registrar a altura do complexo bead-pipette a partir da superfície da amostra. A incapacidade de fazer isso pode levar a imprecisões ao derrubar o segundo pé e colocá-lo no neurite induzido para corrigi-lo. O talão é abaixado em cima do novo neurite em uma região rica em neurites até o novo neurite e aqueles no prato se encontrarem no mesmo plano focal. O novo neurite nunca está entre o talão e o prato, mas sempre entre uma almofada de matéria celular e o talão, portanto, a compressão é reduzida. Além disso,O novo neurite é observado durante 10 minutos no microscópio para avaliar se os inchaços focais de neurites são formados perto do grânulo. Conforme descrito na referência 16 , a presença de inchaço indica degeneração de neurite. No entanto, uma vez que a aplicação de quantidades variáveis de pressão aos axônios pode levar a mudanças fisiológicas 16 , a pesquisa futura poderia se concentrar na adaptação das sondas de pipeta, fixando-se refletores e monitorando o deslocamento perpendicular à superfície da amostra com métodos AFM. Finalmente, talvez o maior desafio para este protocolo seja testar a funcionalidade da conexão manipulada. A técnica mais direta, confiável e bem estabelecida é o emparelhamento de gravações de grampos de grampos de células inteiras. No entanto, a taxa de sucesso da gravação de grampos de patch pareados é muito baixa (<25%) 18 . O grampo de patch de células inteiras tem várias desvantagens, incluindo tempo de configuração longo, número limitado de experiências / dia, tempo de gravação limitado (~ 30Min), baixo rendimento experimental para gravações de grampos pareados e morte celular após medições. Devido a esses desafios técnicos, o rendimento experimental das gravações em pedaços de grampos de toda célula após a micromanipulação é muito baixo. São necessárias melhores plataformas e técnicas para estimular, registrar e comparar a atividade neuronal com mais precisão nas conexões naturais e micromanipuladas.
A importância da tensão no crescimento axonal tem sido conhecida desde os primeiros dias da neuroanatomia - referindo-se a ele como alongamento passivo 20 . Durante o início do desenvolvimento embrionário neurites migram através de pequenas distâncias para alcançar seus objetivos. À medida que a maioria das células se dividem e duplicam, os axônios são submetidos a forças contínuas para alongar e ajustar seu comprimento ao crescimento embrionário 20 , 21 . Vários grupos tentaram testar os limites do crescimento de neurites aplicando sugestões químicas e / ou tensão mecânica para neuRons (para revisão veja a referência 22 ). Nestes relatórios 23 , 24 , 25 , 26 , bem como durante o crescimento fisiológico, os neurites são puxados enquanto estão presos a um substrato. A principal diferença para nossa configuração é que, na técnica atual, os novos neurites possuem apenas dois contatos de adesão; Na base o neurite está ligado ao neurônio e na ponta o neurite está preso ao grânulo. Durante o alongamento, os componentes do novo neurite têm a liberdade de se dispersar da maneira mais eficiente para acomodar as forças de puxar. Mais importante ainda, este protocolo descreve como reproduzir essas experiências sem causar ruptura de neurite nem degeneração, com base em estudos prévios sobre a formação de contatos sinápticos 8 e sobre a resistência dos axônios à pressão 16 mostrando como usar micro e nanotools paraPuxa continuamente os neurites com a força apropriada. As taxas de extensão de neurite descritas aqui (1,2 mm / h) são 30-60 vezes mais rápidas do que as taxas in vivo dos axônios de crescimento mais rápido do sistema nervoso periférico (0,02 a 0,04 mm / h) 28 . Quando comparado ao mesmo tipo neuronal in vitro , as taxas de extensão axonal descritas aqui são 7,5 vezes mais rápidas do que as taxas de crescimento descritas por outros autores em um estágio de desenvolvimento anterior (0,1 mm / h) 4 . Diferentes tipos de neurônios foram encontrados para estender axônios em diferentes índices intrínsecos que variam em várias vezes 29 . Além disso, os axônios do sistema nervoso central geralmente perdem a alta taxa de crescimento axonal após inervação alvo in vivo 29 e 3 d de cultura in vitro 6 . Portanto, a técnica de extensão axonal atual deve ser testada com diferentes tipos neuronais para melhor compreenderE limites da extensão do neurite.
A micromanipulação de pipeta e os dispositivos microfluídicos são técnicas demonstradas para criar novos neurites funcionais e para posicionar de forma controlada ou (re) ligar redes neuronais. Esta plataforma é ideal para medidas sistemáticas e padronizadas. Ele introduz a reprodutibilidade e controle in vivo em experimentos em redes complexas de neurônios. As taxas de extensão alcançadas são mais rápidas do que 20 μm / min em distâncias de escala milimétrica e as conexões funcionais são estabelecidas. Esses resultados mostram, inesperadamente, que a capacidade intrínseca dos axônios para o alongamento, incluindo a dos seus componentes do citoesqueleto, é muito mais rápida do que se pensava anteriormente 10 , 11 , 12 . Essa abordagem mecânica proposta ultrapassa estratégias químicas lentas e, portanto, representa uma mudança de paradigma para desenvolvimentos terapêuticos para restaurar conectividade neuronal após lesãoE para micro neuroengenharia de redes neurais artificiais para o seu estudo controlado in vitro . Estes resultados também têm um grande impacto na medicina regenerativa e nas abordagens de neuro-engenharia com implicação direta para terapias que visam reconectar circuitos neuronais após trauma ou em doenças neurodegenerativas. Esta plataforma abre a porta para obter dados sobre comunicação de neurônios, modulação de sinal, bem como crescimento e regeneração. É uma nova maneira de regenerar mecanicamente o SNC e técnicas similares podem permitir a restauração da função após uma lesão. Além disso, esta técnica pode ser usada para criar redes neuronais de engenharia sistemática como novas plataformas de bioensaio para descoberta de drogas e validação de metas. É um precursor da fiação direta de interfaces robustas cérebro-máquina.
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Disclosures
A autora Margaret H Magdesian é a CEO da Ananda Devices que produz instrumentos utilizados neste artigo.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer a Yoichi Miyahara por muitas discussões e informações úteis. MA e PG reconhecem o financiamento do CRSNG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Co-culture devices | Ananda Devices | Commercially available at http://www.anandadevices.com | |
| Neuro devices | Ananda Devices | Commercially available at http://www.anandadevices.com | |
| No. 1 Glass Coverslip 25 mm Round | Warner Instruments | 64-0705 | |
| 35 mm Glass Bottom Dishes #0, Uncoated, Gamma-Irradiated | MatTex Incorporation | P35G-0-20-C | |
| 35 mm cell culture dish, Non-Pyrogenic, Sterile | Corning Inc | 430165 | |
| 95 mm x 15 mm Petri Dish, Slippable Lid, Sterile Polystyrene | Fisherbrand | FB0875714G | |
| 50 mL Centrifuge tubes with printed graduations and flat caps | VWR | 89039-656 | |
| 15 mL Polypropylene Conical Tube, 17 x 120 mm style, Non Pyrogenic, Sterile | Falcon | 352097 | |
| Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103-049 | Extracellular solution |
| B-27 Supplement (50X), serum free | B-27 Supplement (50X), serum free | 17504044 | Extracellular solution |
| Pennicilin, Streptomyocin, Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11995-065 | Extracellular solution |
| 200 μ L Pipettors | VWR | 89079-458 | |
| 2 - 20 μL Pipettors | Aerosol Resistant Tips | 2149P | |
| BD Falcon 3mL Transfer Pipettes [Non-sterile] | BD Falcon | 357524 | |
| Glucose | Gibco | 15023-021 | Extracellular solution |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | Extracellular solution/Beads |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | Extracellular solution |
| KCl | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | Extracellular solution |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | Extracellular solution |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | Extracellular solution |
| #5 Dumont Dumostar Tweezers 11 cm | World Precision Instruments | 500233 | |
| Dissection tools | Braun, Aesculap | ||
| Poly-D-lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P6407 | |
| Micro particles based on polystyrene, 10 μm | Sigma-Aldrich | 72986 | |
| Borosilicate tubes | King Precision Glass, Inc. | 14696-2 | |
| Horizontal Pipette Puller | Sutter Instruments | Brown-Flaming P-97 | |
| Micromanipulators, PCS-5000 Series | SD Instruments | MC7600R | |
| 1 mL Syringe | BD Luer-Lok | 309628 | |
| Inverted Microscope | Olympus | IX71 | |
| Objective | Olympus | UIS2, LUCPLFLN 40X | |
| CCD Camera | Photometrics | Cascade II: 512 | |
| Leibovitz's (1x) L-15 Medium | Life Technologies | 11415-064 | Rat Dissection |
| Typsin-EDTA (0.05%), Phenol red | Life Technologies | 25300054 | Rat Dissection |
| DMEM (1x) Dulbecco's Modified Eagle Medium [+4.5 g/L D-Glucose, + L-Glutamine, + 110 mg/L Sodium Pyruvate] | Life Technologies | 11995-065 | Rat Dissection |
| HBSS (1x) Hank's Balanced Salt Solution [- Calcium Chloride, - Magnesium Chloride, - Magnesium Sulfate] | Life Technologies | 14170-112 | Rat Dissection |
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