Summary
Denna procedur beskriver hur man snabbt initierar, förlänger och ansluter neuriter organiserade i mikrofluidiska kamrar med användning av poly-D-lysinbelagda pärlor fixerade till mikropipetter som styr neuritöjning.
Abstract
Hjärn- och ryggmärgsskada kan leda till permanent invaliditet och död eftersom det fortfarande inte är möjligt att regenerera neuroner över långa avstånd och noggrant återansluta dem med ett lämpligt mål. Här beskrivs ett förfarande för att snabbt initiera, förlänga och exakt ansluta nya funktionella neuronkretsar över långa avstånd. Förlängningsgraden uppnådde når över 1,2 mm / h, 30-60 gånger snabbare än in vivo- hastigheterna för de snabbast växande axonerna från perifert nervsystem (0,02 till 0,04 mm / h) 28 och 10 gånger snabbare än tidigare rapporterade för samma Neuronaltyp vid ett tidigare utvecklingsstadium 4 . För det första odlas isolerade populationer av råttahippokampala neuroner i 2-3 veckor i mikrofluidiska anordningar för att positionera cellerna exakt, vilket möjliggör enkel mikromanipulation och experimentell reproducerbarhet. Därefter placeras pärlor belagda med poly-D-lysin (PDL) på neuriter för att bilda adhesivHandlingar och pipettmikromomanipulation används för att flytta det resulterande vulst-neuritkomplexet. När pärlan flyttas drar den ut en ny neurit som kan förlängas över hundratals mikrometer och funktionellt kopplad till en målcell på mindre än 1 h. Denna process möjliggör experimentell reproducerbarhet och lätthet av manipulation medan man kringgår långsammare kemiska strategier för att inducera neuritillväxt. Preliminära mätningar presenterade här visar en neuronal tillväxt som är långt överstigande fysiologiska. Kombinationen av dessa innovationer möjliggör en exakt etablering av neuronala nätverk i kultur med en aldrig tidigare skådad grad av kontroll. Det är en ny metod som öppnar dörren till en mängd information och insikter i signalöverföring och kommunikation inom neuronnätet samt att vara en lekplats för att utforska gränserna för neuronal tillväxt. De potentiella tillämpningarna och experimenten är utbredda med direkta konsekvenser för terapier som syftar till att återansluta neuronL-kretsar efter trauma eller i neurodegenerativa sjukdomar.
Introduction
Skador på vuxna centrala nervsystemet (CNS) kan leda till permanent invaliditet på grund av flera mekanismer som begränsar axonal återväxt 1 . Efter skada bildar många CNS-axoner inte en ny tillväxtkotte och misslyckas med att montera ett effektivt regenerativ respons 2 . Vidare hämmar skador och ärrvävnader som omger CNS-lesioner signifikant axonal tillväxt 1 , 2 , 3 . Nuvarande terapier för att främja CNS-regenerering efter skada har fokuserat på att öka den skadliga neurons inneboende tillväxtpotential och på att maskera inhibitorerna av axonal förlängning associerad med myelinrusk och glialärret 1 , 3 . Trots detta förblir kapaciteten att regenerera långa axoner till avlägsna mål och att bilda lämpliga funktionella synapser fortfarande allvarligt begränsade 4 , 5 , 6 , 7 .
I det nuvarande arbetet används mikroblock, pipettmikromanipulering och mikrofluidiska anordningar för att snabbt initiera, förlänga och anslut exakt nya funktionella neuronkretsar över långa avstånd. Tidigare arbete har visat att poly-D-lysin-belagda pärlor (PDL-pärlor) inducerar membranadhesion följt av klustringen av synaptiska vesikelkomplex och bildandet av funktionella presynaptiska bones 8 . Det visades också att när PDL-pärlan mekaniskt dras bort efter presynaptisk differentiering följer den synaptiska proteinklusten pärlan och initierar en ny neurit 9 . Följande procedur utnyttjar detta faktum tillsammans med förmågan att odla embryonala hippocampala neuroner hos råttor i organiserade regioner på en täckglas med användning av polydimetylsiloxan (PDMS) mikrofluidiska anordningar för att exakt omdirigera en neuronalkrets.
Dessa PDMS-mikrofluidiska anordningar är icke-toxiska, optiskt transparenta och består av två kamrar anslutna med ett system av mikrokanaler. En gång monterad på en täckglas, fungerar varje enhet som en form för att styra neuronal tillväxt och upprätthålla friska neuronkulturer på exakta mönster längre än 4 veckor in vitro .
Här presenteras en ram för att undersöka gränserna för utvidgning och funktionalitet hos den nya neuriten. Nya, funktionella neuriter skapas och positioneras till styrbart (re) trådnätverk. Förlängningsgraden som uppnåtts är snabbare än 20 μm / min över avstånd från millimeterskala och funktionella anslutningar upprättas. Dessa resultat visar oväntat att den inre kapaciteten hos dessa neuriter för förlängning är mycket snabbare än tidigare trodde. Detta föreslagna mekaniska tillvägagångssätt förbi långsamma kemiska strategier och möjliggör kontrollerad anslutning till ett specifikt mål. thTekniken öppnar nya vägar för in vitro- studien av nya terapier för att återställa neuronal anslutning efter skada. Det möjliggör också manipulation och omkoppling av neuronala nätverk för att undersöka grundläggande aspekter av neuronal signalbehandling och neuronfunktion in vitro .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla procedurer som beskrivs nedan godkändes av McGill University's Animal Care Committee och överensstämde med riktlinjerna från det kanadensiska djurhållningsrådet.
1. Standardisering av neuronala kulturer med användning av mikrofluidiska enheter: Enhetsmontering
- Välj en lämplig mikrofluidisk anordning för det önskade experimentet. För att ansluta neuroner inom samma population, använd Neuro Devices ( Figur 1 ) och anslut neuroner i olika populationer med hjälp av Co-Culture Devices ( Figur 6 ).
- Rengör och förbered det önskade antalet sterila täckglas eller glasbottnar. För bästa resultat på plastytor använd 35 mm rätter, på glasskruv 25 mm täckglas eller 35 mm glasbottnar. Välj glas tjocklek baserat på bildsystemet, till exempel 0,15 mm.
- Belägga disken eller täckglas med 0,5-1 ml 100 μg / ml PDL under 2 timmar eller över natten vid rumstemperaturratur.
Obs! Protokollet kan pausas här och återupptas efterföljande dag om så önskas. Vidare kan disken beläggas med boratbuffertutspädd PDL, Poly-L-Lysin (PLL), laminin eller någon annan celladhesionsmolekyl. - Tvätta disken två gånger med vatten (använd inte fosfatbuffrad saltlösning (PBS) eftersom saltkristaller kan blockera kanalerna), avlägsna all vätska och låt den torka i en steril miljö, såsom ett biosäkerhetsskåp under 5-10 minuter eller tills Ytan är helt torr.
Obs! Var försiktig så att täckglasen är helt torra, eftersom eventuell återstående vätska kommer att störa mikrofluidiska systemets vidhäftning. - Placera mikrofluidiska enheter med mönster uppåt under UV-ljus i en steril miljö (biosäkerhetsskåp) under 10 min. Var noga med att följa sterila procedurer när du arbetar i biosäkerhetsskåp 10 .
- Med hjälp av pincett placeras en mikrofluidisk enhet med mönstret vänd nedåt i kontakt med rena locklip / skål. Använd pincettarna för att trycka på enheten så att den håller fast vid glaset.
Obs! Genomskinligheten i den vidhäftande regionen kommer att vara synlig när man tittar mot ljuset. Se till att alla hörn kontaktar glaset. Gör detta för alla mikrofluidiska enheter. Se figur la . - För att fylla den enda populationen med medium, peka pipetten mot kanalerna och tillsätt 50 μl komplett cellmedium kompletterat med serumfritt B-27 (volymförhållande 1:50) och 500 μg / ml penicillin / streptomycin / glutamin (kollektivt Kallad NBM) till höger övre brunn och sedan tillsätt en annan 50 μL till brunnen liggande diagonalt mot den. Gör detta för alla enheter, se till att mediet strömmar mellan brunnar. Därefter tillsätt 50 μL medium till de återstående 2 brunnarna. Se figur 2a .
- För att fylla den multipla populationen med medium, peka pipetten mot kanalerna och tillsätt 30 μLAv fullständig NBM till de högra brunnarna, se Figur 6a . Gör detta för alla enheter, se till att mediet strömmar mellan brunnar. Därefter tillsätt 50 μL medium till de återstående 4 brunnarna.
- Placera enheterna i en större tallrik med öppen skål med autoklaverat vatten (våtkammare) och placera i inkubatorn (37 ° C, 5% CO2 och 95% fuktighet) i 1-2 h under beredning av cellodlingen. Se figur 2b .
2. Plating Neurons i mikrofluidiska system
- Efter det protokoll som beskrivs i Ref. 8 , erhålla dissocierade hippocampala eller kortikala neuroner från Sprague Dawley råttembryon (antingen köns).
- Resuspendera embryonala neuroner i NBM vid en koncentration av 1-2 miljoner neuroner / ml. Verifiera cellkoncentrationer i mikroskopet med hjälp av en hemocytometer och följande referens 8 . Justera cellkoncentrationen enligtG till önskad celltäthet. För att öka chanserna för att erhålla enskilda hippocampala axoner per kanal, plåt 10 000 neuroner per enhet. För att ha flera axoner i samma kanal, plåta 60.000 neuroner per enhet.
Obs! Dessa siffror varierar beroende på vilken typ av neuron som används. - Ta bort mediet från de mikrofluidiska enheterna utan att tömma brunnarna. Lämna ungefär 5 μl i vardera.
- Till platta celler i den enda befolkningsenheten, tillsätt 50 μL NBM till nedre högra brunnen. Vid denna tidpunkt flyter mediet i sig för att fylla den andra undre brunnen. Tillsätt 20 μl av koncentratcelllösningen i den högra högra brunnen av den mikrofluidiska anordningen, såsom indikeras i figur 1b .
- För att plana celler i den multipla populationen tillsätt 20 μl koncentratcelllösningen i vardera av de högra brunnarna i figur 6a .
- Kontrollera i mikroskop om cellernaÄr inuti kamrarna och placera enheterna i inkubatorn i 15-30 minuter för att främja cellfästning på substratet.
- Kontrollera i mikroskopet om det finns tillräckligt med celler i kamrarna. Om fler behövs, upprepa steg 2.4 och 2.5.
- Tillsätt 50 μL NBM till de två övre brunnarna i den enda populationen och 20 μL NBM i samma brunn som cellerna injicerades i multipelbefolkningsanordningen. Mediet sticker ut något för att bilda en positiv menisk, vilket ger brunnarna en muffins topp aspekt. Återigen, se figur 2a .
- Underhålla cellerna vid 37 ° C, 5% CO2 och 95% fuktighet.
3. Behåll Neuronalkulturerna
- Ta bort NBM (cirka 30 μL med pipett) från cellerna och applicera ny förvärmd NBM dagen efter introduktionen av enheterna (det vill säga 1 d efter steg 2).
- Kontrollera varannan dag om det finns tillräckligt med medium i varje kanal. Om muffinen tOp är låg, lägg bara till mer medium till de övre brunnarna.
- Kulturceller i minst 7 d före avlägsnande av de mikrofluidiska anordningarna. Cellerna kan överleva i dessa enheter i flera veckor. Ta bort enheterna 1-2 dagar innan experiment utförs på prov.
4. Avlägsnande av mikrofluidiska enheter
- 1 - 2 d före avlägsnande av mikrofluidiska enheter, tillsätt 2 ml NBM förvärmd till 37 ° C till varje provrätt, översvämning av kamrarna och underhåll av enheterna i inkubatorn.
- Använd sterila pincett och ett tips för att avlägsna mikrofluidiska enheter från täckglasen och lämna en mönstrad konfiguration av neuroner. Använd spetsen för att hålla täckglaset på plats och pincettarna för att låsa enhetens kant längst ned i vänster hörn av brunnen. Applicera torsion noggrant, höj upp enheten med pincett så att den avskalar täckglaset. Se figur 2c - 2d .
- Var 2-3 dagar, ersätt haOm NBM tills provet används för experiment.
- Innan du utför omkopplingsexperiment på provet, verifiera att neuriter i de enskilda populationenhetskanalerna och neuronpopulationerna i multipelbefolkningsanordningen isoleras genom att undersöka mellanrummen mellan dem i mikroskopet för att säkerställa att det inte finns några filament som kopplar neuronpopulationer.
5. Förbereda PDL-belagda pärlor
- Tillsätt 2 x 50 μL droppar av antingen 4, 10 eller 20 μm polystyrenkulor utspädd i vatten (1: 500) till 1 ml PDL (100 μg / ml). Låt i minst 2 timmar vid rumstemperatur.
Obs! Protokollet kan pausas här och återupptas efterföljande dag. - Centrifugera lösningen vid 8 820 xg under 1 min. Ta försiktigt bort supernatanten utan att störa pärlorna som ackumuleras i behållarens botten.
- Tvätta pärlorna två gånger med 1 ml steril 10 mM HEPES pH 8,4-lösning.
- Resuspendera de PDL-belagda pärlorna i 200 ml 10 mM HEPES pH 8,4lösning.
6. Förbereda mikropipetter
- Förbered pipetter från glaskapillärrör (1 mm inre diameter, 1,5 mm yttre diameter) med hjälp av en horisontell elektroddragare. Justera inställningarna så att den yttre spetsen på den drabbade mikropipetten är ~ 2-5 μm. Innan du drar, se till att glasrören är rena.
- Fixera pipetter till glasskivor för lagring och se till att spetsen inte kommer i kontakt med glidytans yta eftersom spetsen är ömtålig. Förvara vid rumstemperatur i en täckt behållare för att skydda mot damm. Använd pipetter samma dag som de dras.
7. PDL-pärla vidhäftning till neuroner
- Tillsätt 40-60 μl PDL-belagda pärlor framställda i steg 5 till en cellodling framställd i steg 4. Centrera pipettspetsen över neuronerna, som är svagt synliga på täckglaset och tillsätt pärlorna (se figur 3 ).
- Returnera provet till inkubatorn i 1 h för att främja bildandet av syNaptiska kontakter 8 , 9 .
- Efter inkuberingen avlägsna eventuella ohäftade pärlor genom att tvätta kulturen försiktigt med förvärmd NBM.
8. Förberedelse av fysiologisk saltlösning (för rumstemperaturexperiment)
- Förbered fysiologisk saltlösning genom att kombinera ingredienserna som anges i referenser 7 , 8 . Detta är att reglera cellmiljön utanför inkubatorn.
- Verifiera osmolaritet och pH-nivåer som angivits i referenser 7 , 8 .
- Fortsätt infusera lösningen med O2 för att minimera pH-fluktuationer medan du utför experiment.
- Värm till rumstemperatur.
- Ställ in perfusionssystemet genom att infoga en ände av ett plaströr (valfria dimensioner) i O 2 -inficerad fysiologisk lösning och fixera den andra eNd till en nål insatt i provhållaren. Placera slangen och lösningen högre än provet (se bild 4 ).
- Koppla ur röret från nålen och anslut det till en spruta. Använd sprutan för att utöva tryck och dra vätska, fyll på röret. Tätning med en rullklämma och återanslutning av nålen.
9. Bead Micromanipulation
- Installera prov i en experimentell inställning så att celler kan nås från ovan av två mikropipetter monterade i mikromekanipulatorer och åtkomligt optiskt nedan, till exempel med 40X-fas-målet (numerisk bländare på 0,6) av ett inverterat optiskt mikroskop. Montera i denna konfiguration en CCD-kamera för bildupptagning på mikroskopets sidoport. Anslut varje pipett till 1 ml sprutor via plaströr. Vid detta steg ersätt NBM med fysiologisk saltlösning (1-2 ml) (se figur 4 ).
- Under experiKontinuerliga perfusionsceller med den fysiologiska saltlösningen framställd i steg 8 med en hastighet av 0,5-1 ml / min.
- Välj en PDL-pärla Ej ansluten till en neuron i synfältet. Rikta pärlan med en mikropipettspets genom att fokusera på pärlan och sedan upp till mikropipetten. Ta spetsen ner så nära som möjligt till pärlan genom att övervaka den genom mikroskopet.
- Applicera negativt tryck med 1 ml sprutan ansluten till pipetten för att plocka upp pärlan. Behåll negativt tryck under experimentet.
10. Dra ut Neurites
- Välj en PDL-pärla fäst vid en neuron i synfältet och fäst den med den andra mikropipetten med sug enligt beskrivningen i steg 9.3-9.4.
- Dra PDL-pärl-neuronkomplexet långsamt (~ 0,5 μm / min) som rör antingen mikromekanipulatorn eller provsteget med 1 μm och paus i 5 min för att möjliggöra neuritinitiering.
- Upprepa steg 10.2 två gånger.
Obs! Den första 3 &# 181; m måste dras mycket långsamt för att garantera experimentell framgång, vilket sker över 95% av tiden. - Dra PDL-pärl-neuronkomplexet långsamt (~ 0,5 μm / min) som rör antingen mikromekanipulatorn eller provsteget med 2 μm och paus i 5 min för att tillåta neuritöjning.
- Efter framgångsrik initiering och neuritillägg för de första 5 μmna drar du neuriten vid 20 μm / min över avstånd från millimeterskala.
Obs: Dragning kan utföras kontinuerligt eller i steg och i varierande takt. Se figur 5b -5c .
11. Anslutande neuroner
- Välj en region rik på neuriter och sänk PDL-pärl-neuritkomplexet så att det fysiskt kommer i kontakt med det. Använd andra pärlor för att mäta spetshöjden ovanför täckglasytan. Se figur 5d .
- Lämna PDL-pärl-neuritkomplexet i kontakt med målneuriten medan man manipulerar den andra mikropiPette. Sänk den andra pipetten med den andra PDL-pärlan ovanpå den nybildade neuriten ca 20 pm bilda den första pärlan. Använd den andra PDL-pärlan för att trycka det nya neuritfilamentet mot målcellen.
- Håll båda pärlorna på plats i minst 1 h. Bekräfta frånvaron av fokal svullnad, en förtjockning av neuriterna som kontaktar pärlan, med mikroskopet 16 .
- Under denna tid använder du perfusion för att långsamt byta provets medium från fysiologisk saltlösning till förvärmd, CO2-ekvibrerad NBM.
- Släpp pärlan från den andra pipetten genom att släppa suget. Om den nya neuriten förblir fäst släpp också den första pärlan. Se figur 5e .
- Ta försiktigt av saltlösning och byt ut med NBM (~ 2 ml).
- Placera provet försiktigt tillbaka i inkubatorn för att stärka neuronförbindelsen för framtida experiment. Denna anslutning är stabil för> 24 h 7
12. Verifiering av den nya anslutningens funktionalitet via helpluggsparametrar
- Följ referenser 7 , 18 , 19 . Att montera en elektrofysiologiska inställning.
- Följ referenser 7 . Att förbereda pre- och postsynaptiska elektroderna.
- Samla patch clamp data, igen efter referenser 18 , 19 .
- Jämför resultaten med naturligt förekommande signaler 7 för att bestämma anslutningstypen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hippokampala neuroner i embryonala råttor odlas i mikrofluidiska anordningar för att möjliggöra exakt positionering av celler, PDL-pärlor och mikromekanipulatorer. Det första steget är att korrekt montera den mikrofluidiska enheten på en glasskyddsglas eller skål. Det är viktigt att den mikrofluidiska enheten är väl fastsatt på substratet för att undvika att celler lämnar kamrarna och rör sig under de delar av enheten som ska förseglas ( figur 1a ). För att upprätthålla friska odlingar i flera veckor är det viktigt att förhindra medelindunstning genom att kontrollera cellmediet var 2-3 dagar och bevara en positiv menisk med medium ( Figur 2a ). Medium evaporation undviks också genom att hålla båda cellerna och en öppen maträtt inne i en större tallrik ( Figur 2b ). De mikrofluidiska anordningarna kan avlägsnas när som helst. För optimala resultat bör NBM läggas till cell-deStyrsystem minst 1 d före borttagning av apparat. Detta minimerar cellulär stress eftersom neuronerna är i kontakt med medium vid ideell temperatur och pH när enheterna tas bort. När de mikrofluidiska enheterna långsamt avskalas av skålen ( Figur 2c Och 2d ) celler kommer att förbli i det mönstrade läget ( Figur 3 och Figur 5a ).
Två typer av mikrofluidiska enheter används: Neuro Device och Co-Culture Device. Den första möjliggör enkelt identifiering av axoner, dendriter och cellkroppar. Soma förblir i toppkammaren medan axoner och dendriter växer längs de mikrofluidiska kanalerna ( Figur 5a ) mot axonalkammaren.
Det rekommenderas att PDL-pärlor läggs till celler i ett förhållande av 10: 1 och att de flesta pärlor som haHar inte följt kulturen avlägsnas genom att tvätta cellerna en gång med NBM efter 1 timmars inkubation ( Figur 3 ). Efter PDL-pärlahäftning till neuriter dras PDL-pärl-neuritkomplexet och kan förlängas över stora avstånd. Den nybildade neuriten kan vara exakt kopplad till neuriter eller soma millimeter borta ( Figur 5b -5e ). Succesfrekvensen för att dra en ny neurit för de första 3 μm vid hastigheter lägre än 1 μm / min är> 95% (n = 206). Succesfrekvensen för att ansluta den nya neuriten till en annan cell är 70% (n = 30). Anslutningen är väldigt ömtålig under de första 18 timmarna, främst på grund av att den nya neuriten är en filament med mindre än 1 μm i diameter förankrad av en 10 μm PDL-pärla. Om skålen rör sig snabbt under de första kontakterna, kan den resulterande turbulensen av mediet orsaka att pärlan rullar och följaktligen vidhäftningen förloras. Men om provet inte är shaKen, i 30 min fästs pärlan på neuriterna på skålen och den nya förbindelsen är kvar i minst 48 timmar. Se figur 4 för en schematisk inställning.
PDL-pärlpositionen på kulturen kan också användas för att enkelt identifiera placeringen av den anslutna neuriten (figurerna 6d-6e ). Efter initiering används förlängning och anslutning av en ny neurit, en andra, icke-vidhäftande PDL-pärla, uppsamlad via mikromekanipulatorn, för att skapa en andra vidhäftningsplats mellan den initierade neuriten och den andra neuronala populationen. Den andra PDL-pärlan placeras ovanpå den nya neuriten, komprimerar den så att den nya neuriten bara kommer i kontakt med den andra neuronala populationen 11 . Detta kommer att främja adhesion med den andra neuronala populationen ( Figur 5f ).
Den multipla befolkningsenheten enabLes tillväxten av 4 isolerade neuronpopulationer på samma maträtt. Varje neuronpopulation är begränsad till en 4 x 7 mm rektangel separerad från andra neuronpopulationer med 100 eller 200 pm gap ( Figur 6a ). Friska neuroner kan växa inuti enheterna i flera veckor. Vanligtvis förblir neuronpopulationerna isolerade upp till 48 timmar efter avlägsnande av anordningen. Efter denna 48 h-period tenderar neuroner att växa till närliggande neuronpopulationer och bilda naturliga samband. Innan du kopplar samman två isolerade populationer, bör det verifieras att populationerna verkligen är isolerade genom att undersöka hela klyftan med mikroskopet för att fastställa att det inte finns någon länk mellan de två neuronpopulationerna ( Figur 6b ).
Efter anslutning inkuberades prover i 24 h och elektriska helcellsparade patch-kläminspelningar genomfördes för att undersöka om det nyligenFormad neurit som användes för att ansluta två isolerade neuronpopulationer var funktionell och kunna överföra elektriska signaler. En neuron i populationen en, lokaliserad mindre än 100 pm radius från den plats där den inducerade neuriten initierades, valdes för att registrera presynaptiska åtgärdspotentialer (PAP). Denna neuron betraktades som den presynaptiska cellen. Postsynaptisk excitatorisk eller hämmande aktivitet registrerades från en neuron i befolkningen två på den andra sidan av klyftan, belägen i mindre än 100 pm radien hos den mikromanipulerade anslutningen ( Figur 7a- 7c ). Inspelningar härledda från de mekaniskt inducerade förbindelserna analyserades och jämfördes med de från naturligt kopplade neuronpopulationer och icke-kopplade populationer ( Figur 7 ). De elektriska svaren efter PAP som registrerats från neuroner kopplade naturligt och genom mikromanipulation är signifikant högre och temporärt korrelerade med presynaptiskaAktivitet ( Figur 7 ).
Figur 1: Standardisering av neuronala kulturer med användning av mikrofluidiska enheter 7 . ( A ) Enhetskonstruktion: När de mikrofluidiska anordningarna är korrekt monterade på en torr yta är alla kamrar synliga. ( B ) Cellplätering: Placera cellerna högst upp till höger och cellerna ska röra sig mot vänster brunn. C ) Celltäthet: Strax efter plätering, kolla in mikroskopet om koncentrationen av celler är tillräcklig. ( D ) Efter 1 d i odlingen hålls hippocampala neuroner väl nära mikrokanalerna och börjar bilda neuriter. Vänligen klicka här för att se en stor Er version av denna figur.
Figur 2 : Underhåll av friska neuronkulturer i flera veckor 7 . ( A ) Lägg till medium varje 2-3 d och håll en positiv menisk i de övre brunnarna i de mikrofluidiska kamrarna så att cellerna kommer att få en konstant tillförsel av näringsämnen. ( B ) Förvara cellerna inuti en större tallrik med en disk som innehåller vatten för att minska medelindunstningen. ( C ) Använd sterilt tips och pincett för att ( d ) enkelt avlägsna mikrovågorna. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
P_upload / 55697 / 55697fig3.jpg "/>
Figur 3 : Placering av pipett Deponering av pärlor i kulturer. När den mikrofluidiska enheten har tagits bort är neuroner synliga på täckglaset. När du lägger på pärlor, placera pipettspetsen så att den ligger i mitten av cellerna. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Schematisk av en typisk Neurite-pulling-uppställning. Provet vilar på ett (piezoaktiverat) steg och kan nås från ovan med 2 mikropipetter hållna i mikromekanipulatorer och anslutna till 1 ml sprutor via plaströr. Provet öppnas optiskt underifrån med ett mål som är kopplat till en CCD-kamera som skickarS bilder till en CPU. Ett inloppsrör matar syresatt fysiologisk saltlösning till provet, som vilar under det, och ett utloppsrör anslutet till en spruta möjliggör uttag av lösning vid överflöde. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5 : PDL-pärladhesion till neuroner och pipettmikromanipulation 7 . ( A ) Neuroner förblir organiserad i mönster efter avlägsnande av mikrofluidiska kamrar som möjliggör enkel identifiering av soma och neuriter. ( B ) Micromanipulation av PDL-pärlor vidhäftade till neuriter möjliggör neuritinitiering, förlängning ( c ) och anslutning ( d ),Följt av frisättning av PDL-pärlan från pipetten ( e ). ( F ) Efter att ha kontaktat två isolerade neuronpopulationer (nedre pilen) används en andra PDL-pärla och pipettmikromanipulator (topppil) för att etablera en andra vidhäftningspunkt, några hundra mikroner från varandra, bilda den första kontaktpunkten och garantera funktionell anslutningar. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6 . Initiering, förlängning och anslutning av nya neurur för att ansluta två isolerade populationer med hjälp av flera befolkningsenheter och mikromanipulation 7 . ( A ) Anordningen isolerar 4 neuronpopulationerMellan 3 luckor på 100 eller 200 μm vardera. ( B ) Efter avlägsnande av anordningen väljer du ett mellanrum och intygar att inga neuriter ansluter de två individuella populationerna. ( C ) Schematisk av experimentuppsättning som ska vara synlig i det optiska mikroskopet, indikerar positionen för två mikropipetter och närvaron av PDL-belagda pärlor. ( D ) Genom att applicera negativt tryck på en pipett dras en PDL-pärla adhererad till en neuronal population med pipettspetsen och initierar därigenom en ny neurit. Genom att bibehålla det negativa trycket i pipetten kan PDL-pärl-neuritkomplexet (grönt) dras, förlänga neuriten. ( E ) Pipettmikromomanipulationen leder till förlängning av den nya neuriten över gapet och bildandet av en anslutning till en ny neuronal population. För att säkerställa vidhäftningen av den nya neuriten till den andra populationen placeras en PDL-pärla (röd) med en andra pipett ovanpå både textrad neurit och neuroNalbefolkningen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: Den nyligen inducerade, långsträckta och anslutna neuronen kan överföra information mellan två isolerade neuronpopulationer 7 . Isolerade neuronpopulationer odlades separerade med ett 100 | im gap i PDMS-mikrodevices. Paired patch clamp inspelningar utfördes i helcells konfiguration från en neuron i populationen en och en neuron i befolkningen två (på andra sidan av gapet) när de två populationerna var anslutna genom mekanisk manipulation ( a ), tillåtet att naturligt koppla samman över Gapet ( b ) eller förbli inte anslutet av maintAining gapet ( c ). Representativa spår av parade inspelningar visas för varje tillstånd ( df ). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Med hjälp av standard mikromanipulation och innovativa mikrofluidiska anordningar utvecklades en ny teknik för att snabbt initiera, förlänga och exakt ansluta nya funktionella neuronkretsar över stora avstånd. Pipettmikromanipulation är ett vanligt verktyg i de flesta neurovetenskapslaboratorierna 4 , 13 . Den verkliga utmaningen att uppnå reproducerbara och tillförlitliga resultat var standardisering av friska, exakt positionerade neuronkulturer under experimentets varaktighet (som kan vara i storleksordningen veckor) genom utveckling av mikrofluidiska anordningar för att organisera cellkulturer med mikrometerprecision. Högkvalitativa cellkulturer är hörnstenen för datavalidering. Detta bidrar till enklare och snabbare mikroskopi avbildning och standardisering av kulturer och resultat. De mikrofluidiska anordningarna utformades för att odla celler in vitro med liknande organisation som in vivo . Singelpopulationen möjliggörTillväxten av långa neuriter och lätt identifiering av axoner, neuriter och soma. Antalet celler som pläteras i de mikrofluidiska kamrarna bestämmer neurontätheten. Därför, genom att plätera färre celler per enhet är det lätt att identifiera enkla neuroner nära kanalerna. Axonen och flera dendriter av en enda neuron växer inuti en kanal. Dendriter växer minst 5 gånger långsammare än axonerna 6 , 17 och efter 2-3 veckor in vitro är deras tillväxt i kanalerna vanligtvis begränsad till 200 μm medan snabbt växande axoner kan nå över 2 mm 17 . Därför är det relativt lätt att uppskatta huruvida pärlorna är vidhäftande till axoner eller axoner och dendriter ( Figur 5b - 5f ), efter att ha tillsatts PDL-pärlor till proverna. Det finns högre chanser att dra nya axoner och dendriter när man drar PDL-pärlorna fästa vid neuriter kortare än 200 μm, whIle finns det större chanser att dra bara nya axoner när man drar PDL-pärlor fästa vid neuriter längre än 500 μm. Multiplikationsanordningen är användbar för reproducerbar tillväxt av friska separerade populationer under flera veckor. Detta system av kanaler är användbart för att studera upp till 4 olika celltyper eller jämföra samma celler med olika behandlingar.
Dessutom ger en kontrollerad och reproducerbar cellodlingsmiljö en idealisk ram för cellanalys och manipulation. Precis positionering av celler på en skål underlättar identifiering av intressanta regioner såväl som orientering och navigering genom dessa områden av intresse som i slutändan möjliggör en aldrig tidigare skådad kontroll över neuritinitiativet. En kontrollerad cellfördelning gör det lättare att visualisera den nybildade anslutningen och mycket snabbare för att hitta den nya anslutningen med mikroskopet på dagen efter inkubation. Dessutom reproducerbara konfigurationer av cellerMöjliggöra enkel och exakt placering av kemiska signaler, såsom PDL-belagda pärlor, på soma, dendrit eller axon 8 . Tillsammans bildas och analyseras celler som odlas i mikrofluidiska enheter snabbare på grund av standard cellulär organisation reproducerad i alla rätter. Vidare är anordningarna gjorda av biokompatibelt, transparent och avtagbart material, vilket möjliggör avbildning vid alla synliga våglängder och cellöverlevnad inuti enheterna i flera veckor. Miniatyrisering av cellulära analyser hjälper också till att samla mer data med färre celler. Lågvolymen av mikrofluidiska enheter minskar antalet celler som behövs per experiment och ökar experimentell effekt. Till exempel, istället för att spendera flera timmar att söka med ett mikroskop för kanske 1 eller 2 isolerade axoner i en maträtt, kan den enkla populationen användas för att omedelbart få tillgång till över 100 isolerade axoner per cellprov. De mikrofluidiska enheterna erbjuder en miniatyriserad pålitlig och kontrolleradCellodlingsmiljö som gynnar analysen av sällsynta prover med tiden för att utföra flera test.
Potentiella variationer av tekniken innefattar direkt anslutning av pärlan till mikropipetten. I det nuvarande protokollet beskrivs en metod för att fästa pärlan till spetsen via sugning, men pärlan kan också limmas till spetsen. Lim är det bättre alternativet om en mycket stabil koppling mellan spetsen och pärlan är önskvärd, till exempel om kraftmätningar görs med pipetten som sensor eller om undersökning av vidhäftning mellan PDL och neurit är det huvudsakliga experimentella målet. I en annan ven är suget fördelaktigt, eftersom det tillåter frisättning av pärlan efter placering utan att avskilja neurit-pärlekomplexet så att flera kopplingar kan göras parallellt. Sugning ger medel för genomströmningsförsök med hög genomströmning, en förbättring jämfört med andra manipulationstekniker, såsom atomkraftmikroskopi (AFM) 7 </ Sup> , 16 . Båda modifieringarna av denna metod medger att neuritinitiationsstället väljs genom att helt enkelt upprätthålla en vulst i kontakt med en dendrit så att synapser bildas. Strategin att inkubera flera pärlor, såsom beskrivs i steg 7, sparar emellertid tid vid manipuleringssteget och rekommenderas om exakt kontroll över initieringsstället är onödigt i experimentet.
Framtida forskning kan sträva efter att ta itu med olika instrumentella begränsningar, nämligen temperaturkontroll och provtillgänglighet. Mekaniska egenskaper hos det cellulära membranet kan variera väsentligt vid olika temperaturer 27 . Helst bör alla experiment utföras vid 37 ° C i neuronmedium och adekvata förhållanden (korrekta CO 2 -tryck och fuktkontroller). Det var emellertid inte möjligt att använda en inkubator med sluten cell, eftersom åtkomst till proverna från toppen krävs för mikromanipulatorerna, frånBotten för mikroskop och från sidan för att flytta scenen. Därför användes perfusion vid rumstemperatur. På liknande sätt, eftersom uppställningen endast har tillräckligt med utrymme för att rymma 2 mikromonipulatorer och det tar nästan 1 h att upprätta en enda anslutning, finns det en gräns för hur många experiment man kan utföra. Denna fråga kan lösas med en manipulator som drar mer än en pärla åt gången. En annan potentiell förbättring av detta protokoll är förmågan att registrera höjden av pärlpipettkomplexet från provytan. Oförmågan att göra detta kan leda till imprecisions när man sätter ner den andra pärlan och placerar den på den inducerade neuriten för att fixa den. Pärlan sänks ovanpå den nya neuriten i en neuritrik region tills den nya neuriten och de på skålen ligger i samma fokalplan. Den nya neuriten ligger aldrig mellan pärlan och skålen, men alltid mellan en kudde av cellmaterial och pärlan, därför är kompressionen minskad. Dessutom,Den nya neuriten observeras i 10 minuter i mikroskopet för att utvärdera om neurit-fokal svullnad bildas nära pärlan. Såsom beskrivs i referens 16 indikerar närvaron av svullnader neurit degenerering. Eftersom tillämpningen av varierande mängder tryck på axoner kan leda till fysiologiska förändringar 16 kan framtida forskning dock fokusera på att anpassa pipettsonderna genom att fixera reflektorer till dem och övervaka förskjutningen vinkelrätt mot provytan med AFM-metoder. Slutligen kanske den största utmaningen för detta protokoll är att testa funktionaliteten hos den manipulerade anslutningen. Den mest direkta, tillförlitliga och väletablerade tekniken är kopplade ihop med fullcellsplastklemmer. Det är emellertid mycket lågt (<25% Hela cellplåstret har flera nackdelar, inklusive lång uppsättningstid, begränsat antal experiment / dag, begränsad inspelningstid (~ 30Min), lågt experimentellt utbyte för parade patch-kläminspelningar och celldöd efter mätningar. På grund av dessa tekniska utmaningar är det experimentella utbytet av helcellsplåstringsparrerade inspelningar efter mikromanipulation mycket låg. Bättre plattformar och tekniker behövs för att mer exakt stimulera, registrera och jämföra neuronaktivitet i naturliga och mikromanipulerade anslutningar.
Betydelsen av spänning i axonal tillväxt har varit känd sedan de tidiga dagarna av neuroanatomi - med hänvisning till den som passiv sträckning 20 . Under tidig embryonal utveckling migrerar neuriterna genom små avstånd för att nå sina mål. Eftersom de flesta celler delar upp och dubbleras, utsätts axoner för kontinuerliga krafter för att förlänga och anpassa sin längd till embryonal tillväxt 20 , 21 . Flera grupper har försökt att testa gränserna för neuritillväxt genom att använda kemiska signaler och / eller mekanisk spänning till neuRons (för granskning se referens 22 ). I dessa rapporter 23 , 24 , 25 , 26 såväl som under fysiologisk tillväxt dras neuriterna medan de är fästa vid ett substrat. Den stora skillnaden i vår setup är att i den nuvarande tekniken har de nya neuriterna bara två vidhäftningskontakter; Vid basen är neuriten kopplad till neuronen och vid toppen är nerven fäst vid pärlan. Under förlängningen har komponenterna i den nya neuriten friheten att sprida sig på det mest effektiva sättet för att rymma dragkrafterna. Ännu viktigare beskriver detta protokoll hur man reproducerar dessa experiment utan att orsaka neuritbrott eller degenerering, baserat på tidigare studier om bildandet av synaptiska kontakter 8 och på axonsmotståndet mot tryck 16 som visar hur man använder mikro- och nanotoler tillDra kontinuerligt neuriterna med lämplig kraft. De neuritilläggshastigheter som beskrivs här (1,2 mm / h) är 30-60 gånger snabbare än in vivo- hastigheterna för de snabbast växande axonerna från det perifera nervsystemet (0,02 till 0,04 mm / h) 28 . Vid jämförelse med samma neuronaltyp in vitro är de axonala förlängningshastigheter som beskrivs här 7,5 gånger snabbare än de tillväxthastigheter som beskrivits av andra författare vid ett tidigare utvecklingsstadium (0,1 mm / h) 4 . Olika typer av neuroner har visat sig förlänga axoner vid olika inneboende hastigheter som varierar med flera gånger 29 . Dessutom förlorar axeln i centrala nervsystemet vanligtvis den höga axonala tillväxten efter målinventering in vivo 29 och 3 d av kulturen in vitro 6 . Därför bör den nuvarande axonala förlängningstekniken testas med olika neurontyper för att bättre förstå thE gränser för neuritillägget.
Pipettmikromanipulering och mikrofluidiska anordningar är tekniker som demonstreras för att skapa nya funktionella neuriter och att styrbart placera eller (re) leda neuronala nätverk. Denna plattform är idealisk för systematiska, standardiserade mätningar. Det introducerar reproducerbarhet och in vivo kontroll i experiment på komplexa nätverk av neuroner. Förlängningsgraden som uppnåtts är snabbare än 20 μm / min över avstånd från millimeterskala och funktionella anslutningar upprättas. Dessa resultat visar oväntat att den inre kapaciteten hos axon för förlängning, inklusive den hos deras cytoskeletalkomponenter, är mycket snabbare än tidigare tanke 10 , 11 , 12 . Detta föreslagna mekaniska tillvägagångssätt förbi långsamma kemiska strategier och representerar således ett paradigmskifte för terapeutisk utveckling för att återställa neuronal anslutning efter skadaOch för mikro-neuroengineering av artificiella neurala nätverk för deras kontrollerade studie in vitro . Dessa resultat har också en stor inverkan på regenerativ medicin och neuroteknisk tillvägagångssätt med direkt inblandning för terapier som syftar till att återansluta neuronala kretsar efter trauma eller i neurodegenerativa sjukdomar. Denna plattform öppnar dörren för att erhålla data om neuronkommunikation, signalmodulation samt tillväxt och regenerering. Det är ett nytt sätt att mekaniskt regenerera CNS och liknande tekniker kan möjliggöra återställande av funktion efter skada. Vidare kan denna teknik användas för att skapa systematiskt konstruerade neuronala nätverk som nya bioassay-plattformar för läkemedelsupptäckt och målvalidering. Det är en föregångare till de direkta ledningarna för robusta hjärnmaskingränssnitt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författaren Margaret H Magdesian är VD för Ananda Devices som producerar instrument som används i denna artikel.
Acknowledgments
Vi vill tacka Yoichi Miyahara för många användbara diskussioner och insikter. MA och PG bekräftar finansiering från NSERC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Co-culture devices | Ananda Devices | Commercially available at http://www.anandadevices.com | |
| Neuro devices | Ananda Devices | Commercially available at http://www.anandadevices.com | |
| No. 1 Glass Coverslip 25 mm Round | Warner Instruments | 64-0705 | |
| 35 mm Glass Bottom Dishes #0, Uncoated, Gamma-Irradiated | MatTex Incorporation | P35G-0-20-C | |
| 35 mm cell culture dish, Non-Pyrogenic, Sterile | Corning Inc | 430165 | |
| 95 mm x 15 mm Petri Dish, Slippable Lid, Sterile Polystyrene | Fisherbrand | FB0875714G | |
| 50 mL Centrifuge tubes with printed graduations and flat caps | VWR | 89039-656 | |
| 15 mL Polypropylene Conical Tube, 17 x 120 mm style, Non Pyrogenic, Sterile | Falcon | 352097 | |
| Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103-049 | Extracellular solution |
| B-27 Supplement (50X), serum free | B-27 Supplement (50X), serum free | 17504044 | Extracellular solution |
| Pennicilin, Streptomyocin, Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11995-065 | Extracellular solution |
| 200 μ L Pipettors | VWR | 89079-458 | |
| 2 - 20 μL Pipettors | Aerosol Resistant Tips | 2149P | |
| BD Falcon 3mL Transfer Pipettes [Non-sterile] | BD Falcon | 357524 | |
| Glucose | Gibco | 15023-021 | Extracellular solution |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | Extracellular solution/Beads |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | Extracellular solution |
| KCl | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | Extracellular solution |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | Extracellular solution |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | Extracellular solution |
| #5 Dumont Dumostar Tweezers 11 cm | World Precision Instruments | 500233 | |
| Dissection tools | Braun, Aesculap | ||
| Poly-D-lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P6407 | |
| Micro particles based on polystyrene, 10 μm | Sigma-Aldrich | 72986 | |
| Borosilicate tubes | King Precision Glass, Inc. | 14696-2 | |
| Horizontal Pipette Puller | Sutter Instruments | Brown-Flaming P-97 | |
| Micromanipulators, PCS-5000 Series | SD Instruments | MC7600R | |
| 1 mL Syringe | BD Luer-Lok | 309628 | |
| Inverted Microscope | Olympus | IX71 | |
| Objective | Olympus | UIS2, LUCPLFLN 40X | |
| CCD Camera | Photometrics | Cascade II: 512 | |
| Leibovitz's (1x) L-15 Medium | Life Technologies | 11415-064 | Rat Dissection |
| Typsin-EDTA (0.05%), Phenol red | Life Technologies | 25300054 | Rat Dissection |
| DMEM (1x) Dulbecco's Modified Eagle Medium [+4.5 g/L D-Glucose, + L-Glutamine, + 110 mg/L Sodium Pyruvate] | Life Technologies | 11995-065 | Rat Dissection |
| HBSS (1x) Hank's Balanced Salt Solution [- Calcium Chloride, - Magnesium Chloride, - Magnesium Sulfate] | Life Technologies | 14170-112 | Rat Dissection |
References
- Chew, D. J., Fawcett, J. W., Andrews, M. R. The challenges of long-distance axon regeneration in the injured CNS. Prog. Brain. Res. 201, 253-294 (2012).
- Bradke, F., Fawcett, J. W., Spira, M. E. Assembly of a new growth cone after axotomy: the precursor to axon regeneration. Nat. Rev. Neurosci. 13 (4), 189-193 (2012).
- Aguayo, A. J., et al. Synaptic connections made by axons regenerating in the central nervous system of adult mammals. J. Exp. Biol. 153, 199-224 (1990).
- Lamoureux, P., Ruthel, G., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Mechanical tension can specify axonal fate in hippocampal neurons. J Cell Biol. 159 (3), 499-508 (2002).
- Goslin, K., Banker, G. Experimental observations on the development of polarity by hippocampal neurons in culture. J Cell Biol. 108 (4), 1507-1516 (1989).
- Dotti, C. G., Sullivan, C. A., Banker, G. A. The Establishment of polarity by hippocampal neurons in culture. J. Neurosci. 8 (4), 1454-1468 (1988).
- Magdesian, M. H., et al. Rapid mechanically controlled rewiring of neuronal circuits. J. Neurosci. 36 (3), 979-987 (2016).
- Lucido, A. L., et al. Rapid assembly of functional presynaptic boutons triggered by adhesive contacts. J. Neurosci. 29 (40), 12449-12466 (2009).
- Suarez, F., Thostrup, P., Colman, D., Grutter, P. Dynamics of presynaptic protein recruitment induced by local presentation of artificial adhesive contacts. Dev. Neurobiol. 73, 1123-1133 (2013).
- General Laboratory Techniques. An Introduction to Working in the Hood. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. https://www.jove.com/science-education/5036/an-introduction-to-working-in-the-hood (2016).
- Strober, W.
- Beaudoin, G. M. 3rd, et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nat. Protoc. 7 (9), 1741-1754 (2012).
- Bray, D. Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension. Dev. Biol. 102, 379-389 (1984).
- Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Axonal outgrowth of cultured neurons is not limited by growth cone competition. J. Cell Sci. 111, 3245-3252 (1998).
- Pfister, B. J., Bonislawski, D. P., Smith, D. H., Cohen, A. S. Sketch-grown axons retain the ability to transmit active electrical signals. FEBS Lett. 580, 3525-3531 (2006).
- Magdesian, M. H., et al. Atomic force microscopy reveals important differences in axonal resistance to injury. Biophys. J. 103 (3), 405-414 (2012).
- Polleux, F., Snider, W. Initiating and growing an axon. CSH Persp. Biol. 2 (4), 001925 (2010).
- Debanne, D., et al. Paired-recordings from synaptically coupled corticol and hippocampal neurons in acute and cultured brain slices. Nat. Protoc. 3, 1559-1568 (2008).
- Qi, G., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings. J. Vis. Exp. (95), e52358 (2015).
- Harrison, R. G. On the origin and development of the nervous system studied by the methods of experimental embryology. Proc. R. Soc. Lond. B. , 155-196 (1935).
- Weiss, P. Nerve patterns: the mechanics of nerve growth. Growth 5 (Suppl. Third Growth Symposium). , 153-203 (1941).
- Gray, C., et al. Rapid neural growth: calcitonin gene-related peptide and substance P-containing nerves attain exceptional growth rates in regenerating deer antler. Neurosci. 50 (4), 953-963 (1992).
- Heidemann, S. R., Bray, D. Tension-driven axon assembly: a possible mechanism. Front. Cell Neurosci. 9, (2015).
- Bray, D. Axonal growth in response to experimentally applied tension. Dev. Biol. 102, 379-389 (1984).
- Heidemann, S. R., Buxbaum, R. E. Mechanical tension as a regulator of axonal development. Neurotoxicology. 15, 95-107 (1994).
- Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E.
- Pfister, B. J., Iwata, A., Meaney, D. F., Smith, D. H. Extreme stretch growth of integrated axons. J. Neurosci. 24 (36), 7978-7983 (2004).
- Waxman, S. G., Kocsis, J. D. The axon: structure, function and pathophysiology. , Oxford University Press, USA. (1995).
- Cho, E. Y., So, K. F. Rate of regrowth of damaged retinal ganglion cell axons regenerating in a peripheral nerve graft in adult hamsters. Brain Res. 419, 369-374 (1987).
- Davies, A. M. Intrinsic differences in the growth rate of early nerve fibres related to target distance. Nature. 337, 553-555 (1989).
