Rewiring Neuronal Circuits: Un Nuevo Método Para La Extensión Neurítica Rápida Y La Conexión Neuronal Funcional
Summary
Este procedimiento describe cómo iniciar, extender y conectar rápidamente neuritas organizadas en cámaras microfluídicas usando perlas revestidas con poli-D-lisina fijadas a micropipetas que guían la elongación de las neuritas.
Abstract
Las lesiones cerebrales y de la médula espinal pueden conducir a una incapacidad permanente ya la muerte porque todavía no es posible regenerar las neuronas a largas distancias y reconectarlas con precisión con un objetivo apropiado. Aquí se describe un procedimiento para iniciar rápidamente, alargar y conectar con precisión nuevos circuitos neuronales funcionales a largas distancias. Las velocidades de extensión alcanzadas alcanzan más de 1,2 mm / h, 30-60 veces más rápido que las tasas in vivo de los axones de crecimiento más rápido del sistema nervioso periférico (0,02 a 0,04 mm / h) 28 y 10 veces más rápido de lo que se informó anteriormente para el mismo Neuronal tipo en una etapa anterior de desarrollo [ 4] . En primer lugar, las poblaciones aisladas de las neuronas del hipocampo de rata se cultivan durante 2-3 semanas en dispositivos microfluídicos para posicionar con precisión las células, lo que facilita la micromanipulación y reproducibilidad experimental. A continuación, se colocan perlas recubiertas con poli-D-lisina (PDL) sobre neuritas para formar adhesivoActúa y la micromanipulación con pipeta se utiliza para mover el complejo perla-neurita resultante. A medida que se mueve el cordón, extrae una nueva neurita que puede extenderse a lo largo de cientos de micrómetros y conectarse funcionalmente a una célula diana en menos de 1 h. Este proceso permite la reproducibilidad experimental y la facilidad de manipulación mientras se evitan las estrategias químicas más lentas para inducir el crecimiento de las neuritas. Las medidas preliminares presentadas aquí demuestran una tasa de crecimiento neuronal muy superior a las fisiológicas. La combinación de estas innovaciones permite el establecimiento preciso de redes neuronales en la cultura con un grado de control sin precedentes. Es un método novedoso que abre la puerta a una plétora de información y conocimientos sobre la transmisión de señales y la comunicación dentro de la red neuronal, además de ser un campo de juego en el que explorar los límites del crecimiento neuronal. Las aplicaciones potenciales y los experimentos son generalizados con implicaciones directas para las terapias que apuntan a reconectar neuronaL después del trauma o en enfermedades neurodegenerativas.
Introduction
Las lesiones del sistema nervioso central (SNC) adulto pueden conducir a una discapacidad permanente debido a múltiples mecanismos que limitan el rebrote axonal 1 . Tras la lesión, muchos axones del SNC no forman un nuevo cono de crecimiento y no logran montar una respuesta regenerativa eficaz 2 . Además, el daño y el tejido cicatricial que rodea las lesiones del SNC inhiben significativamente el crecimiento axonal 1 , 2 , 3 . Las terapias actuales para promover la regeneración del SNC después de la lesión se han centrado en mejorar el potencial de crecimiento intrínseco de la neurona lesionada y en enmascarar los inhibidores de la extensión axonal asociados con restos de mielina y la cicatriz glial 1 , 3 . A pesar de esto, la capacidad de regenerar axones largos a objetivos distantes y formar sinapsis funcionales apropiadas permanece severamente limitada 4 , </suP> 5 , 6 , 7 .
En el presente trabajo, las microperlas, la micromanipulación con pipeta y los dispositivos microfluídicos se utilizan para iniciar, alargar y conectar con rapidez nuevos circuitos neuronales funcionales a largas distancias. Trabajos previos han demostrado que las perlas recubiertas con poli-D-lisina (PDL-perlas) inducen adhesión a la membrana seguido de la agrupación de complejos de vesículas sinápticas y la formación de boutons presinápticos funcionales [ 8] . También se demostró que cuando el PDL-perla es mecánicamente retirado después de la diferenciación presináptica, el grupo de proteínas sinápticas sigue el cordón, el inicio de una nueva neurita [ 9] . El siguiente procedimiento explora este hecho junto con la capacidad de cultivar las neuronas del hipocampo embrionarias de ratas en regiones organizadas en un cubreobjetos usando dispositivos microfluídicos de polidimetilsiloxano (PDMS) para volver a cablear precisamente una neuronacircuito.
Estos dispositivos microfluídicos PDMS son no tóxicos, ópticamente transparentes y consisten en dos cámaras conectadas por un sistema de microcanales. Una vez montados en un cubreobjetos, cada dispositivo sirve como molde para guiar el crecimiento neuronal y mantener cultivos neuronales sanos en patrones precisos durante más de 4 semanas in vitro .
Aquí, se presenta un marco en el que se investigan los límites de extensión y funcionalidad de la nueva neurita. Se crean neuritas nuevas y funcionales que se posicionan para controlar (re) alambre las redes neuronales. Las velocidades de extensión alcanzadas son más rápidas que 20 μm / min sobre distancias de escala milimétrica y se establecen conexiones funcionales. Estos resultados muestran, inesperadamente, que la capacidad intrínseca de estas neuritas para la elongación es mucho más rápida de lo que se pensaba anteriormente. Este enfoque mecánico propuesto ignora las estrategias químicas lentas y permite la conexión controlada a un objetivo específico. ThEs técnica abre nuevas vías para el estudio in vitro de nuevas terapias para restaurar la conectividad neuronal después de la lesión. También permite la manipulación y recableado de redes neuronales para investigar aspectos fundamentales del procesamiento de señales neuronales y la función neuronal in vitro .
Protocol
Representative Results
Discussion
Utilizando una micromanipulación estándar y dispositivos microfluídicos innovadores, se desarrolló una nueva técnica para iniciar rápidamente, alargar y conectar con precisión nuevos circuitos neuronales funcionales a grandes distancias. La micromanipulación con pipeta es una herramienta común en la mayoría de los laboratorios de neurociencia 4 , 13 . El verdadero desafío para lograr resultados reproducibles y confiables fue la estandarización de cul…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría dar las gracias a Yoichi Miyahara por muchas discusiones y puntos de vista útiles. MA y PG reconocen fondos del CRSNG.
Materials
| Co-culture devices | Ananda Devices | Commercially available at http://www.anandadevices.com | |
| Neuro devices | Ananda Devices | Commercially available at http://www.anandadevices.com | |
| No. 1 Glass Coverslip 25 mm Round | Warner Instruments | 64-0705 | |
| 35mm Glass Bottom Dishes #0, Uncoated, Gamma-Irradiated | MatTex Incorporation | P35G-0-20-C | |
| 35mm cell culture dish, Non-Pyrogenic, Sterile | Corning Inc | 430165 | |
| 95mmx15mm Petri Dish, Slippable Lid, Sterile Polystyrene | Fisherbrand | FB0875714G | |
| 50mL Centrifuge tubes with printed graduations and flat caps | VWR | 89039-656 | |
| 15mL Polypropylene Conical Tube, 17x120mm style, Non Pyrogenic, Sterile | Falcon | 352097 | |
| Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103-049 | Extracellular solution |
| B-27 Supplement (50X), serum free | B-27 Supplement (50X), serum free | 17504044 | Extracellular solution |
| Pennicilin, Streptomyocin, Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11995-065 | Extracellular solution |
| 200uL Pipettors | VWR | 89079-458 | |
| 2-20uL Pipettors | Aerosol Resistant Tips | 2149P | |
| BD Falcon 3mL Transfer Pipettes [Non-sterile] | BD Falcon | 357524 | |
| Glucose | Gibco | 15023-021 | Extracellular solution |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | Extracellular solution/Beads |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | Extracellular solution |
| KCl | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | Extracellular solution |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | Extracellular solution |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | Extracellular solution |
| #5 Dumont Dumostar Tweezers 11cm | World Precision Instruments | 500233 | |
| Dissection tools | Braun, Aesculap | ||
| Poly-D-lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P6407 | |
| Micro particles based on polystyrene, 10 um | Sigma-Aldrich | 72986 | |
| Borosilicate tubes | King Precision Glass, Inc. | 14696-2 | |
| Horizontal Pipette Puller | Sutter Instruments | Brown-Flaming P-97 | |
| Micromanipulators, PCS-5000 Series | SD Instruments | MC7600R | |
| 1 ml Syringe | BD Luer-Lok | 309628 | |
| Inverted Microscope | Olympus | IX71 | |
| Objective | Olympus | UIS2, LUCPLFLN 40X | |
| CCD Camera | Photometrics | Cascade II: 512 | |
| Leibovitz's (1x) L-15 Medium | Life Technologies | 11415-064 | Rat Dissection |
| Typsin-EDTA (0.05%), Phenol red | Life Technologies | 25300054 | Rat Dissection |
| DMEM (1x) Dulbecco's Modified Eagle Medium [+4.5 g/L D-Glucose, + L-Glutamine, + 110 mg/L Sodium Pyruvate] | Life Technologies | 11995-065 | Rat Dissection |
| HBSS (1x) Hank's Balanced Salt Solution [- Calcium Chloride, – Magnesium Chloride, – Magnesium Sulfate] | Life Technologies | 14170-112 | Rat Dissection |
References
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