Summary
この手順は、神経突起の伸長を誘導するマイクロピペットに固定されたポリ-D-リシン被覆ビーズを使用して、マイクロ流体チャンバーに組織化された神経突起を迅速に開始、伸長および連結する方法を記載する。
Abstract
脳および脊髄損傷は、長距離にわたってニューロンを再生し、それらを適切な標的に正確に再接続することが依然として不可能であるため、永久的な障害および死につながる可能性がある。ここでは、新しい機能的なニューロン回路を長距離にわたって迅速に開始、伸長、および正確に接続する手順が記載されている。達成された伸長速度は、末梢神経系からの最も速く成長する軸索のインビボ速度（0.02〜0.04mm / h）よりも30〜60倍速く1.2mm / hを超え、以前に報告されたものよりも10倍速い開発の初期段階でのニューロン型4 。第1に、ラット海馬ニューロンの単離された集団を、微小流体装置において2〜3週間増殖させ、細胞を正確に配置し、容易なマイクロマニピュレーションおよび実験的再現性を可能にする。次に、ポリ-D-リシン（PDL）で被覆されたビーズを神経突起上に置き、接着性contビーズ - 神経突起複合体を移動させるためにピペットマイクロマニピュレーションを使用する。ビーズを動かすと、数百マイクロメートルを超えて機能し、標的細胞と機能的に1時間未満で結合することができる新しい神経突起が引き出される。このプロセスは、実験的な再現性および操作の容易さを可能にし、より遅い化学的戦略をバイパスして神経突起成長を誘導する。ここで提示された予備測定は、生理学的なものをはるかに超えるニューロンの成長速度を実証する。これらの技術革新を組み合わせることで、これまでにないほどの制御力で、文化におけるニューロンネットワークの正確な確立が可能になります。それはニューロンの成長の限界を探索する遊び場であるだけでなく、ニューロンネットワーク内の信号伝達および伝達についての過度の情報および洞察の扉を開く新規な方法である。潜在的な適用および実験は、ニューロンの再接続を目的とした治療法に直接的な影響が広がっている外傷後または神経変性疾患においてl回路を阻害する。
Introduction
成人の中枢神経系（CNS）への損傷は、軸索の再増殖を制限する複数の機構のために恒久的な障害を引き起こす可能性があります1 。傷害後、多くのCNS軸索は新たな成長円錐を形成せず、効果的な再生応答2を達成しない 。さらに、CNS病変を取り囲む損傷および瘢痕組織は、軸索成長を有意に阻害する1,2,3 。損傷後のCNS再生を促進するための現在の治療法は、傷害ニューロンの内因性増殖能の増強およびミエリン屑およびグリア瘢痕に関連する軸索伸長の阻害剤をマスキングすることに集中している1,3。それにもかかわらず、遠くの標的に長い軸索を再生し、適切な機能的シナプスを形成する能力は、依然として厳しく制限されている4 、
現在の研究では、マイクロビーズ、ピペットマイクロマニピュレーション、およびマイクロ流体デバイスを使用して、長距離にわたって新しい機能的なニューロン回路を迅速に開始、伸長および正確に接続する。以前の研究は、ポリ-D-リシン被覆ビーズ（PDL-ビーズ）が膜接着を誘導し、続いてシナプス小胞複合体のクラスター化および機能的シナプス前隆起の形成を示した8 。シナプス分化後にPDLビーズを機械的に引き離すと、シナプスタンパク質クラスターがビーズに追従し、新しい神経突起9が始まることも示されています。以下の手順は、この事実を、ポリジメチルシロキサン（PDMS）マイクロ流体装置を用いてカバースリップ上の組織化された領域にラットの胚海馬ニューロンを培養してニューロンを正確に再配線する能力回路。
これらのPDMSマイクロ流体デバイスは、毒性がなく、光学的に透明であり、マイクロチャネルのシステムによって接続された2つのチャンバからなる。一旦カバースリップ上に組み立てられると、各デバイスは、ニューロンの成長を誘導し、正確なパターンで健康なニューロン培養を維持し、インビトロで 4週間より長く維持するための型として役立つ。
ここでは、新しい神経突起の拡張および機能の限界を調べるための枠組みが提示されている。新しく機能的な神経突起が作製され、ニューロンネットワークを制御可能に（再）配線するように配置される。達成される伸長速度は、ミリメートルスケールの距離にわたって20μm/分より速く、機能的接続が確立される。これらの結果は予想外に、これらの神経突起の伸長に対する固有の能力が以前考えられていたよりもはるかに速いことを示している。この提案された機械的アプローチは、遅い化学戦略をバイパスし、特定の標的への制御された接続を可能にする。 Th技術は、傷害後のニューロンの接続性を回復するための新規療法のインビトロ研究のための新しい道を開く。それはまた、ニューロンネットワークの操作および再配線を可能にして、 インビトロでのニューロンのシグナルプロセッシングおよびニューロン機能の基本的な側面を調べる。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
以下に詳述するすべての手順は、McGill Universityの動物管理委員会によって承認され、カナダ動物衛生審議会のガイドラインに準拠しています。
1.マイクロ流体デバイスを用いたニューロン培養の標準化：デバイスアセンブリ
- 目的の実験に適したマイクロ流体デバイスを選択します。同じ集団内のニューロンに接続するには、Neuro Devices（ 図1 ）を使用し、異なる集団のニューロンを接続するには、Co-Culture Devices（ 図6 ）を使用します。
- 所望の数の滅菌カバースリップまたはガラス底の皿を洗浄し、調製する。プラスチック表面の最良の結果を得るには、35 mmの皿、ガラス使用の25 mmのカバーガラス、または35 mmのガラス底面の皿を使用します。イメージングシステムに基づいて、例えば0.15mmのガラス厚さを選択する。
- 100μg/ mL PDL 0.5〜1mLで2時間または一晩室温または室温で皿またはカバーガラスを被覆する。ature。
注：ここでプロトコルを一時停止し、必要に応じて翌日に再開することができます。さらに、ディッシュはホウ酸塩緩衝液希釈PDL、ポリ-L-リジン（PLL）、ラミニンまたは他の細胞接着分子でコーティングすることができます。 - 水晶を水で2回洗浄する（塩結晶がチャネルをブロックする可能性があるためリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を使用しない）、すべての液体を除去し、バイオセーフティーキャビネットなどの無菌環境で5〜10分間または表面は完全に乾燥している。
注意：カバースリップが完全に乾燥していることを確認してください。残っている液体はマイクロ流体システムの接着を妨害します。 - 滅菌環境（biosafety cabinet）でUV光の下でパターンを上にしてマイクロ流体デバイスを10分間置く。バイオセーフティキャビネット10で作業する場合は、必ず滅菌手順に従ってください。
- ピンセットを使用して、パターンが下を向いているマイクロ流体デバイスを、きれいなカバーと接触させて配置するip / dish。ピンセットを使用して、ガラスに接着するようにデバイスを柔らかく押してください。
注：光を照らして見ると、付着した領域の透明度が表示されます。すべての角がガラスに接触していることを確認してください。すべてのマイクロ流体デバイスにこれを行います。 図1aを参照してください。 - 単一の集団デバイスに培地を充填するために、ピペットをチャンネルに向け、無血清B-27（容量比1:50）および500μg/ mLのペニシリン/ストレプトマイシン/グルタミンを補充した50μLの完全細胞培地を加える右上の井戸にNBMと呼ばれる）を入れ、次にそれに斜めに横たわる井戸にさらに50μLを加えます。すべてのデバイスでこれを行い、培地がウェル間を流れるようにします。次に、50μLの培地を残りの2ウェルに加える。 図2aを参照してください。
- 複数の集団デバイスを培地で満たすには、ピペットをチャンネルに向け、30μL右側の井戸への完全なNBMの詳細については、 図6aを参照してください。すべてのデバイスでこれを行い、培地がウェル間を流れるようにします。次に、残りの4つのウェルに50μLの培地を加える。
- オートクレーブした水（湿ったチャンバー）を入れた開いた皿を用いてデバイスをより大きなプレートに置き、インキュベーター（37℃、5％CO 2および95％湿度）中に1〜2時間置く。 図2bを参照してください。
2.マイクロ流体システムにおけるニューロンのメッキ
- Ref。 8 、Sprague Dawleyラット胚（どちらの性別でも）から解離した海馬または皮質ニューロンを得る。
- 1〜200万ニューロン/ mLの濃度でNBM中の胚性ニューロンを再懸濁する。血球計数器を使用して参照番号8に従って顕微鏡の細胞濃度を確認する。細胞濃度の調整gを所望の細胞密度にする。チャネルあたりの単一の海馬軸索を得る機会を増やすために、デバイスあたり10,000ニューロンをプレートする。同じチャンネルに複数の軸索を持つためには、1台の装置につき60,000ニューロンが必要です。
注：これらの数字は、使用したニューロンのタイプによって異なります。 - ウェルを空にすることなく、マイクロ流体デバイスから培地を除去する。それぞれ約5μLのままにしておきます。
- 単一集団装置に細胞をプレートするために、50μLのNBMを右下のウェルに添加する。この時点で、媒体はそれ自体で流れて、他の下部ウェルに充填される。 図1bに示すように、濃縮液細胞溶液20μLをマイクロ流体デバイスの右上のウェルに添加する。
- 複数の集団装置に細胞をプレートするために、 図6aの右ウェルのそれぞれに20μLの濃縮細胞溶液を加える。
- 細胞があれば顕微鏡でチェックするチャンバーの内部にあり、15分間〜30分間インキュベーター内にデバイスを置き、基板への細胞の付着を促進する。
- チャンバーに十分な細胞があるかどうか顕微鏡でチェックします。さらに必要な場合は、手順2.4と2.5を繰り返します。
- 単一の集団デバイスの2つのトップウェルに50μLのNBMを、同じウェルに20μLのNBMを添加し、細胞を複数の集団デバイスに注入した。培地はわずかに突出して、メニスカスを形成し、ウェルにマフィンのトップを与える。ここでも、 図2aを参照してください。
- 37℃、5％CO 2および95％湿度で細胞を維持する。
ニューロン培養物の維持
- 細胞からNBM（ピペットで約30μL）を取り出し、デバイスに導入した翌日（ステップ2の1日後）に新しい予熱NBMを適用します。
- 各チャンネルに十分な量の媒体があれば、2日ごとに確認してください。マフィンtopは低く、トップウェルに培地を追加するだけです。
- マイクロ流体装置を除去する前に少なくとも7日間培養細胞に移す。細胞は、これらの装置で数週間生き残ることができる。サンプルを実験してから1~2日後にデバイスを取り外します。
4.マイクロ流体デバイスの除去
- マイクロ流体装置を取り除く前に1〜2日間インキュベートし、各サンプル皿に37℃に予熱したNBM 2 mLを加え、チャンバーを溢れさせ、装置をインキュベーター内に維持する。
- 無菌ピンセットとチップを使用して、カバースリップからマイクロフルイディクスデバイスを取り除き、ニューロンのパターン化された構成を残します。先端を使用してカバーガラスを所定の位置に保持し、ピンセットを使用してウェルの左下隅にあるデバイスの端をつかみます。微妙にねじりをかけ、デバイスをピンセットで持ち上げて、カバーガラスをはがすようにします。 図2c - 2dを参照してください。
- 2〜3日おきに、試料が実験に使用されるまでのNBM。
- サンプルの再配線実験を行う前に、単一母集団デバイスのチャネルの神経突起と複数の母集団デバイスの神経細胞集団が、顕微鏡でそれらの間のギャップを調べて、神経細胞集団をつなぐフィラメントが存在しないことを確認することによって分離されることを確認する。
5. PDL被覆ビーズの調製
- 水（1：500）で希釈した4,10または20μmポリスチレンビーズの2×50μL滴をPDL（100μg/ mL）1mLに添加する。室温で少なくとも2時間放置する。
注：ここでプロトコルを一時停止して翌日に再開することができます。 - 溶液を8,820 xgで1分間遠心する。容器の底に溜まったビーズを邪魔することなく上清を注意深く除去する。
- ビーズを1 mLの滅菌10 mM HEPES pH 8.4溶液で2回洗浄する。
- PDLでコートしたビーズを200mLの10mM HEPES pH 8.4中に再懸濁する。溶液。
6.マイクロピペットの準備
- 水平電極プラーを使用して、ガラス毛細管（内径1mm、外径1.5mm）からピペットを調製する。プルされたマイクロピペットの外側の先端が〜2-5μmになるように設定を調整します。引っ張る前に、ガラス管がきれいであることを確認してください。
- ピペットをガラススライドに固定して保管し、チップが壊れやすいためにチップがスライドの表面に接触しないようにします。ほこりから保護するために、屋内の容器に入れて保管する。ピペットを引っ張った日にピペットを使用してください。
7.ニューロンへのPDLビーズ接着
- ステップ4で調製した細胞培養液に、ステップ5で調製したPDLコートビーズ40〜60μLを加えます。ピペットチップをカバースリップ上にかすかに見えるニューロンの上に置き、ビーズを添加します（ 図3参照）。
- インキュベーターに試料を1時間戻して、syの形成を促進するナプキンコンタクト8,9 。
- インキュベーション後、予め温めたNBMで培養物を穏やかに洗浄することにより、付着していないビーズを除去する。
8.生理食塩水の調製（室温実験用）
- 参考文献7,8に記載されている成分を組み合わせて生理食塩水を調製する。これはインキュベーターの外の細胞環境を調節するためです。
- 参考文献7,8に示されているように、浸透圧およびpHレベルを確認する。
- 実験中にpH変動を最小限にするために溶液にO 2を連続的に注入する。
- 室温まで加熱する。
- プラスチックチューブの一端（オプションの寸法）をO 2を注入した生理溶液に入れ、もう一方を固定して灌流システムをセットアップする。試料ホルダーに挿入された針に送ってください。チューブと溶液をサンプルより高くします （ 図4参照）。
- チューブをニードルから外し、シリンジに接続します。シリンジを使用して圧力をかけ、液体を吸引してチューブを満たします。ローラークランプでシールし、ニードルを再び接続します。
ビーズマイクロマニュピュレーション
- 倒立光学顕微鏡の40倍位相対物レンズ（開口数0.6）を用いて、マイクロマニピュレーターに取り付けられた2つのマイクロピペットによって上方から細胞にアクセスし、光学的に下方にアクセスするような実験装置に試料を設置する。この構成では、顕微鏡の側面にイメージキャプチャ用のCCDカメラを取り付けます。プラスチック管を介して各ピペットを1 mLシリンジに接続します。この段階で、NBMを生理食塩水（1〜2 mL）に交換します（ 図4参照）。
- 実験中ステップ8で調製した生理食塩水で細胞を0.5〜1mL /分の速度で連続的に灌流する。
- 視野内のニューロンに結合されていないPDLビーズを選択します。ビーズの上にマイクロピペットを合わせてビーズをマイクロピペットの先端に合わせます。ビーズにできるだけ近づけて、顕微鏡で観察してください。
- ビーズをピックアップするピペットに接続された1 mLシリンジで負圧を適用します。実験を通して負圧を維持する。
10.神経突起を引く
- 視野内のニューロンに付着したPDLビーズを選択し、ステップ9.3-9.4に記載されているように吸引を用いて2番目のマイクロピペットに付着させる。
- マイクロマニピュレーターまたはサンプルステージのいずれかを1μm移動させてゆっくり（約0.5μm/分）PDLビーズ - ニューロン複合体を引っ張り、神経突起の開始を可能にするために5分間停止する。
- 手順10.2を2回繰り返します。
注：最初の3＆実験的な成功を保証するためには、時間の95％以上が経過するまで、非常にゆっくりと引っ張らなければならない。 - マイクロマニピュレーターまたはサンプルステージを2μm移動させてゆっくり（〜0.5μm/ min）PDLビーズニューロン複合体を引っ張り、神経突起伸長を可能にするために5分間停止する。
- 最初の5μmの開始および神経突起の伸長が成功した後、ミリメートルスケールの距離にわたって20μm/分で神経突起を引っ張る。
注：引っ張りは、連続的にまたは段階的に、および様々な速度で行うことができる。 図5b -5cを参照してください。
11.ニューロンの接続
- 神経突起に富む領域を選択し、物理的に接触するようにPDL-ビーズ - 神経突起複合体を下げる。他のビーズを使用して、カバースリップ表面上の先端の高さを測定する。 図5dを参照してください。
- PDL-ビーズ - 神経突起複合体を標的神経突起と接触させたままにし、第2のマイクロピペットペッテ新しく形成された神経突起の上に第2のPDLビーズを有する第2のピペットを下げて、約20μmのビーズを形成する。 2番目のPDLビーズを使用して、新しい神経突起フィラメントを標的細胞に向かって押します。
- 両方のビーズを少なくとも1時間定位置に保持する。顕微鏡16で 、ビーズに接触する神経突起の肥厚である、局所的な腫脹がないことを確認する。
- この間、灌流を使用して、サンプルの培地を生理食塩水から予熱したCO 2平衡NBMまでゆっくりと変化させる。
- 吸引を解除して、第2のピペットからビーズを解放する。新しい神経突起が付着したままになっている場合は、最初のビーズもリリースします。 図5eを参照してください。
- 静かに生理食塩水を取り除き、NBM（約2 mL）と交換する。
- 将来の実験のためにニューロンの接続を強化するために、慎重にサンプルをインキュベーターに戻してください。この接続は24時間以上安定です
12.全セルペアパッチクランプ記録による新しい接続の機能の確認
- 文献7,18,19に従ってください。電気生理学のセットアップを組み立てる。
- 参考文献7に従ってください。シナプス前およびシナプス後の電極を準備する。
- パッチクランプデータを収集する。これも参考文献18,19に従う。
- その結果を自然発生信号7と比較して接続タイプを決定します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
胚性ラット海馬ニューロンは、細胞、PDL-ビーズおよびマイクロマニピュレーターの正確な配置を可能にするために、マイクロ流体デバイス内で培養される。最初のステップは、ガラスのカバースリップまたはディッシュ上にマイクロ流体デバイスを適切に組み立てることである。チャンバーを出て、封止されるべきデバイスの部分の下を移動する細胞を避けるために、マイクロ流体デバイスを基板に良好に取り付けることが重要である（ 図1a ）。健康な培養を数週間維持するためには、2〜3日おきに細胞培地を確認し、培地の陽性メニスカスを維持して培地の蒸発を防ぐことが重要です（ 図2a ）。中程度の蒸発も避けます。より大きなプレート（ 図2b ）の中に水と細胞の両方を入れておきます。マイクロ流体装置は、いつでも取り外すことができる。最適な結果を得るには、NBMをcell-deに追加する必要がありますデバイスを取り外す前に少なくとも1日以上保管してください。これは、ニューロンが理想的な温度およびpHで培地と接触しているときに、細胞ストレスを最小にする。マイクロ流体デバイスをディッシュからゆっくりと剥がすと（ 図2c および2d ）細胞はパターン化された位置に留まる（ 図3および図5a ）。
2つのタイプのマイクロ流体デバイス、すなわち、神経デバイスおよび共培養デバイスが使用される。第1の方法は、軸索、樹状突起および細胞体の容易な同定を可能にする。ソーマは上部ソーマチャンバーに留まり、軸索と樹状突起は軸索チャンバーに向かってマイクロ流体チャンネル（ 図5a ）に沿って成長する。
PDL-ビーズを10：1の比率で細胞に添加することが推奨され、そのほとんどのビーズは、1時間のインキュベーション後にNBMで細胞を1回洗浄することによって培養物に付着していない細胞を除去する（ 図3 ）。 PDL-ビーズの神経突起への接着の後、PDL-ビーズ - 神経突起複合体は引っ張られ、大きな距離にわたって伸長することができる。新しく形成された神経突起は、神経突起またはsomaミリメートルに正確に接続することができます（ 図5b -5e ）。 1μm/分未満の速度で最初の3μmのための新しい神経突起を引き出すための成功率は> 95％（n = 206）である。新しい神経突起を別の細胞に連結する成功率は70％（n = 30）である。最初の18時間では、主に新しい神経突起が直径1μm未満のフィラメントであり、10μmのPDLビーズによって固定されているため、接続は非常に脆弱である。ディッシュが最初の数分間の接触の間に急速に動かされると、媒体の乱れによりビーズが転がり、その結果接着が失われる可能性があります。しかし、サンプルがSHAでない場合30分で、ビーズがディッシュの神経突起に付着し、新しい接続が少なくとも48時間維持される。セットアップの回路図については、 図4を参照してください。
培養上のPDLビーズ位置は、結合した神経突起の位置を容易に同定するためにも使用することができる（ 図6d〜6e ）。開始後、新しい神経突起の伸長および接続は、マイクロマニピュレーターを介してピックアップされた第2の非接着性PDLビーズが、開始された神経突起と第2のニューロン集団との間の第2の接着部位を作成するために使用される。第2のPDLビーズは、新しい神経突起の頂部に配置され、新しい神経突起が第2のニューロン集団にちょうど接触するように圧縮する。これは、第2ニューロン集団との接着を促進する（ 図5f ）。
複数の母集団装置enab同じ皿上の4つの単離されたニューロン集団の増殖。各ニューロン集団は、100または200μmのギャップによって他のニューロン集団から分離された4×7mmの矩形に限定される（ 図6a ）。健康なニューロンは数週間デバイス内で成長することができます。通常、ニューロン集団は、装置の除去後48時間まで分離されたままである。この48時間後、ニューロンは隣接ニューロン集団に向かって成長し、自然なつながりを形成する傾向がある。 2つの分離された集団を接続する前に、2つのニューロン集団の間にリンクがないことを確立するために、顕微鏡を用いてギャップ全体を調べることによって集団が実際に本当に単離されていることを確認する必要がある（ 図6b ）。
接続後、試料を24時間インキュベートし、電気的全細胞対パッチクランプ記録を行って、新たに2つの単離されたニューロン集団を接続するために使用された形成された神経突起は機能的であり、電気信号を伝達することができた。誘導された神経突起が開始された部位から100μm未満の半径に位置する集団1におけるニューロンを、シナプス前活動電位（PAP）を記録するために選択した。このニューロンはシナプス前細胞と考えられた。シナプス後興奮性または阻害性活性は、マイクロマニピュレーションされた接続の半径100μm未満に位置するギャップの反対側の集団2のニューロンから記録された（ 図7a〜7c ）。機械的に誘導された結合から得られた記録を分析し、自然に連結したニューロン集団および非連結集団からの記録と比較した（ 図7 ）。自然に接続されたニューロンおよびマイクロマニピュレーションによって記録されたニューロンから記録されたPAP後の電気的応答は、プレシナプスと有意に高く時間的に相関する（ 図7 ）。
図1： マイクロ流体デバイスを用いたニューロン培養の標準化7 。 （ a ）デバイスアセンブリ：マイクロ流体デバイスが乾燥表面上に適切に組み立てられると、すべてのチャンバが見える。 （ b ）細胞プレーティング：右上の細胞をプレートし、細胞は左のウェルの方に移動する。 （ c ）細胞密度：プレーティング直後に、細胞の濃度が適切であるかどうか顕微鏡でチェックする。 （ d ）培養1日後、海馬ニューロンはマイクロチャネルの近くによく接着し、神経突起を形成し始める。 ラージを表示するにはここをクリックしてくださいこの図の赤版です。
図2 ：健康な神経細胞培養の数週間の維持7 。 （ a ）培地を2-3d毎に添加し、マイクロ流体室の上部井戸に正のメニスカスを保ち、細胞が一定の栄養分を供給するようにする。 （ b ）水を含む皿で細胞をより大きなプレートの中に入れ、培地の蒸発を減らす。 （ c ）滅菌チップおよびピンセットを使用して、（ d ）マイクロデバイスを容易に剥がす。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
p_upload / 55697 / 55697fig3.jpg "/>
図3 ：ビーズを培養物中に沈着させるピペットの位置。マイクロ流体デバイスが除去されると、カバースリップ上にニューロンが見える。ビーズを置くときは、細胞の中心にピペットチップを配置します。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図4： 典型的な神経突起を引っ張る構成の概略 図 。サンプルはピエゾ作動ステージ上にあり、マイクロマニピュレーターに保持された2つのマイクロピペットで上からアクセスでき、プラスチックチューブを介して1 mLのシリンジに接続できます。試料は、CCDカメラに接続された対物レンズによって下から光学的にアクセスされ、イメージをCPUに送信します。インレットチューブは酸素飽和生理食塩水をサンプルの下に置く。シリンジに接続されたアウトレットチューブは、オーバーフローが発生した場合に溶液の回収を可能にする。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図5 ：ニューロンおよびピペットマイクロマニピュレーションに対するPDLビーズ接着7 。 （ a ）ニューロンは、体液および神経突起の容易な同定を可能にするマイクロ流体チャンバーの除去後にパターンで組織されたままである。 （ b ）神経突起に付着したPDL-ビーズのマイクロマニピュレーションは、神経突起の開始、伸長（ c ）および連結（ d ）を可能にし、続いてピペットからのPDLビーズの放出（ e ）。 （ f ）2つの単離されたニューロン集団に接触した後（下矢印）、第2のPDLビーズおよびピペットマイクロマニピュレータ（上の矢印）を使用して、第1の接触点から数百ミクロン離れた第2の接着点を確立し、接続。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図6 複数の集団デバイスとマイクロマニピュレーションを用いて2つの分離された集団を接続するための新しい神経突起の開始、伸長および接続 7 。 （ a ）この装置は、4つのニューロン集団を単離するそれぞれ100または200μmの3つのギャップの間にある。 （ b ）装置を取り外した後、ギャップを1つ選択し、2つの個体群をつなぐ神経突起がないことを証明する。 （ c ）2つのマイクロピペットの位置およびPDL被覆ビーズの存在を示す、光学顕微鏡で見えるような実験装置の概略図。 （ d ）ピペットに負圧を加えることによって、1つのニューロン集団に付着したPDLビーズをピペットチップで引っ張り、それによって新しい神経突起を開始する。ピペット内の負圧を維持することにより、PDL-ビーズ - 神経突起複合体（緑色）を引っ張り、神経突起を伸長させることができる。 （ e ）ピペットマイクロマニュピュレーションは、新しい神経突起の間隙にわたる伸長および新しいニューロン集団との接続の形成を誘導する。新しい神経突起の第2の集団への接着を確実にするために、PDL-ビーズ（赤）を、第2のピペットを用いて、伸長した神経突起および神経の両方の上に配置する人口。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図7： 新しく誘発され、伸長し、接続された神経突起は、2つの単離されたニューロン集団間の情報を伝達することができる 。単離されたニューロン集団を、PDMSマイクロデバイスにおいて100μmのギャップによって分離して培養した。対になったパッチクランプ記録は、2つの集団が機械的操作（ a ）によって接続され、集団1のニューロンから集団2のニューロン（ギャップの反対側）隙間（ b ）を維持するか、またはmaintギャップを埋める（ c ）。対になった記録の代表的な痕跡が各条件（ df ）について示されている。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
標準的なマイクロマニピュレーションおよび革新的なマイクロ流体デバイスを使用して、新しい機能的なニューロン回路を遠距離に迅速に開始、伸長および正確に接続するための新しい技術が開発された。ピペットマイクロマニュピュレーションは、ほとんどの神経科学ラボ4,13で一般的なツールです。再現性と信頼性の高い結果を達成するための真の課題は、マイクロメーターの精度で細胞培養を構成するマイクロ流体デバイスの開発を通じて、実験期間（数週間であり得る）の間、健康な、正確に配置された神経細胞培養の標準化であった。高品質の細胞培養はデータ検証の基礎です。これは、より簡単で迅速な顕微鏡画像および培養および結果の標準化に寄与する。マイクロ流体デバイスは、生体内と同様の構成でインビトロで細胞を培養するように設計された。単一の母集団装置により、長い神経突起の成長および軸索、神経突起および細胞体の容易な同定。マイクロ流体チャンバに播種された細胞の数は、ニューロン密度を決定する。したがって、デバイスあたりの細胞数をより少なくすることによって、チャネルに近い単一のニューロンを同定することは容易である。 1つのニューロンの軸索および複数の樹状突起は、1つのチャネル内で成長する。デンドライトは、軸索6,17より少なくとも5倍遅く増殖し、 インビトロで 2〜3週間後、チャネルにおけるそれらの増殖は通常、200μmに制限され、一方、急速に成長する軸索は2mmを超えることがある17 。したがって、サンプルにPDLビーズを添加した後、ビーズが主に軸索または軸索および樹状突起に付着しているかどうかを推定することは比較的容易である（ 図 5b〜5f ）。 200μmより短い神経突起に付着したPDLビーズを引っ張るとき、新しい軸索および樹状突起を引っ張る可能性がより高い500μmより長い神経突起に結合したPDLビーズを引っ張るときに新しい軸索のみを引っ張る確率が高くなります。複数の集団装置は、健康な離散集団を数週間再現性よく増殖させるのに有用である。この系統系は、最大4種類の細胞型を研究したり、同じ細胞を異なる治療法と比較するのに有用です。
さらに、制御された再現可能な細胞培養環境は、細胞分析および操作のための理想的な枠組みを提供する。ディッシュ上の細胞の正確な位置決めは、これらの関心領域を通じた関心領域の同定および方向付けおよびナビゲーションを容易にし、最終的に神経突起開始部位に対する前例のない制御を可能にする。制御された細胞分布により、新たに形成された接続を視覚化することが容易になり、インキュベーション後の日に顕微鏡との新しい接続を見つけるのがずっと速くなる。さらに、細胞の再構成可能な構成体細胞、樹状突起または軸索上のPDLでコーティングされたビーズなどの化学的手がかりを簡単かつ正確に位置決めできます8 。まとめると、マイクロ流体デバイスで成長した細胞のイメージングおよび分析は、すべての皿で再現された標準的な細胞組織のため、より高速である。さらに、デバイスは、生体適合性のある透明で除去可能な材料でできており、数週間にわたってデバイス内の可視波長および細胞生存率をすべてイメージングすることができます。細胞アッセイの小型化は、より少ない細胞でより多くのデータを収集するのにも役立ちます。マイクロ流体装置の消費量が少ないため、実験ごとに必要とされる細胞数が減少し、実験的有効性が増加する。例えば、顕微鏡でおそらく1〜2個の分離された軸索を皿の中で探索するのに数時間を費やす代わりに、単一の集団装置を用いて、細胞サンプルあたり100を超える単離された軸索に即座にアクセスすることができる。マイクロ流体デバイスは、小型化された信頼性が高く制御された多数の試験を行うための希少試料の分析に好都合な細胞培養環境。
この技術の潜在的なバリエーションは、ビーズのマイクロピペットへの直接的な取り付けを含む。現在のプロトコルでは、ビードを吸引によってチップに取り付ける方法が記載されているが、ビードもチップに接着することができる。たとえば、センサとしてピペットを使用して力測定を行った場合、またはPDLと神経突起間の接着の調査が主要な実験目的である場合、チップとビードの間の非常に安定した接続が望ましい場合には、接着剤がより良い選択肢です。他の静脈では、吸入は、神経突起 - ビーズ複合体を切断することなく配置後にビーズを放出させることができ、いくつかの接続を並行して行うことができるので有利である。吸引は、ハイスループットの再配線実験、原子間力顕微鏡法（AFM）/ sup> 、 16 。この方法の両方の改変により、シナプスが形成されるように、ビーズを樹状突起と接触させて維持することによって神経突起開始部位を選択することが可能になる。しかし、ステップ7に記載されているようにいくつかのビーズをインキュベートする戦略は、操作段階で時間を節約し、実験において開始部位の正確な制御が不要な場合に推奨される。
今後の研究では、温度制御やサンプルのアクセシビリティなど、さまざまな機器の限界に取り組むことができます。細胞膜の機械的性質は、異なる温度で大きく変化し得る27 。理想的には、すべての実験は、ニューロン培地および適切な条件（正確なCO 2圧力および湿度コントロール）で37℃で行うべきである。しかし、閉じた細胞インキュベーターを使用することは不可能であった。なぜなら、上からのサンプルへのアクセスは、マイクロマニピュレーター、顕微鏡の底面とステージを動かす側面からなる。したがって、室温での灌流を使用した。同じように、セットアップは2つのマイクロマニピュレーターを収容するのに十分なスペースしか持たず、単一の接続を確立するのに約1時間かかるので、実験の数には限界があります。この問題は、一度に複数のビードを引き出すマニピュレータで対処することができます。このプロトコールのもう1つの潜在的な改良点は、ビーズ - ピペット複合体の高さを試料表面から登録する能力である。これを行うことができないことは、第2のビーズを下ろし、それを固定するために誘導された神経突起上に置くとき、不正確さをもたらす可能性がある。新しい神経突起と皿上の突起が同じ焦点面になるまで、ビーズを神経突起が豊富な領域の新しい神経突起の上に下ろします。新しい神経突起はビーズとディッシュの間に決して存在しませんが、常に細胞物質のクッションとビーズの間にあるため、圧縮が減少します。さらに、新しい神経突起を顕微鏡で10分間観察し、神経突起の腫脹がビーズの近くに形成されているかどうかを評価する。参考文献16に記載されているように、腫脹の存在は、神経突起変性を示す。それにもかかわらず、軸索に様々な圧力を加えると生理的変化につながる可能性があるため、今後の研究ではピペットプローブをAFM法で固定し、最後に、おそらくこのプロトコルの最大の課題は、操作された接続の機能をテストすることです。最も直接的で、信頼性が高く、確立された技術は、対になった全細胞パッチクランプ記録である。しかし、通常の対パッチクランプ記録の成功率は非常に低い（<25％） 18 。全細胞パッチクランプは、長いセットアップ時間、限られた実験数/日、限られた記録時間（約30分）、パッチクランプ記録と測定後の細胞死のペアの低い実験的収量。これらの技術的課題のために、マイクロマニピュレーション後の全細胞パッチクランプペア記録の実験的収量は非常に低い。自然とマイクロマニピュレーションされた接続におけるニューロンの活動をより正確に刺激し、記録し、比較するためには、より良いプラットフォームと技術が必要です。
軸索の成長における緊張の重要性は、神経解剖の初期から知られており、パッシブストレッチングと呼ばれています20 。初期胚発生の間に、神経突起は小さな距離を移動して標的に到達する。ほとんどの細胞が分裂して複製するので、軸索を伸長させ、その長さを胚の成長20,21に調整する連続力を受ける。いくつかのグループが、化学的合図および/または機械的緊張をneuに適用することによって、神経突起伸長の限界を試験しようと試みている（参照文献22参照）。これらの報告書23,24,25,26ならびに生理学的成長中に、神経突起は引っ張られて基質に結合される。我々のセットアップの主な相違点は、本技術では、新しい神経突起は2つの接着接点しか持たないことである。塩基では神経突起はニューロンに結合し、先端では神経突起はビーズに結合している。伸長の間、新しい神経突起の成分は、引っ張り力に適応する最も効率的な方法で自由に分散する。さらに重要なことに、このプロトコールは、シナプス接触の形成に関する以前の研究8および軸索の耐圧に対する耐性に基づいて、神経突起破裂または変性を引き起こさずにこれらの実験を再現する方法を記載する16。適切な力で連続的に神経突起を引っ張る。本明細書（1.2mm / h）に記載された神経突起伸長速度は、末梢神経系からの最も速く成長する軸索（0.02〜0.04mm / h） 28の インビボ速度より30〜60倍速い。 インビトロで同じニューロン型と比較した場合、本明細書に記載される軸索伸長速度は、他の著者によって開発（0.1mm / h）の初期段階で記載された成長速度よりも7.5倍速い。異なるタイプのニューロンが軸索を数倍に変化する異なる内因性速度で伸長させることが見出されている29 。さらに、中枢神経系の軸索は、インビトロでの標的神経支配の後、軸索成長の高い速度を通常失う。したがって、現在の軸索伸長技術は、よりよく理解するために、異なるニューロン型で試験すべきである神経突起伸長の限界。
ピペットマイクロマニピュレーションおよびマイクロ流体デバイスは、新しい機能的な神経突起を作製し、ニューロンネットワークを制御可能に配置または（再）ワイヤリングするために実証された技術である。このプラットフォームは、体系的で標準化された測定に最適です。それは、ニューロンの複雑なネットワーク上での実験への再現性およびインビボ制御を導入する。達成される伸長速度は、ミリメートルスケールの距離にわたって20μm/分より速く、機能的接続が確立される。これらの結果は予想外に、それらの細胞骨格成分のそれを含む伸長のための軸索の本来の能力は、以前の考えよりもはるかに速いことを示している10,11,12 。この提案された機械的アプローチは、遅い化学的戦略をバイパスし、したがって、損傷後の神経結合を回復させるための治療開発のためのパラダイムシフトを表すインビトロでの制御された研究のための人工ニューラルネットワークのマイクロニューロエンジニアリングのためのものである。これらの結果はまた、外傷後または神経変性疾患において神経回路を再接続することを目的とした療法に対する直接的な意味を伴う再生医療および神経工学的アプローチに大きな影響を与える。このプラットフォームは、ニューロン通信、信号変調、ならびに成長および再生に関するデータを得るための扉を開く。これは、CNSを機械的に再生する新しい方法であり、同様の技術は、損傷後の機能の回復を可能にする可能性がある。さらに、この技術は、創薬および標的の検証のための新規のバイオアッセイプラットフォームとして、系統的に設計されたニューロンネットワークを作製するために使用することができる。これは、強力な脳 - 機械インターフェースの直接配線の前駆体である。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者Margaret H Magdesianは、この記事で使用する楽器を製作するAnanda DevicesのCEOです。
Acknowledgments
多くの有益な議論と洞察をいただき、宮原陽一に感謝したいと思います。 MAとPGはNSERCからの資金調達を認めている。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Co-culture devices | Ananda Devices | Commercially available at http://www.anandadevices.com | |
| Neuro devices | Ananda Devices | Commercially available at http://www.anandadevices.com | |
| No. 1 Glass Coverslip 25 mm Round | Warner Instruments | 64-0705 | |
| 35 mm Glass Bottom Dishes #0, Uncoated, Gamma-Irradiated | MatTex Incorporation | P35G-0-20-C | |
| 35 mm cell culture dish, Non-Pyrogenic, Sterile | Corning Inc | 430165 | |
| 95 mm x 15 mm Petri Dish, Slippable Lid, Sterile Polystyrene | Fisherbrand | FB0875714G | |
| 50 mL Centrifuge tubes with printed graduations and flat caps | VWR | 89039-656 | |
| 15 mL Polypropylene Conical Tube, 17 x 120 mm style, Non Pyrogenic, Sterile | Falcon | 352097 | |
| Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103-049 | Extracellular solution |
| B-27 Supplement (50X), serum free | B-27 Supplement (50X), serum free | 17504044 | Extracellular solution |
| Pennicilin, Streptomyocin, Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11995-065 | Extracellular solution |
| 200 μ L Pipettors | VWR | 89079-458 | |
| 2 - 20 μL Pipettors | Aerosol Resistant Tips | 2149P | |
| BD Falcon 3mL Transfer Pipettes [Non-sterile] | BD Falcon | 357524 | |
| Glucose | Gibco | 15023-021 | Extracellular solution |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | Extracellular solution/Beads |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | Extracellular solution |
| KCl | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | Extracellular solution |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | Extracellular solution |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | Extracellular solution |
| #5 Dumont Dumostar Tweezers 11 cm | World Precision Instruments | 500233 | |
| Dissection tools | Braun, Aesculap | ||
| Poly-D-lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P6407 | |
| Micro particles based on polystyrene, 10 μm | Sigma-Aldrich | 72986 | |
| Borosilicate tubes | King Precision Glass, Inc. | 14696-2 | |
| Horizontal Pipette Puller | Sutter Instruments | Brown-Flaming P-97 | |
| Micromanipulators, PCS-5000 Series | SD Instruments | MC7600R | |
| 1 mL Syringe | BD Luer-Lok | 309628 | |
| Inverted Microscope | Olympus | IX71 | |
| Objective | Olympus | UIS2, LUCPLFLN 40X | |
| CCD Camera | Photometrics | Cascade II: 512 | |
| Leibovitz's (1x) L-15 Medium | Life Technologies | 11415-064 | Rat Dissection |
| Typsin-EDTA (0.05%), Phenol red | Life Technologies | 25300054 | Rat Dissection |
| DMEM (1x) Dulbecco's Modified Eagle Medium [+4.5 g/L D-Glucose, + L-Glutamine, + 110 mg/L Sodium Pyruvate] | Life Technologies | 11995-065 | Rat Dissection |
| HBSS (1x) Hank's Balanced Salt Solution [- Calcium Chloride, - Magnesium Chloride, - Magnesium Sulfate] | Life Technologies | 14170-112 | Rat Dissection |
References
- Chew, D. J., Fawcett, J. W., Andrews, M. R. The challenges of long-distance axon regeneration in the injured CNS. Prog. Brain. Res. 201, 253-294 (2012).
- Bradke, F., Fawcett, J. W., Spira, M. E. Assembly of a new growth cone after axotomy: the precursor to axon regeneration. Nat. Rev. Neurosci. 13 (4), 189-193 (2012).
- Aguayo, A. J., et al. Synaptic connections made by axons regenerating in the central nervous system of adult mammals. J. Exp. Biol. 153, 199-224 (1990).
- Lamoureux, P., Ruthel, G., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Mechanical tension can specify axonal fate in hippocampal neurons. J Cell Biol. 159 (3), 499-508 (2002).
- Goslin, K., Banker, G. Experimental observations on the development of polarity by hippocampal neurons in culture. J Cell Biol. 108 (4), 1507-1516 (1989).
- Dotti, C. G., Sullivan, C. A., Banker, G. A. The Establishment of polarity by hippocampal neurons in culture. J. Neurosci. 8 (4), 1454-1468 (1988).
- Magdesian, M. H., et al. Rapid mechanically controlled rewiring of neuronal circuits. J. Neurosci. 36 (3), 979-987 (2016).
- Lucido, A. L., et al. Rapid assembly of functional presynaptic boutons triggered by adhesive contacts. J. Neurosci. 29 (40), 12449-12466 (2009).
- Suarez, F., Thostrup, P., Colman, D., Grutter, P. Dynamics of presynaptic protein recruitment induced by local presentation of artificial adhesive contacts. Dev. Neurobiol. 73, 1123-1133 (2013).
- General Laboratory Techniques. An Introduction to Working in the Hood. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. https://www.jove.com/science-education/5036/an-introduction-to-working-in-the-hood (2016).
- Strober, W.
- Beaudoin, G. M. 3rd, et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nat. Protoc. 7 (9), 1741-1754 (2012).
- Bray, D. Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension. Dev. Biol. 102, 379-389 (1984).
- Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Axonal outgrowth of cultured neurons is not limited by growth cone competition. J. Cell Sci. 111, 3245-3252 (1998).
- Pfister, B. J., Bonislawski, D. P., Smith, D. H., Cohen, A. S. Sketch-grown axons retain the ability to transmit active electrical signals. FEBS Lett. 580, 3525-3531 (2006).
- Magdesian, M. H., et al. Atomic force microscopy reveals important differences in axonal resistance to injury. Biophys. J. 103 (3), 405-414 (2012).
- Polleux, F., Snider, W. Initiating and growing an axon. CSH Persp. Biol. 2 (4), 001925 (2010).
- Debanne, D., et al. Paired-recordings from synaptically coupled corticol and hippocampal neurons in acute and cultured brain slices. Nat. Protoc. 3, 1559-1568 (2008).
- Qi, G., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings. J. Vis. Exp. (95), e52358 (2015).
- Harrison, R. G. On the origin and development of the nervous system studied by the methods of experimental embryology. Proc. R. Soc. Lond. B. , 155-196 (1935).
- Weiss, P. Nerve patterns: the mechanics of nerve growth. Growth 5 (Suppl. Third Growth Symposium). , 153-203 (1941).
- Gray, C., et al. Rapid neural growth: calcitonin gene-related peptide and substance P-containing nerves attain exceptional growth rates in regenerating deer antler. Neurosci. 50 (4), 953-963 (1992).
- Heidemann, S. R., Bray, D. Tension-driven axon assembly: a possible mechanism. Front. Cell Neurosci. 9, (2015).
- Bray, D. Axonal growth in response to experimentally applied tension. Dev. Biol. 102, 379-389 (1984).
- Heidemann, S. R., Buxbaum, R. E. Mechanical tension as a regulator of axonal development. Neurotoxicology. 15, 95-107 (1994).
- Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E.
- Pfister, B. J., Iwata, A., Meaney, D. F., Smith, D. H. Extreme stretch growth of integrated axons. J. Neurosci. 24 (36), 7978-7983 (2004).
- Waxman, S. G., Kocsis, J. D. The axon: structure, function and pathophysiology. , Oxford University Press, USA. (1995).
- Cho, E. Y., So, K. F. Rate of regrowth of damaged retinal ganglion cell axons regenerating in a peripheral nerve graft in adult hamsters. Brain Res. 419, 369-374 (1987).
- Davies, A. M. Intrinsic differences in the growth rate of early nerve fibres related to target distance. Nature. 337, 553-555 (1989).
