Sektion Mammary Gland Hele Montage til Lesion Identifikation
Summary
Vi udviklede en metode til succesfuld fjernelse, behandling, afsnittet og pletter, til histopatologisk evaluering, brystvæv, der oprindeligt var blevet fastgjort på dias som hele fester. Denne metode kan fremme indsamling og evaluering af brystkirtler hele fester i reproduktive og udviklingsmæssige test guideline undersøgelser.
Abstract
Normal udvikling i brystkirtlen kan ændres ved udsættelse for miljømæssige toksiske stoffer og lægemidler, overdreven eksponering for hormoner og genetiske ændringer. Mammekirtler hele fester er en billig metode til at fange progressionen af morfologiske forandringer, der kan opstå efter eksponering. Men i senere liv, når abnormiteter er mere tilbøjelige til at udvikle sig, kan enlig afhængighed af denne ene metode ikke altid give tilstrækkelig information til at foretage en korrekt diagnose af abnormiteten. Historisk set fjernes en enkelt brystkirtlen ved undersøgelse af kemisk test retningslinier ved nekropsy og fremstilles som en hæmoxylin og eosin (H & E) -farvet sektion. Inkorporering af kontralaterale brystmonterede samlinger og analyser reducerer sandsynligheden for en falsk-negativ vurdering. Evaluering af hele bjerget er begrænset af tilstedeværelsen af en eller to hele brystkirtler på et dias, og i nogle tilfælde er de abnormiteter, der observeres i hele bjerget, ikkeT ensartet repræsenteret i H & E sektionen. Målet med denne undersøgelse var at udvikle en protokol til omdannelse af dækkede brysthuller til H & E-farvede sektioner, således at læsioner, der ellers ville være blevet savnet eller som er vanskelige at diagnosticere, kan identificeres. Her beskriver vi en metode til fremstilling af en højkvalitets paraffinindlejret H & E-sektion fra en brystkirtle, der oprindeligt var forberedt som en hel montering. Sammenlignet med et væv, der var forsætligt forberedt til H & E-sektion, kræver hele bærepladen yderligere forberedelse til fjernelse og behandling af væv. Denne metode anses imidlertid for billig, da det kræver fælles laboratoriereagenser og lidt ekstra tid. Som følge heraf kan denne metode give uvurderlig information om, hvordan kemiske og miljømæssige eksponeringer ændrer normal brystudvikling, samt viser ændringer, der opstår på grund af genetiske modifikationer.
Introduction
Brysthulen er en nyttig og billig metode, der implementeres i mange rotte- og musestudier for at forstå både normal og kemisk induceret, abnorm udvikling. I almindelighed vil en brystkirtle indsamlet på forskellige stadier under udvikling af gnaver ( dvs. ungdomsår, puberteten, mellem- til sen-gestation og involutionfasen) vise morfologiske forandringer i væv og cellulær arkitektur påvirket af parakrine, endokrine og autokrine faktorer 1 . I den aldrende rotte bliver de epitheliale og stromale dele af kirtlen mere og mere tætte, hvilket gør måling af morfologiske parametre vanskelige i en hel mount. Således er det almindeligt at samle en kirtel til histologisk evaluering for at identificere ændringer på et mikroskopisk niveau. Begge processer er særligt nyttige i undersøgelser, der involverer kemisk eksponering ( dvs. miljømæssige eller farmaceutiske) eller at undersøge de morfologiske forandringer ledsaget af genetisk altertioner.
Teknikker og evner til brug af brystkirtlen i risikovurdering fortsætter med at udvikle sig. Mens fuldmontering er rutinemæssig og standardiseret, fortsætter modifikationer til snitning 2 , 3 . Mange forskergrupper fra forskellige baggrunde ( dvs. akademi, regering og industri) har tilpasset koronale / langsgående sektioner af brystvæv som en foretrukket metode, mens nogle laboratorier stadig bruger tværsnit gennem huden 4 . Sidstnævnte metode resulterer i en uforholdsmæssig repræsentation af epidermis (hud), snarere end væv af interesse: brystkirtlen epitel 2 . Koronale eller langsgående sektioner er mere anvendelige til karakterisering af normalt væv 5 og forbedrer markant påvisning af abnormiteter og læsioner på grund af det forøgede overfladeareal og antallet af strukturer, der er til stede. Samlet set gør dette hele moIkke en egnet metode til den sammenlignende histopatologiske vurdering af brystkirtlen 1 , 2 . Hvorvidt bruger en mus eller en rotte, selektion, og bevarelse af 4 og 5. ingvinale kirtler anbefales til sammenligning af hele mount til en kontralateral H & E sektion.
Når de anvendes i kombination, giver H & E-sektionen og hele monteringen en præcis redegørelse for de cellulære og morfologiske forandringer, der er forårsaget af miljøeksponering. Dette gælder især i visse gnaverstammer, hvor modellen har en lav modtagelighed for tumordannelse, eller en tumor er ikke groft synlig. Under visse omstændigheder kan det ikke altid være muligt at opnå det krævede væv ved hjælp af begge teknikker ( dvs. utilstrækkelig vævsmængde, ressourcer eller uventede eksperimentelle resultater). I vores tilfælde blev der observeret abnormiteter i hele brystet, mens histopathoLogiske fund i den kontralaterale H & E-kirtlen var for det meste normale. Den overvældende uoverensstemmelse mellem de kontralaterale kirtler førte os til at udvikle en økonomisk og effektiv procedure til at identificere abnormiteterne i hele monteringen. Ved anvendelse af en modificeret behandlings- og indlejringsprocedure blev H & E-farvede sektioner af høj kvalitet fremstillet af paraffinindlejrede hele fester. Vi forestiller os, at denne protokol bliver et kraftigt detekteringsværktøj til kemiske eksponeringseffekter, der forbedrer interlab sammenligninger.
Protocol
Representative Results
Discussion
Brystkirtlen hele mount er et kraftfuldt værktøj, der kan bruges til at illustrere den normale brystudvikling og morfologiske ændringer, der kan opstå og vedvarer efter udsættelse for kemikalier, herunder hormonforstyrrende stoffer. Når en hel mount og H & E sektion fra det samme dyr vurderes sammen, kan de give et nøjagtigt visuelt snapshot af tidlige ændringer, som kan udvikle sig til en mere syg tilstand.
Evnen til at opnå denne nyttige information ligger i at sikre, at der t…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne anerkende Pam Ovwigho, Tenette Jones og Natasha Clayton, NIEHS, for deres tekniske ekspertise og støtte med dette projekt.
Materials
| Xylene | Sigma-Aldrich | 214736 | |
| Permount | Thermo Fisher Scientific | SP15-100 | mounting media for coverslipping whole mounts and H&E sections |
| Leica automated processor | Leica Biosystems | Model # ST5020 | |
| HM 355S Automatic Microtome | Thermo Fisher Scientific | 905200 | |
| Paraffin | Leica Biosystems | EM-400 | |
| Superfrost plus microscope slides | Thermo Fisher Scientific | 4951PLUS-001 | electrostatically charged |
| Fisher Finest 24x60x1 | Thermo Fisher Scientific | 12-548-5P | coverslips |
| Varistain Gemini ES Automatic slide stainer | Thermo Fisher Scientific | A78000014 | |
| Sta-On | Leica Biosystems | 3803107 | liquid adhesive; used in water bath at sectioning |
| Modified Harris Hematoxylin 72711 | Richard-Allan Scientific (Part of Thermo Scientific) | 72711 | |
| Eosin | Leica Biosystems | 3801600 | |
| Lithium Carbonate | SkyTech Laboratories | LCQ500 | |
| Glacial Acetic Acid | Thermo Fisher Scientific | A38-500 | needed in Carnoy's fixative |
| Chloroform | Macron Fine Chemicals | 4440-04 | needed in Carnoy's fixative |
| 100% Ethanol | The Warner Graham Company | 6505001050000 | needed in Carnoy's fixative and washing slides |
| 95% Ethanol | The Warner Graham Company | 6505011137320190 | |
| Carmine Alum | Sigma-Aldrich | C1022-25G | |
| Aluminum potassium sulfate dodecahydrate, Sigma Ultra | Sigma-Aldrich | A7210-500G | |
| Automation wash buffer, 20X | Biocare Medical | TWB945 |
References
- Rudel, R. A., Fenton, S. E., Ackerman, J. M., Euling, S. Y., Makris, S. L. Environmental exposures and mammary gland development: State of the science, public health, implications, and research recommendations. Environ Health Perspect. 119 (8), 1053-1061 (2011).
- Keenan, K. P., Wallig, M. A., Hascheck, W. M. Nature via Nurture: Effect of Diet on Health, Obesity, and Safety Assessment. Toxicol Pathol. 41 (2), 190-209 (2013).
- Stanko, J. P., Fenton, S. E. Quantifying branching density in rat mammary gland whole mounts using the Sholl analysis method. J Vis Exp. , (2017).
- Filgo, A. J., et al. Mammary gland evaluation in juvenile toxicity studies: Temporal developmental patterns in the male and female Harlan Sprague Dawley Rat. Toxicol Pathol. 44 (7), 1034-1058 (2016).
- Tucker, D. K., Foley, J. K., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. Preparation of high-quality hematoxylin and eosin-stained sections from rodent mammary gland whole mounts for histopathologic review. Toxicol Pathol. 44 (7), 1059-1064 (2016).
- Hvid, H., Thorup, O., Oleksiewicz, M. B., Sjogren, I., Jensen, H. E. An alternative method for preparation of tissue sections from the rat mammary gland. Exp Toxicol Path. 63 (4), 317-324 (2011).
- Munoz-de-Toro, M., et al. Perinatal exposure to bisphenol-A alters peripubertal mammary gland development in mice. Endocrinology. 146 (9), 4138-4147 (2005).
- Padilla-Banks, E., Jefferson, W. N., Newbold, R. Neonatal exposure to the phytoestrogen genistein alters mammary gland growth and developmental programming of hormone receptor levels. Endocrinology. 147 (10), 4871-4882 (2006).
- Nikaido, Y., et al. Effects of maternal xenotestrogen exposure on development of the reproductive tract and mammary gland in female CD-1 mouse offspring. Reprod Toxicol. 18 (6), 803-811 (2004).
